真的太秀了！这个10分+外显子生信套路，教你如何平平无奇中弯道超车！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。今天带给大家的是一篇全外显子测序的生信分析套路，于2021年1月发表在《Clin Cancer Res》上，题目是“Whole Exome Sequencing in Penile Squamous Cell Carcinoma Uncovers Novel Prognostic Categorization and Drug Targets with Similarity to Head and Neck Squamous Cell Carcinoma”。感谢作者提供了很好的学习典范！

期刊简介

“挑圈联靠”题目要素拆解

疾病：Head and Neck Squamous Cell Carcinoma；

目的基因：未涉及；

数据来源：全外显子测序；

机制：未涉及；

研究目的（文章类型）：新型预后分类和药物靶点类型文章。

知识背景

本篇范文研究了一个较为罕见的癌种——阴茎鳞状细胞癌(PSCC)在美国每年约有2000例新发病例和400例死亡。而在全世界发展中国家，PSCC的发病率明显较高。这个癌种也涉及到了人类乳头瘤病毒(HPV)，为全球约30-50% PSCC病例的病因。目前对局部晚期PSCC病的治疗方法是以铂类为基础的化疗，辅以手术巩固。但大多数患者会出现疾病进展或复发。一线化疗后复发的PSCC生存率较差，mOS大约为5个月，治疗方案非常有限。因此，确定与PSCC复发、进展相关的分子靶点和潜在的药物开发非常重要。目前关于PSCC基因组景观受到小样本量，有限的HPV阳性病例以及异质分子检测方法等诸多限制，无法提供很好的证据。先前的研究发现这种罕见的癌的两种不同途径，一种是与人乳头状瘤病毒相关的，另一种是不与其相关的。此外，在复发性PSCC中中只有少数如TP53、CDKN2A和PIK3C已知的肿瘤抑制基因的点突变被报道。作者由此出发，通过生信挖掘对其生物学进行更深入的了解。并且通过查阅相关研究报道得知，其他研究已经发现了来自不同解剖部位的鳞状细胞癌之间分子趋同的有力证据，但是这还没有在PSCC进行探索。由此，在这项研究中作者进行了迄今为止最大的相关全基因组分析，以探索这种罕见癌症的遗传学。

数据来源 & 思路框架

作者在这项研究种选择了从德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心(UT MDACC)组织库中前瞻性收集的34对PSCC和匹配的正常阴茎组织样本作为PSCC队列。并且其中大多数肿瘤是在接受化疗(9/10)之前收集的。然后就是免疫组化评估HPV状态。接下来，作者对PSCC全外显子组进行分析，通过评估每条染色体中的事件间距离来评估超突变基因组区域。基因组区域显示6个或更多连续事件，平均突变间距离为1000个碱基对，被认为是超突变。作者还评估了10种致癌信号通路，包括RTK/RAS通路；Wnt通路；Notch通路；Hippo通路；PI3K途径；细胞周期途径；Myc途径；TGF-β途径；p53途径；和Nrf2途径)在作者的PSCC样本中的表达。随后，通过基因-药物互作数据库——DGIdb数据库中的数据来进行基因和药性的评估。这项研究确定了新的药物靶点，以及PSCC和HNSC突变特征的相似性，具有潜在的临床意义。

对于阴茎鳞状细胞癌(PSCC)这种罕见的致命癌症，寻找新的分子靶点用于改善患者预后的预测及确定新的治疗靶点都是非常有必要的。并且相对于常见的癌症来说，这种小癌种研究的更少，是生物信息学发挥专长的绝佳方向呀！且与大多数常规生信文章思路不同的是，本篇范文目的在于评估PSCC和其他鳞状细胞肿瘤之间的相似性，用生信探索小癌种，去往常规癌症病理类型的大方向上靠，真的可谓是一种非常不错的创新思路！因此，这也是菠小萝为大家力荐这篇范文的原因呢~言归正传，本篇范文中作者介绍了如何将PSCC与头颈部鳞状细胞癌(HNSC)相联系，并在分子和组织学上探索相似性，特别是涉及Notch途径，这表明来自更大的HNSC患者群体的临床发展可能有助于加快向PSCC人群的转化。于是，作者将PSCC与其他鳞状细胞相比较，为PSCC具有预后意义的不同分子亚型在HNSC最为相似提供了新的证据，并为研究PSCC的分子靶向策略提供了基础，并表明在PSCC和HNSC使用分子特异性试验进行药物开发研究的潜力。

