今年国自然的模板套路！10+单基因干湿结合SCI，你的不二性价比之选！
如何将单基因生信分析成为10分+直接机制研究的敲门砖
小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇于2021年10月发表在《J Hematol Oncol》上的文章，题目是“A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties”，影响因子：17.388。这本期刊今年的影响因子也是飞速飙升~本篇范文是通过对新分子——lncRNA ropm介导的脂质代谢支配着乳腺癌干细胞的特性。下面我们就一起来学习这篇文章吧！
本篇范文是围绕癌症干细胞（CSCs）这是一种具有自我更新能力的肿瘤细胞亚群，在肿瘤起始阶段和维持肿瘤生长能力。对于肿瘤发生，发展，复发，转移和化疗耐药等方面均起到关键作用。作者研究了在乳腺癌中，维持CSC特征的机制。其中也涉及到了Warburg效应在代谢重编程中由肿瘤细胞改变代谢模式潜在机制。
在作者的前期研究工作中，已经分析在在乳腺CSC和非CSC之间差异的特异性lncRNA由此发现了本篇范文中的主变量，为代谢相关的lncRNA——lncROPM（磷脂代谢的调节剂），被预测靶向磷脂代谢相关的PLA2G16（XVI组磷脂酶A2）。然而，文献中尚未报道PLA2G16是否通过改变脂质代谢途径促进肿瘤进展，以及PLA2G16在CSC中的功能。
在本项研究中，作者通过生信分析鉴定乳腺癌细胞（BCSCs）中的新型lncROPM（磷脂代谢调节剂），并通过qRT-PCR验证乳腺癌细胞和组织的BCSCs。在两个乳腺癌队列和TANRIC数据库（TCGA-BRCA，RNAseq数据）中评估lncROPM的临床意义。接下来是体外和体内的机制分析，表型验证是通过进行功能获得和功能丧失实验完成的，由此确定了lncROPM在对BCSC的作用。lncROPM的调控机制探讨上，通过生物信息学，RNA FISH，RNA pull-down，荧光素酶报告基因检测和放线菌素D处理研究。随后，通过UHPLC-QTOFMS系统确定PLA2G16介导的磷脂代谢。通过CCK8测定评估细胞的化学敏感性。结果发现LncROPM在BCSCs中高表达，与乳腺癌患者的恶性程度/分期和预后不良呈正相关。并且lncROPM通过直接结合PLA2G16的3'-UTR来调节PLA2G16表达以增加mRNA稳定性。PLA2G16的过表达显着促进磷脂代谢和BCSCs中游离脂肪酸的产生，从而激活PI3K/AKT，Wnt/β-连环蛋白和Hippo/YAP信号传导，最终参与BCSCs干性的维持。加药后的rescue试验可以有效地逆转BCSC和肿瘤发生。
一、主变量的表达差异
图1
图1为主变量在疾病中的表达差异。图1A的聚类热图表明BCSCs和非BCSCs之间的表达差异，lncROPM在BCSCs中高表达。图1B为代谢途径相关的lncRNA的热图。
接下来，图1C展示了作者通过qRT-PCR分析lncROPM在所有BCSC和非BCSC中均有表达，BCSC较非BCSC中的lncROPM表达高。体外Transwell小室试验验证与亲代细胞相比，lncROPM在这些侵袭细胞中高度表达。此外，图1D-E为RNA荧光原位杂交（FISH）和亚细胞分级实验均显示lncROPM主要存在于BCSC的细胞质中。
二、主变量调节表型
图2
图2验证了 LncROPM是一种致癌基因，与乳腺癌患者的临床特征和干性相关。为了进一步确定lncROPM在乳腺癌中的临床意义，图2A为联合TCGA-BRCA数据库的生信分析，lncROPM在死于乳腺癌（n=120）并从中存活（n=705）的患者中的表达。图2B-C为TCGA-BRCA数据库评估高、低lncROPM表达组间的乳腺癌患者3年无病生存期和无进展生存期的Kaplan-Meier生存曲线，lncROPM高表达与患者预后不良显着相关。图2D-E为lncROPM表达水平的无病生存期和无进展生存期生存分析，lncROPM在接受治疗的三阴性乳腺癌患者中与NF-κB信号通路密切相关。图2F为50对乳腺癌组织和邻近正常组织中的lncROPM表达差异。图2G为乳腺癌组织中的荧光染色：DAPI（蓝色），lncROPM（红色）。图2H-I为130个乳腺癌组织中lncROPM和SOX2及OCT4表达之间的相关性。图2J来自不同乳腺肿瘤等级样品的非BCSC和BCSC中lncROPM的差异。图2K为乳腺癌化学敏感组织（n=30）和化学抗性组织（n=30）中lncROPM的表达差异。
图3
