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小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇发表在《Nature Communications》上的文章，题目是“FGF2 alters macrophage polarization, tumour immunity and growth and can be targeted during radiotherapy”，这本老牌的Nature子刊影响因子一直稳中求进：15.974。本篇范文总体的研究意义就在于说明FGF2作为肿瘤微环境中免疫的关键调节因子，影响巨噬细胞编程。那么，我们今天就来看看如何设计一篇完整的肿瘤微环境中巨噬细胞相关的研究吧~
肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)具有促癌和抗致瘤的双重功能。研究的主变量是一种血管生长因子FGF2，作者即针对肿瘤微环境中的FGF2可能调控巨噬细胞分化与肿瘤免疫这一科学问题展开研究。研究发现与WT TAMs相比，来自FGF2lmw−/−小鼠的TAMs表达了许多特征性的促炎细胞因子和标记物，而FGF2lmw−/−BMDM则在一定程度上抑制肿瘤生长。这种抑制作用与免疫正常小鼠T细胞浸润增强有关，在免疫抑制小鼠中也很明显。这强化了就这样一个概念，即FGF2通过改变TAMs介导肿瘤生长，既依赖于适应性，也不依赖于适应性免疫力。此外，肿瘤微环境中的其他细胞类型，如成纤维细胞也可能受到FGF2lmw−/−基因型的影响，而TAMs表型的改变会包括间接影响。但在作者的研究中没有发现FGF2作为癌细胞自分泌生长因子的证据。
此外，巨噬细胞影响肿瘤血管生成，FGF2当然可能直接影响血管生成，但也可能通过巨噬细胞的重新编程来间接影响血管生成。在作者的研究中，阻断FGF2或缺失FGF2对放疗前后的肿瘤血管密度没有普遍的影响。照射后，免疫活性和免疫抑制小鼠的肿瘤生长均受到抑制。抗FGF2抗体的附加效应程度与肿瘤对辐射的单独反应程度相关。并且研究发现肿瘤细胞可以在BMDM中诱导FGFR1和2的表达。此外，在体内照射后，肿瘤微环境中的FGF2水平升高。总的来说，这些发现表明肿瘤微环境中的TAMs可以与受辐射的肿瘤微环境中的FGF2结合，导致重编程以产生更容易致瘤的环境。同时TAMs可以以免疫依赖和独立的方式促进肿瘤生长。
一、表型验证
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宿主FGF2基因消除导致肿瘤退化
图1
为了探究是否会像抑制抗FGF2抗体那样抑制肝转移，作者检测了FGF2LMW - / -小鼠肝转移的生长。脾内注射小鼠CRC细胞株MC38或胰腺癌细胞株KPC成WT或注射了MC38和KPC细胞的FGF2LMW−/−小鼠的肝脏肿瘤负担明显减轻，相比之下，注射了MC38和KPC细胞的FGF2LMW−/−小鼠的肝脏肿瘤负担明显减轻(图1a)。组织学分析显示，FGF2LMW−/−小鼠的免疫浸润增加，特别是在转移肝边界(箭头，图1b)。皮下注射后，图1c-f的生存曲线显示WT小鼠的MC38和KPC肿瘤在第21天达到终点，而FGF2LMW−/−小鼠组则大多显示在第120天达到终点。皮下肿瘤在FGF2LMW−/−小鼠的免疫浸润增加(图1g)。与肝转移模型相似，提示FGF2lmwm可能介导肿瘤免疫。
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FGF2的缺失导致肿瘤中T细胞的聚集
为了研究肿瘤中的免疫浸润，作者在接种后第10天采集免疫细胞，通过流式细胞术分析FGF2LMW−/−小鼠的CD4+和CD8+T细胞比例增加(图1h)。免疫组化证实，皮下肿瘤和肝脏转移瘤FGF2LMW−/−小鼠的T细胞(CD3+细胞，包括CD4和CD8)浸润增加，并向肿瘤细胞簇扩展(图1i)。这些数据表明在肿瘤中，在FGF2LMW−/−小鼠的炎症谱系发生了转变。此外，FGF2LMWled的缺失会改变CD4+和CD8+T细胞中细胞因子的表达。从FGF2LMW - / -小鼠肿瘤组织分离的CD4+和CD8+T细胞与从WT小鼠分离的T细胞相比，其RNA表达被膜6、IL12和IL17增加。CD4+T细胞也增加，edifn γ和CD8+ T细胞IL13增加。两者的增殖标志物ki67表达增强(图1k)。因此，在FGF2LMW-/-小鼠肿瘤中，CD4+和CD8+T细胞都显示出激活和增殖增加的迹象。