数据精析

PSCC队列

首先，作者对34个未经处理的原始PSCC标本和相应的匹配正常阴茎组织样本进行全外显子组测序。并描述了这些患者的基本信息及临床特征。

PSCC的体细胞突变景观和丰富的突变模式

（1）“挑”——差异分析

接下来，直接步入正题，直接探讨肿瘤样本和正常样本中的突变差异。所有样本中显示了4275个体细胞外显子突变，包括3717个错义，327个无义，1607个沉默，75个剪接位点，95个移码插入和缺失(indel)和61个框内indel。在PSCC样本中发现的全套核苷酸变异体在S2补充表中有描述。在PSCC发现的30种最常见的外显子突变在图1A的癌胚抗原表中有描述。患者的肿瘤突变负荷(TMB)是通过将单核苷酸变异体的总数(SNV)除以WEX测序覆盖的基因组数量(~64兆碱基)来确定的。两个病人(14T和27T)被归类为超突变型(图1B)。突变间距离的分析通过仅在这两个样品中鉴定超突变基因座的区域(平均距离小于或等于1000个碱基对的6个连续突变)进一步证实了这种分类(图1C)。

(图1A-C)

（2）“圈”——富集分析

在通路相关的分析中，Notch途径在PSCC样本中受影响最频繁，其中70.6%的样本(n=24)在17个缺口基因中的至少一个基因中有突变，包括Notch 1 (n=15，44.1%)、EP300 (n=5，14.7%)和FBXW7 (n=5，14.7%)(图1D)。

(图1D)

其他高度受影响的途径是:20例(58.8%)患者中有17个突变基因的Hippo 途径，其中12例(35.3%)出现FAT1突变；16例患者中有22个突变基因，占47.1%，其中HRAS突变3例(8.8%)，NF1突变3例；15例患者中仅有3个突变基因的p53通路(44.1%)，但其中12例(35.3%)有TP53突变；PI3K、细胞周期和Wnt途径在11例(32.3%)患者中发生突变，PIK3CA、CDKN2A (n=10，29.4%)和CHD8 (n=3，8.8%)突变分别是每种途径中最常见的。Nrf2 (n=4，11.7%)、TGF-β (n=3，8.8%)和MYC (n=3，8.8%)在PSCC样本中的富集度较低，在2个以上的样本中没有基因突变。

接下来作者将突变进行富集分析，发现PIK3CA和CDKN2A的突变在特定的蛋白位点显著富集，表明这些可能是PSCC的潜在驱动突变(图S2)。PIK3CA突变p.E545K/G、E542K和E453K都被OncoKB认为是功能增益致癌突变，而CDKN2A突变p.R80X、p.E88X、p . G65fs、p.D108G和p.R115fs被归类为潜在的功能丧失和致癌因素。

(图S2)

作者根据5’端和3’端碱基的单碱基替换频率，对每个患者的突变模式进行了评估，对96种不同的突变类型进行了分类。通过执行共基因分析，在PSCC样本中确定了两种不同的突变模式，作者称之为突变模式1 (MP1)和2 (MP2)(图2A和2B)。图2C描述了每个样品中这两种突变模式的每一种的富集。MP1在9个PSCC样本中最普遍，而MP2在其他25个病例中更普遍。然后将这些突变模式与来自宇宙数据库的已知癌症突变特征进行比较。然后，作者在COSMIC数据库中进行炎症，找到这些特征之间最接近的匹配(图2D)。

(图2A-D)

“联”——联系临床病理

上述突变分析已经做完了，并找到了潜在的通路，下一步作者就是药分析“病因”——HPV病毒。作者接下来对每例样本都进行了个性化的分析，通过分析从上述突变分析及富集的潜在通路的结果相对比，以找到患病的确切病因。

p16免疫高表达是临床认可的宫颈和口咽部肿瘤HPV感染的替代标志物。虽然在大多数PSCC病例中HPV检测和p16染色相关，但是在2个样品(17T和2T)中通过HPV聚合酶链反应检测到HPV，但是IHC检测为p16阴性。对于这样的情况，作者分析认为是检测到无意义CDKN2A突变，这可以解释p16免疫表达的缺失。