图3为LncROPM维持BCSCs特性的rescue试验。图3A-B通过shCtrl，shROPM-1和shROPM-2shRNA，以及对照慢病毒（LEV）和lncROPM过表达的慢病毒（LV-ROPM）转染的非BCSC和BCSC，验证lncROPM的表达差异。图3C-E为以上分组的代表性beads图像。图3D-F为球囊形成效率验证。图3G-I分别为体外有限稀释测定法检测lncROPM缺陷型BCSCs，lncROPM过表达的非BCSCs及其对照细胞中干细胞的频率。图3H-J将来自BT549的LncROPM沉默的CSC和LncROPM过表达的非CSC稀释，并皮下植入BALB/c裸鼠及其对照细胞中的验证。总之，这些数据表明lncROPM有助于BCSC特性。
三、因变量调节表型
图4
由上面的研究结果可知，LncRNA在控制基因表达中起重要作用。为了研究lncROPM调节BCSCs特性的潜在机制，作者采用生物信息学分析和qRT-PCR实验预测lncROPM的潜在靶基因。
PLA2G16是lncROPM的靶标，是因变量。图4分析了PLA2G16与乳腺癌的发展和化疗耐药有关。图4A-B用shCtrl或shROPM转染的BCSC或用LEV和LV-ROPM慢病毒转染的非BCSC，验证PLA2G16的表达差异。图4C-D为对应的Western印迹分析。图4E为来自作者数据的130个乳腺癌样品中lncROPM和PLA2G16表达的相关分析。图4F为PLA2G16在乳腺癌组织中的代表性IHC图像。图4G为乳腺癌化学敏感组织（n=30）和化学抗性组织（n=30）中PLA2G16的表达差异，及PLA2G16在组织中的代表性IHC图像。图4H为联合GEO数据库（GSE22513）的生信分析。验证PLA2G16在中对新辅助紫杉醇/放射治疗的病理完全缓解（pCR）和部分缓解（pPR）患者的乳腺肿瘤样本中的表达差异。这些数据支持PLA2G16是lncROPM的关键目标，并有助于乳腺癌的发展和化疗耐药。
四、直接机制
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结合位点验证
图5
lncRNA的机制在很大程度上取决于它们的细胞内位置。图5则进入了直接机制的研究，也就是位点结合。验证了 LncROPM与PLA2G16 mRNA的3'UTR结合以增强PLA2G16 mRNA稳定性。图5A-B为在shCtrl转染的MCF7 BCSC和BT549 CSC中，PLA2G16的mRNA前体（intron1，intron2，intron3）和成熟mRNA（3'-UTR，CDS和5'-UTR）表达的qRT-PCR分析。图5C通过RNA pull-down试验，检测MCF7和BT549 BCSC中PLA2G16 3'-UTR的相对富集，并通过qRT-PCR评估mRNA水平。图5D 展示了PLA2G16 3'-UTR分为两部分。图5E-F为在shCtrl、shROPM转染的BCSC和用LEV和LV-ROPM的非BCSC中，测定含有PLA2G16 3'-UTR不同区域的载体的荧光素酶活性。图5G为用lncROPM不同片段的质粒和含有PLA2G16-3'-UTR-1的荧光素酶报告基因共转染的293T细胞中测量荧光素酶活性。图5H-I分别不同时间点上，用放线菌素处理具有shCtrl或shROPM转染的的BCSC和具有源自MCF7和Hs578T的LEV或LV-ROPM的非BCSC两组，qRT-PCR检测PLA2G16的mRNA半衰期。总之，lncROPM与PLA2G16 mRNA的3'-UTR结合以增强其mRNA稳定性。
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主变量经由因变量调节表型
图6
为了解PLA2G16是否调节BCSC特征，作者首先通过qRT-PCR和western印迹分析评估了PLA2G16在源自乳腺癌细胞和临床肿瘤的BCSC和非BCSC中的表达。图6验证了PLA2G16在lncROPM驱动的BCSCs表型中的形成至关重要。图6A-B分别为来自乳腺癌细胞和临床乳腺癌样品的非BCSC和BCSC中PLA2G16表达的qRT-PCR分析。图6C为对应的 Western，检测来自BT549，MCF7和临床样品的非BCSC和BCSC中的PLA2G16蛋白水平。图6D-F为shPLA2G16-1，shPLA2G16-2转染或用Giripladib（300nM）处理后，每代BCSC及其对照的代表性球囊图像和球囊形成效率。图6E-G为LEV和LV-PLA2G16慢病毒转染的非BCSC的代表性球囊图像和球囊形成效率。图6H为将异位PLA2G16及对照载体转染到lncROPM沉默的BCSC中，通过悬浮培养评估球囊形成能力，展示了代表性的球囊图像（上图）和球囊形成效率（下图）。图6I为通过悬浮培养评估具有异位lncROPM的非BCSC的球囊形成能力。同样为代表性的球囊图像（上图）和球囊形成效率（下图）。这些结果证明了lncROPM通过上调PLA2G16对BCSC的功能。
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直接机制的回复验证
图7