二、T细胞在促肿瘤恶性表型中的机制研究
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巨噬细胞与肿瘤细胞相互作用后表达FGF受体
图2
巨噬细胞是肿瘤中可能直接对FGF2产生反应的主要免疫细胞亚型。作者重点分析了肿瘤细胞是否可以直接影响巨噬细胞的FGFR表达。尽管T细胞参与了肿瘤消退，但研究未能在T细胞或其他免疫细胞类型上检测到FGFR。超过85%的TAMs表达FGFR1，约65%表达FGFR2。来自naïve脾脏的髓系细胞中，少于5%的细胞表达这两种受体(图2a-c)。肿瘤细胞被辐照后会增加FGFR1的表达 (Fig.2d-f)。随后分析使用LPS是否可以诱导巨噬细胞极化。LPS作为M1和IL4的经典刺激因子，M2极化刺激因子可诱导FGFR表达，LPS诱导BMDM中FGFR1和2的表达，而IL4仅诱导FGFR1(图2g)。因此，肿瘤细胞可以影响巨噬细胞诱导FGFR表达。
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TAMs是肿瘤中FGF2的主要来源
图3
为了确定FGF2的来源，作者对分离自肿瘤细胞的FGF2进行了流式细胞术分析。巨噬细胞大量表达FGF2 (83.3%)， MDSCs或粒细胞较少表达FGF2，分别为9.7%和29.9%。相比之下，FGF2在<4%的T细胞中表达，且只有MC38表达FGF2，这比来自TAMs的数量少了几百倍(图3a-b)。
接下来作者做了一部分生信分析，为了进一步评估FGF2在癌症中的表达，使用GSEA方法分析了FGF2表达与免疫亚群标记物的关系。根据基因表达特征，巨噬细胞和粒细胞丰富型肿瘤与FGF2表达增加相关，而CD8+T细胞、CD4+T细胞、Th1细胞和Th2细胞无相关性(图3c)。这些数据与小鼠研究一致，小鼠研究发现骨髓细胞是FGF2LMW4的主要来源。
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TAMs在FGF2肿瘤中向炎性(M1)表型极化
图4
有相关报道证实在TAM数目不变的情况下，TAM极化的改变会对肿瘤的生长产生深远的影响。因此，作者通过流式细胞术分选分析FGF2LMW−/−小鼠的TAM极化，在两种基因型中均有超过90%的CD206表达，说明了巨噬细胞极化的复杂性(图4a)。然后，在肿瘤细胞接种10天后再次分析，发现与WT小鼠相比，从FGF2lmw - / -小鼠中分离的TAMs M1或炎症标志物显著增加，同时也降低了M2标记物Ym1andYm2的表达(图4b)。并且作者分析了在没有刺激的情况下，与WT BMDM相比，FGF2LMW−/−BMDM具有更高水平的促炎细胞因子Cxcl1、IL1β、IL6和tnfα，但M2标记物ym2表达较少。LPS刺激后也显示同样的结果(图4c)。虽然组织培养的结果并不完全复制体内的表达模式，但这些实验表明，FGF2改变了TAMs的表型，并可能是允许巨噬细胞产生促肿瘤反应的关键。
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BMDM延缓肿瘤生长
图5
皮下注射BMDM与MC38细胞并不能改变肿瘤的生长速度。然而，注射前将BMDM细胞与MC38细胞共培养，导致肿瘤生长显著且持续增加(图5a)。并且，BMDM与肿瘤细胞共培养后，BMDM中iNOS、CD206、IL1α、IL1β、IL6和TGFβ的表达增加(图5b)。为了确定BMDM中的FGF2是否影响肿瘤生长，作者将肿瘤细胞与WT及FGF2lmw−/−BMDM共皮下注射。作者使用两种不同比例的肿瘤细胞和BMDM来检查剂量反应。WT BMDM细胞在1:1或1:4的比例下对肿瘤生长没有影响，相反FGF2LMW−/−BMDM与肿瘤细胞共注射则以剂量依赖的方式延缓肿瘤生长(图5c-d)。由此可知，巨噬细胞的基因型和调节作用影响肿瘤生长。
为了进一步了解这些巨噬细胞对免疫浸润的影响，作者收集了接种后14天的皮下肿瘤，分析肿瘤浸润情况。与对照组相比，与FGF2lmw−/−BMDM共注射导致CD8+ T细胞比例增加，而与WT BMDM共注射没有改变肿瘤浸润(图5e)。为了评估适应性免疫反应的作用，作者在缺乏成熟T细胞和B细胞的免疫缺陷SCID小鼠中进行验证，结果一致(图5f)。表明FGF2LMW−/−BMDM导致的肿瘤生长延迟部分独立于T细胞。