然而，病例17T显示了TP53和CASP8突变，这在TCGA数据库的HPV阳性肿瘤中是罕见的。这两个病例是否是由于HPV引起的尚不清楚。HPV检测与ARPP21、CMYA5和RPGRIP1基因突变显著相关(所有突变患者均为HPV+，p = 0.004，p = 0.020，p = 0.020)。P53途径基因(TP53和CHECK2)仅在2例(20%) HPV阳性病例中发生突变，而一半以上(n=13，54.2%)HPV阴性病例在其中一个基因中发生突变(p=0.128)。在HPV阳性的PSCC人群中，无Nrf2途径基因突变。p16免疫表达与CSPG4和TP53显著相关。P53通路基因影响14例p16阴性肿瘤(53.8%)，但只有1例(12.5%) p16阳性(p=0.053)。p16阳性肿瘤中未检测到Nrf2途径突变。20% (n=3)的p53通路突变患者出现局部复发，而在没有p53通路突变的患者中未检测到LR。事实上，所有局部复发病例都发生在TP53突变患者中。虽然局部复发的发生率很低(n=3)，但这些患者中有2例(66.7%)为TGF-β途径突变，且均有Notch途径突变。

Notch途径突变的患者总体存活率呈下降趋势，所有死亡患者(n=5)均为该途径突变患者。另一方面，与在PI3K途径中没有突变的患者相比，在该途径中有突变的患者倾向于改善PFS。1名突变患者(9.1%)出现进展，7名(30.4%)无PI3K途径突变的患者出现进展。

“靠”——临床意义

考虑到突变模式，MP1的富集与较差的总体生存状态显著相关(图2E)。事实上，单变量Cox回归分析显示MP1评分增加与OS降低有关(HR = 10.2 (1.13-92.9))。由于MP1评分因与APOBEC胞苷脱氨酶活性相关的突变特征而高度丰富，作者还探讨了APOBEC在这些样本中得分。高APOBEC评分与死亡率(p=0.009)和有无淋巴结转移(p=0.024)显著相关。通过单变量Cox回归分析发现APOBEC评分增加与总体生存率差显著相关。当样本分为富含APOBEC和非APOBEC时，在富含APOBEC的样本中观察到存活率更差的趋势，尽管没有统计学意义(图2F）。

(图2E-F）

挖掘潜在药物靶点

在PSCC样本中发现的突变基因中，已有11个在DGIdb数据库中被描述为可被已知药物靶向。其中PIK3CA靶向338种药物；TP53靶向193药物；CACNA1C靶向44种药物；CDKN2A靶向31种药物；NOTCH1靶向26种药物；FBXW7靶向11种药物；EP300靶向10种药物；MUC2靶向9种药物；CASP8靶向6药物；LAMA1靶向1种药物；TTN靶向1种药物。从这些药物-基因相互作用来看，其中PI3Kα特异性抑制剂和CDK4/6抑制剂已经成为FDA批准的治疗晚期乳腺癌患者的药物。此外，DNA损伤反应(DDR)基因的有害突变通常与对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂和铂类化疗的反应有关，而BRCA1/2是该途径中描述最充分的基因，其他如ATM、ATR、PALB2等与DDR有关，并在许多癌症中发生突变。这些都是在PSCC中未被探索的。因此作者报告了DDR基因中可能的致病变异体的流行率。

基于Pubmed搜索和NCBI基因和生物系统数据库，作者鉴定了9个与DDR相关的基因(BRCA1/2、ARID1A、ATR、CHEK2、PARP1、FANCA、PALB2、RAD51)。并且能够支持这些结论的数据在8/34 (23.5%)患者中也均有体现，作者共鉴定出26种致病或可能致病的DDR基因变异体。这些变异在以下基因中发现:ARID1AM 2 pts(5.9%)；BRCA2 2例(5.9%)；ATR 2例(5.9%)；CHEK2 2分(5.9%)；PARP1 2分(5.9%)；FANCA 1 pt(2.9%)；PALB2 1 pt (2.9%)和RAD51 1pt (2.9%)。

PSCC与TCGA数据库中其他鳞状细胞癌的比较

这一部分也是文章的重要部分，可以说是比较创新的部分。因为作者并没有直接报告他们所得出的结论，而是到TCGA中去比较相似处和差异。这使得文章的层次更加丰富，且结果更具有说服力。作者在TCGA数据库中比较了PSCC与头颈癌(HNSC) (n = 501)、宫颈癌(CESC) (n = 241)、食道癌(ESCA) (n = 95)、膀胱癌(BLCA) (n = 47)和肺鳞癌(LUSC) (n = 471)的基因组改变，同样使用了全外显子组数据。结果发现PSCC TMB是所有被分析的鳞状细胞肿瘤中最低的，明显低于其他被调查的鳞状细胞癌(图3A)。

考虑到TCGA鳞状细胞癌中平均突变频率最高的30个基因，PSCC队列在其中22个中具有相似的突变频率(73.3%)。PSCC和TCGA鳞状细胞癌队列之间的其他8个差异突变基因是TP53、TTN、CSMD3、RYR2、KMT2D、FAT1、CDKN2A和NOTCH1(图3B)。此外，PSCC还显示了KDM6A、CASP8、LAMA1、DNAH6和MUC2基因的突变，这些突变在大多数TCGA鳞状细胞肿瘤中并不常见(图3B)。

