17分+SCI，只用用TCGA数据库就能搞定？怎么做到的？
领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。感谢作者为作者提供了很好的学习典范！今天带给大家的是一篇套路，于2021年月发表在《Gastroenterology》上，最新影响因子：17.373，题目是“Neutrophils Alter DNA Repair Landscape to Impact Survival and Shape Distinct Therapeutic Phenotypes of Colorectal Cancer”。
本篇范文讲述了一个由中性粒细胞介导的基因修复景观从而影响结直肠癌的生存和不同治疗表型的Story。最值得作者学习的就是整篇文章如何从一个细胞类型入手，又是如何联合TCGA数据库验证的思路。读完这篇推文，我希望大家能够从中了解出色的文章如何利用TCGA数据库验证结果。比如从哪个方向入手，验证哪些数据等，才能将生信发挥到极致~好啦，现在就带着问题一起来学习吧！
疾病：Colorectal Cancer；
数据来源：TCGA；
机制：中性粒细胞改变基因修复景观(Neutrophils Alter DNA Repair Landscape)；
研究目的（文章类型）：Survival and Shape Distinct Therapeutic Phenotypes.
肿瘤浸润中性粒细胞(PMNs)在组织损伤和修复中具有重要作用，关于PMN的募集和组织活性机制尚在研发。并且PMNs是结直肠癌的一个显著特征，它们可以促进细胞毒性或加剧疾病后果。作者前期研究表明，在急性结肠损伤中，PMNs可以增加DNA双链断裂(DSB)负荷，并通过依赖于microRNA的同源重组(HR)修复抑制作用促进基因组不稳定性。以PMNs作为潜在治疗靶点和肿瘤发生的重要因素，关乎着癌症免疫疗法的进展治疗的新标准。许多实体瘤可以通过PMNs发生炎症和浸润；外周循环或肿瘤中的PMN数可用作疾病的预后标志，循环中性粒细胞/淋巴细胞比率(NLR)与化疗的耐药性增加、疾病严重程度和恶化的治疗结果相关。作者在前期已经明确了结肠的损伤会导致上皮细胞的DSB积聚PMN作用的独特的、非活性氧依赖性机制。在炎性结肠粘膜中，发现中性粒细胞通过核膜蛋白层粘连蛋白B1的MiR-23依赖性下调促进复制断裂，并伴随介导miR-155依赖性Rad51下调以抑制HR的DSB修复。这导致DSB积累、复制应激增加和基因组不稳定。
本篇范文中，作者的样本来自人类散发性结直肠癌活检、TCGA数据库、肿瘤异种移植和鼠结直肠癌模型。以及关键DSB修复因子的小分子抑制剂，是用于研究DSB修复景观的变化，及验证有/无肿瘤浸润的PMNs的结直肠癌反应。这样酸菜大大总结的分子，细胞，组织，动物，生信层面就都有了！
本篇范文的主旨在于，中性粒细胞是否能够在炎症性结肠微环境中形成影响结直肠癌进展的DSB修复反应，以及对DNA修复靶向治疗的敏感性/耐药性。现在大家先来了解一下作者给出的示意图，绝对能体现初17分+文章的水平，思路清晰，结构规范，内容精简，通俗易懂！
总体来看，作者揭示了嗜中性粒细胞在结直肠癌微环境中发挥双重性作用，即驱动DNA损伤景观和DSBs。结果发现① 中性粒细胞（主变量）通过依赖于miR-155（因变量1）的RAD51（因变量2）下调，促进低级别结直肠癌的HR缺乏（表型1），从而抑制肿瘤生长（表型2）。这是一个三元变量，两两交互的表型嵌套类型文章！再来看图，除了主线结构，作者还发现② 嗜中性粒细胞介导的遗传毒性由于DSBs的积累导致了非同源末端连接的诱导(NHEJ)，使得晚期结直肠癌得以存活和生长。作者的发现确定了一种③ 由PMN诱导的HR缺陷型结直肠癌表型，其特征是RAD51和Ku70的低水平表达，使其易受到PARP1抑制剂诱导。④ 并进一步确定了一种独特的由PMN诱导的HR缺陷型结直肠癌表型，其特征是Ku70和NHEJ的高表达，这可以通过特异性抑制NHEJ来治疗。