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FGF2和对放射治疗的反应
图6
图6a-b显示，在分级辐射后，所有3个肿瘤模型的FGF2表达均增加。免疫组化也验证了这一结果，即与未受照射肿瘤相比，受照射肿瘤中的MC38 FGF2染色强度增加，且在照射后整体FGF2染色增加较少 (图6c-d)。MC38肿瘤各组均未显示肿瘤细胞或巨噬细胞的任何FGF2染色，进一步表明肿瘤细胞对MC38细胞的FGF2影响极小(图6e)。
三、生存分析
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阻断FGF2可提高放疗后的生存率
图7
研究发现在WT和FGF2lmw - / -小鼠中没有看到免疫排斥反应，甚至肿瘤生长的差异。然后作者用这些肿瘤来检查放射治疗的反应。与WT小鼠相比，FGF2LMW−/−小鼠对辐射的反应更灵敏，治愈率更高(图7a)。接下来阻断FGF2观察肿瘤对放疗的反应，结果一致。随后，作者在免疫抑制小鼠中使用了来自SW1222细胞的辐射敏感肿瘤和更耐药的HT29细胞系，并给予上述相同剂量的辐射。在这两种情况下，抗FGF2抗体对未辐照小鼠的肿瘤生长没有影响。然而，加入抗FGF2阻断抗体后，辐照效果显著增强(图7c-d)。
随后，作者有补充实验，在FGF2上添加抗体或FGFr抑制剂(BGJ398)，发现并不会降低放疗后的细胞活力、增殖或克隆生存(补充图6、7a-b)。由此证明了FGF2是否可以介导的自分泌生长因子效应。因此，虽然抗血管生成作用可能发挥作用，但这种作用还不能普遍适用的。
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照射和抗FGF2抗体联合治疗促进TAM极化
图8
作者发现受照射的肿瘤中CD11b+F4/80+TAMs的比例高于对照组，但没有发现改变照射后CD11b+F4/80+细胞的增加(图8a-c)。抗FGF2抗体虽然不影响TAMs的比例，但对照射后巨噬细胞的极化有显著影响。然而，放疗和抗FGF2抗体的联合治疗持续导致iNOS+/CD206+巨噬细胞比例增加(图8d-f)。虽然MC38细胞在同基因小鼠中进行了测试，但辐射和抗FGF2抗体的结合也有效地延长了SW1222和HT29皮下肿瘤免疫抑制小鼠的生存期。因此，阻断FGF2导致TAM向M1谱极化的改变，并与放疗后预后良好相关。
总结一下研究套路，范文总体研究了FGF2在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的编程调节控制肿瘤生长和抗肿瘤免疫这一调控中的作用，低分子量FGF2基因缺陷小鼠的肿瘤依赖于T细胞回归。研究首次表明，FGF2影响巨噬细胞编程，是肿瘤微环境中免疫的关键调节因子。作者的工作表明，巨噬细胞极化可能是推动延迟肿瘤生长和肿瘤消退的一个成分，inFGF2LMW - / -小鼠。这也表明肿瘤微环境中的FGF2是巨噬细胞分化的重要调节因子，特别是在放疗期间。由此表明影响TAM分化的因素可能作为新的治疗策略。研究表明FGF262引导的白细胞募集增强和自身免疫性关节炎的促进均提示可能有巨噬细胞参与。这表明FGF2具有介导炎症的能力。本项研究同时提出了关于对成纤维细胞、其他细胞类型和其他更复杂的间接作用的影响的更多问题。总的来说，本篇范文的研究结果将FGF2定义为肿瘤中巨噬细胞极化的关键调节因子，并证明FGF2以及其他调节巨噬细胞活性的因子可以在放疗期间被靶向。
好了，这篇高分文献就解读到这里了，下期再见了，拜拜！
参考文献
[1] Liu S, Sun Y, Hou Y, Yang L, Wan X, Qin Y, Liu Y, Wang R, Zhu P, Teng Y, Liu M. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 2021 Oct 29;14(1):178. doi: 10.1186/s13045-021-01194-z. PMID: 34715882; PMCID: PMC8555326.
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撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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