与BLCA、CESC、ESCA和LUSC患者相比，PSCC患者的NOTCH1突变频率增加。同样，FAT1突变体在PSCC比在CESC和ESCA更常见；CDKN2A在PSCC比CESC更频繁，DNAH6在PSCC比HNSC更频繁；CASP8在PSCC比在ESCA和LUSC更常见。TP53、TTN、CSND3、RYR2和KMT2D在PSCC样本中出现的频率明显较低。此外，作者比较了PSCC和鳞状细胞癌队列中DDR (BRCA1，BRCA2，ARID1A，ATR，CHEK2，PARP1，FANCA，PALB2和RAD51)基因的突变频率。与LUSC(116例，24.6%)和BLCA(13例，27.7%)相似，PSCC队列显示了大量突变DDR基因患者(8例，23.5%)。HNSC (n=85，17%)、ESCA (n=13，13.7%)和CESC (n=44，18.3%)队列显示DDR突变患者的数量较低，但没有队列与PSCC队列有显著差异。为了评估PSCC和其他鳞状细胞肿瘤之间的基因组相似性，作者评估了PSCC的 96种突变类型与TCGA鳞状细胞癌队列的频率，并估计了6个鳞状细胞队列中的3种不同突变模式。作者将其命名为Sq-MP1、Sq-MP2和Sq-MP3，并将这些突变模式与COSMIC数据库的特征进行比较。PSCC的样品主要富集在MP2(n=23，67.6%)，其次是MP1(n=8，23.5%)和MP3(n=3，8%)(图3C)。

各组之间每个签名的分布显示了PSCC和LUSC (p<0.0001)、BLCA (p=0.006)和CESC(p<0.0001)组之间的显著差异。然而，在PSCC和HNSC (p=0.208)和ESCA (p=0.387)之间没有观察到显著差异，表明这3个队列之间有相似的突变特征。如前所述，作者通过评估APOBEC突变特征估计，进一步比较了这些队列中的突变背景(图3D)。

PSCC样本与BLCA (p=0.0002)和CESC (p<0.0001)队列显著不同，后者显示出高浓度的APOBEC相关突变。当将PSCC与LUSC、ESCA和HNSC队列进行比较时，没有观察到差异。

(图3)

全文总结

本篇范文在ASCO大学研讨会、AUA全国会议和ASCO征服癌症基金会领导等会议上做过口头报告。这也说明本篇范文所进行研究具有重要的临床价值。虽然作者的样本量并不是很大，但却代表了使用全外显子测序的方法报告的最大的PSCC群体。并且作者还分析了HPV和基因类型的数据。通过对PSCCC基因组学的系统分析，发现Notch信号调控途径与超过一半的PSCC样本有关。这对于未来的临床研究很有意义，因为最近的研究表明，在67%的人类HNSC病例中发现了类似的致癌突变，这些突变基本都在NOTCH信号通路上。因此，NOTCH失活是PSCC和HNSC45的标志。在靶向治疗的时代，像PSCC这样的罕见癌症，可以与其他SCCs一起纳入针对特定共同靶向改变的临床试验。并且本篇范文还能够为使用PI3K/mTOR抑制剂对NOTCH1突变HNSC患者相关的临床试验提供了潜在的理论基础。作者的数据还提供了一些表明PIK3CA和CDKN2A可能是PSCC驱动突变的证据。富集分析表明，PIK3CA和CDKN2A的突变在特定的蛋白位点显著富集。

好啦，今天的分享就到这里啦~总之，小癌种是生信比较好的切入点，最关键的是不容易被抢发。如果有幸能够结合一些临床样本的测序分析等，那绝对可以发个高分文章呀。高效品读文献，才能发表属于自己的高分文章！我是你们的菠小萝，喜欢的话就关注每周六的文献精读栏目吧~

后台回复“外显子测序”获取文献原文哦~作者下周六再见啦，拜拜！

参考文献

[1]Chahoud J, Gleber-Netto FO, McCormick BZ, Rao P, Lu X, Guo M, Morgan MB, Chu RA, Martinez-Ferrer M, Eterovic AK, Pickering CR, Pettaway CA. Whole Exome Sequencing in Penile Squamous Cell Carcinoma Uncovers Novel Prognostic Categorization and Drug Targets Similar to Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Clin Cancer Res. 2021 Jan 13:clincanres.4004.2020. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-20-4004. Epub ahead of print. PMID: 33441293.

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