图7为PLA2G16介导的磷脂代谢和代谢物花生四烯酸（AA）涉及LncROPM驱动的BCSC维持。图7A-B分别为有或没有lncROPM，以及BCSCs或非BCSC的中改变的脂质种类中，有或没有异位lncROPM。图7C-D为lncROPM沉默的BCSCs组，或表达异位lncROPM的非BCSCs中Top 5中FFA改变的情况。图7E为shRNA敲低MCF-7 BCSC中的PLA2G16或用Giripladib（300nM）预处理后，在这些BCSC及其对照BCSC中测量AA的含量。图7F-G为用或不用LV-ROPM转染的MCF7非CSC中的AA含量，以及来自MCF7和BT549细胞的非BCSC和BCSC中的AA含量。为了进一步验证其在BCSC上的AA功能，将外源AA应用于BCSC性质分析，同样为了确定shCtrl组中的干性相关蛋白（SOX2，OCT4和KLF4），图7H验证了AA处理可以回复由BCSC中的sh-lncROPM或shPLA2G16引起的抑制的干性相关基因（例如Sox2，Oct4和Klf4）表达和球囊形成效率。
图8
图8为联合临床治疗药物是否能有效回复疾病表型。图8A-D将指定的BCSC或非BCSC细胞用设计的他莫昔芬（A，C）或多柔比星（B，D）处理48小时，通过CCK-8测定法测量细胞活力。图8E为乳腺癌耐药细胞及其亲代细胞BCSCs中lncROPM和PLA2G16的表达量。图8F-G为来使用DMSO，他莫昔芬，Giripladib，他莫昔芬+Giripladib或用DMSO，多柔比星，Giripladib或多柔比星+Giripladib处理的Hs578T处理的MCF7的BCSC的球囊和球囊形成效率。图8H为每组异种移植肿瘤体积大小。图8J为在每个异种移植肿瘤组中KLF4的IHC染色情况。总之，这些数据表明lncROPM，PLA2G16和AA有助于BCSCs的耐药性，并且Giripladib与化学治疗药物协同作用可以通过抑制PLA2G16活性有效地消除BCSC。
本篇范文的主变量为新分子lncROPM，它在BCSCs中高表达，通过靶向PLA2G16的表达调节磷脂代谢，参与BCSCs的更新，干细胞和耐药性。联合TCGA-BRCA数据库分析了lncROPM在乳腺癌患者RNAseq及在临床标本中的表达，发现lncROPM与乳腺癌患者的肿瘤恶性，复发，化疗耐药和预后不良显着相关。随后的RNA-FISH和亚细胞分级测试显示lncROPM主要分布在BCSCs的细胞质中，促使lncROPM可能通过调节多核糖体组分，控制mRNA稳定性或参与翻译相关活动来影响PLA2G16的表达。结果证明lncROPM可以通过与其3'-UTR区域结合来增强PLA2G16 mRNA稳定性。
接下来是机制探讨，这里作者是“干湿结合”为了PLA2G16是否可以通过影响肿瘤中的磷脂代谢来促进肿瘤进展，作者首先验证了PLA2G16在BCSCs中过表达，证实其有助于肿瘤干细胞的自我更新能力，干细胞标志物表达和耐药性。联合GEO数据库的分析显示PLA2G16在小家鼠胚胎干细胞，常驻肝干细胞和智人未分化胚胎干细胞中也高表达。由此，PLA2G16可用作定义BCSC的新分子标记，甚至可用于定义其他组织中的干细胞。值得注意的是，在我们的研究中，临床研究表明PLA2G16的表达与患者的乳腺癌恶性，复发，化疗耐药和预后不良显着相关，提示PLA2G16是根除BCSCs和改善预后不良的有用治疗靶点。
总体而言，在这项研究中作者首先通过观察到BCSCs中花生四烯酸（AA）的含量发生了显着变化，并检测了PI3K/AKT，Wnt/β-连环蛋白和Hippo/YAP信号通路的激活。随后分析了“分子+通路”促进BCSCs自我更新，干性，化学抗性的机制。
好了，这篇近20分的单基因套路生信高分文献就解读到这里了，后台回复“1217”获取范文一起学习吧。如果你对这样的学习方式感兴趣，或者有什么意见或建议，请在下方留言~我们下期再见吧，拜拜！
参考文献
[1] Paré L, Pascual T, Seguí E, etal. Association between PD1 mRNA and response to anti-PD1 monotherapy across multiple cancer types. Ann Oncol. 2018 Oct 1;29(10):2121-2128. doi: 10.1093/annonc/mdy335. PMID: 30165419.
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撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
主编丨小雪球
关键词
乳腺癌患者
肿瘤
基因
干细胞
患者
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