简而言之，以上四条途径的最终目的就是说明中性粒细胞通过改变DSB修复，促进了结直肠癌的生存预后！
主变量介导表型（表达差异）
1
肿瘤浸润性嗜中性粒细胞发挥功能双重性——抑制或促进肿瘤的发展
已有报道嗜中性粒细胞通过促进DSB积累介导了结肠上皮的遗传毒性，导致基因组不稳定(GI)。于是，作者对散发性结直肠癌中关键胃肠标记物微核和滞后染色体的PMN频率和丰度进行了相关和定量分析。对1至3级的70例结直肠癌活检进行的表型评分显示，结直肠癌组织中单核细胞和滞后染色体的形成相互关联，两种胃肠标记物与肿瘤内中性粒细胞的存在高度相关(图1A，B)。与组织学分析结果一致，在多囊卵巢综合征和落后染色体的患病率明显更高，高于PMN低结直肠癌组织(图1C)。这些数据表明，PMN的存在与具有明显胃肠特征的癌细胞的积聚有关。
为了明确PMN浸润如何影响结直肠癌的发展，作者使用了人结直肠癌异种移植和鼠AOM/DSS炎症驱动的结直肠癌模型。对于两种模型，荷瘤小鼠被分成如下4个队列；早期与晚期，有/无抗体(Ab)介导的PMNs消融组织/肿瘤浸润(治疗方案如图1D所示)。作者对70例散发性结直肠癌肿瘤微阵列（包括PMNs、MNs和LCh），进行了PMNs和GI标记物、微核和滞后染色体的分析。典型的高能量共焦图像描绘了具有微核(锰，白色)和滞后染色体(LCh，黄色)的肿瘤细胞。以及人结直肠癌中中性粒细胞的浸润程度和低密度脂蛋白的定量，还有人类HCT116肿瘤异种移植物的生长、存活及细胞凋亡[包括/不包括PMN缺失,早期(第2周)和晚期(第8周)HCT116肿瘤异种移植物(n=33 PMN+和26 PMN-早期肿瘤和23 PMN+和19 PMN-晚期肿瘤)](图1E-H)。
细胞调亡分析中，与PMN肿瘤相比早期PMN+中细胞凋亡/死亡的数量显著增加(图1G-I)。同样，在AOM/DSS 模型中，与PMN肿瘤相比，早期低级别PMN+肿瘤的肿瘤缩小，细胞凋亡/死亡显著增加(图1J-N)。相比之下，在两个模型中，晚期PMN+肿瘤(高级)的大小比PMN-肿瘤增加了2倍以上(图1E-F和图1J-K)，PMN+肿瘤的细胞凋亡/死亡显著减少(图1G-I和图1L-N)。因此，中性粒细胞抑制早期肿瘤的发生，但促进晚期肿瘤的存活和生长。最后测试了在早期肿瘤中观察到的新PMN浸润是否能促进细胞毒性。于是，作者将晚期PMN+/-肿瘤细胞体外暴露于活化的中性粒细胞或PMN衍生的上清液，证实PMN肿瘤细胞增殖显著减少，细胞死亡增加-肿瘤重新暴露于中性粒细胞
总体而言，大家要着重抓住在两个模型中都发现了PMNs的显著肿瘤浸润不同肿瘤之间存在差异这条主线。
（图1）
二、主变量经由因变量介导表型
1
中性粒细胞通过MiR-155介导的RAD51下调抑制肿瘤细胞的同源重组
从这里开始就是机制的论证啦~，由于前期作者已经报道过浸润性中性粒细胞通过依赖于抑制miR-155的HR介导的DSB修复，抑制粘膜的愈合。在本项研究中，鉴于PMN活性在早期肿瘤中的抑制作用，会随着肿瘤的进展而Rescue，作者进一步考虑肿瘤浸润性PMNs是否通过抑制HR促进细胞毒性，以及在结直肠癌进展过程中是否保持HR抑制。通过肿瘤异种移植物的PMN浸润伴随着miR-155表达的显著增加(图2A)和其靶基因RAD51在基因和蛋白水平上的丢失(图2B-C），并且随着PMN衰竭而被有效地Rescue。对人类特异性主要转录物miR-155 (hs-pri-miR155，前体miRNA)的进一步分析显示，在有/无PMN存在的肿瘤pri-miR-155和早期与晚期肿瘤中没有诱导。也就是说，miR-155的表达不是以肿瘤细胞自主的方式诱导的。
随后，作者进一步明确了在进展的结直肠癌异种移植物中的HR活性被持续和渐进地抑制(图2D)。表明miR-155/RAD51轴的特异性，miR-21和miR-9的水平，在结直肠癌细胞中高度上调，并通过除了RAD51的表达，并没有随着PMN衰竭而改变(图2A)。在PMN+和PMN-肿瘤中，其他重要的HR调节因子(BRCA1、XRCC2、XRCC3)(图2C)、参与Wnt/β-连环蛋白信号传导的其他关键miR-155靶基因(GSK3 β、CK1 α、JARID2、TCF4)的表达没有差异。
为了确定PMN衍生的miR-155对RAD51下调和HR抑制的特定贡献，CRISPR/Cas9用于特异性删除HCT116结直肠癌细胞中RAD51基因3’UTR区的miR-155结合位点(HCT116-miR-155 Res)。在PMN组小鼠中，早期HCT116-miR-155 Res异种移植物也引起同等程度的PMN浸润，并显示miR-155水平升高(图2E)，类似于WT HCT116异种移植物。然而，与WT PMN+异种移植物相比，PMN+异种移植物中RAD51的表达(图2F-G)和HR活性(图2H)没有下调。与未受影响的HR活性一致，早期肿瘤中的抗肿瘤PMN效应消失，PMN肿瘤的大小和生存率均下降。出现率显著增加(图2I-J)。
以上发现能够说明了miR-155/RAD51在早期结直肠癌中抑制HR和抑制PMNs致瘤作用的作用。
(图2)
2
中性粒细胞在晚期肿瘤中促进非同源重组依赖性DSB并减少复制应力
作者前期发现通过miR-23a活性的中性粒细胞可以下调LB1的表达，促进复制应激和DSB积累。与PMN肿瘤相比，早期和晚期PMN+肿瘤的表达分析显示miR-23a的诱导和LB1的显著下调。与这些发现一致，早期异种移植PMN+肿瘤的分子分析揭示了pRPA32病灶的募集和形成，表明复制压力升高(图3A、B)。与PMN肿瘤相比，DSB标记物γH2AX与复制PCNA的共定位增加表明PMN早期复制停滞病灶的积聚不足(图3A、C、D)，导致DSB负荷增加(图3A、E)。此外，COMET分析证实两条DNA链的磷酸主链断裂增加，这表明在早期PMN+肿瘤中有DSB的积累(图3F)。
在接下来对高级别PMN+肿瘤的类似分析显示，pRPA32染色质补充、PCNA/ γH2AX病灶和γH2AX病灶明显减弱，表明正在进行的复制压力和相关的DSB负荷被有效地回复，以同化在PMN肿瘤中检测到的水平(图3A-F)。在高级别散发性结直肠癌患者的活检中进一步获得了支持性证据，其中在PMN低肿瘤中检测到更大的DSB负荷，而在PMN高肿瘤中大多数DSB病灶已经被清除(图3G-H)。
(图3)
3
肿瘤浸润性中性粒细胞促进NHEJ介导的DSB修复的上调
已有报道证实53BP1是一种关键的DNA损伤修复蛋白，由于DNA损伤，在染色质重塑位点形成持续的复合物/病灶，表明正在进行DSB修复。53BP1分析结果显示，与PMN异种移植物相比，PMN+早期53BP1阳性病灶数量增加。与早期PMN+和晚期PMN-肿瘤相比，晚期PMN+中每个细胞核53BP1病灶的数量和具有53BP1阳性细胞核的细胞的数量进一步增加(图3I-J)。在人类异种移植和AOM/DSS模型中，NHEJ活性随着PMN+肿瘤的进展而增加(图4A)。相反，NHEJ活性在PMN肿瘤中始终保持在低基础水平，HR活跃。与HR抑制和NHEJ上调一致
分析了人HCT116肿瘤异种移植物在有/无PMN耗竭的早期和晚期肿瘤中NHEJ活性的上调。在PMN+肿瘤中，证实了HR调节器RAD51的瞬时下调和关键NHEJ因子Ku70的诱导(图4B-C)。共聚焦显微镜分析显示PMN+与PMN-晚期肿瘤中Ku70病灶升高和Ku70蛋白水平升高(图4D-E)。这一结果能够将miR-155/RAD51依赖性HR抑制与Ku70和NHEJ的瞬时诱导联系起来。
(图4A-C)
4
肿瘤浸润性中性粒细胞驱动NHEJ的转录重编程
接下来，作者进一步研究NHEJ介导的晚期肿瘤DSB修复的诱导是否伴随着NHEJ转录景观的重新编程。于是，在早期和晚期PMN+ vs PMN-异种移植物和AOM/DSS诱导的肿瘤中，进行了涉及NHEJ途径多个步骤的关键基因的表达谱分析。虽然在早期肿瘤中没有观察到显著的变化，但在PMN+晚期肿瘤中检测到了许多介导NHEJ起始(Ku70/XRCC6，DNA-PKc)、并列和末端切除(Artemis/DCLRE1C，NHEJ1/XLF，MRE11)、末端连接(XRCC4，LIG4)以及NHEJ特异性聚合酶(POL和POL λ)的基因的显著增加，但在PMN-晚期肿瘤中没有。在PMN缺失后的晚期肿瘤中，包括KU80/XRCC5、NBS1、BLM、LIGIII、POL θ和POL β在内的其他几种NHEJ和替代性末端连接(Alt-EJ)修复基因的表达没有改变(图4D-F)。这些数据说明NHEJ特异性基因组在高级别PMN+结直肠癌肿瘤中的激活情况。
总之，这些发现表明在晚期结直肠癌肿瘤中，PMN介导HR抑制后DSB修复景观的转录重编程，并与53BP1重建基因组平衡以促进结直肠癌的生存。
(图4D-F)
三、“靠”——临床意义
1
NHEJ介导的DSB修复在高级别人类结直肠癌中上调
接下来的目标是建立在人类结直肠癌中的发现的临床相关性。为此，我们在低级别与高级别结直肠癌组织中进行了相似的HR与NHEJ同时伴有PMN基因表达谱(图5A)。RAD51的表达在低度和高度肿瘤中都被显著抑制(图5A-B)。相比之下，NHEJ特异性基因组的表达，包括Ku70/XRCC6，但不包括Alt-EJ相关基因(图4F)，在3级结直肠癌或癌旁组织中被高度诱导，但在1级结直肠癌或癌旁组织中不被诱导(图5A、C)。
然后就到了生信层面的验证。作者主要运用了TCGA数据库的表达矩阵和临床信息，对594名结肠直肠腺癌患者的癌症基因组图谱(TCGA)数据集的进一步挖掘揭示了PMN基因和RAD51的显著负相关(图5D)，支持PMNs下调RAD51并改变DSB修复景观的观点。然而，对散发性结直肠癌组织活检(1级、2级和3级)中Ku70病灶(表明NHEJ活化)的患病率的评估显示，健康组织中DSB相关Ku70病灶的数量较低但是作为肿瘤等级的函数而显著增加(图5E-F)。NHEJ上调和Ku70病灶的增加与DSB负荷的显著减少相关(图5E，G)。59例结直肠癌患者活检中，Ku70和成对的γH2AX病灶阳性细胞分布的活动热图进一步说明了这种相反的模式(图5H)。相关性分析显示，Ku70病灶形成的丰度与肿瘤分级呈显著正相关，与γH2AX病灶呈负相关(图5I)。
总之，基于TCGA数据库的验证结果表明，NHEJ上调对DSB分辨率和人类结直肠癌预后较好有关。
(图5)
2
PMN驱动的NHEJ上调促进DSB分辨率和诱导合成致死抗性
为了测试NHEJ上调是否能提高分解DSB的能力并提高PMN+肿瘤的存活率，作者在体外克隆形成试验中使用了致死剂量的拓扑异构酶I抑制剂(CMPT，30 M)(图6A)。用CMPT治疗的分离的PMN肿瘤细胞凋亡增加，并不能有效地形成集落。相比之下，来自大多数具有NHEJ活性增强的PMN+肿瘤细胞在CMPT刺激下存活下来，并有效地繁殖成大菌落(图6B-D)。
为了验证临床疗效，作者设计了两种Olaparib方案来治疗结直肠癌异种移植物(图6F)，从早期时间点(第2周)的肿瘤检测或NHEJ诱导时(移植后第4周)开始。用Olaparib处理培养的具有正常HR活性的HCT116结直肠癌细胞对细胞活力没有显著影响。而在第2周开始的奥拉帕尼治疗有效地抑制了肿瘤的发展(图6G-H)并导致肿瘤细胞凋亡显著增加(图6I)。相比之下，Olaparib在第4周开始对肿瘤生长或存活没有影响，这与假设的一致。
(图6)
3
NHEJ通过诱导合成致死性抗性促进HR缺乏的结直肠癌肿瘤细胞的存活
为了测试NHEJ靶向的治疗潜力，作者通过小分子抑制剂确定NHEJ上调是否促进PMN+肿瘤的生存和进展。结果发现，使用泛NHEJ抑制剂NU7441和Mirin均可抑制DSB加工和末端连接(图7A，D)。相比之下，在AOM/DSS模型中，两种抑制剂都抑制了异种移植的PMN+肿瘤的生长，抑制了HR(图7B-C，E-G)。在两种结直肠癌模型中，PMN+肿瘤中的NHEJ抑制(图7H)导致DSB水平升高(图7I)，并且与合成致死性的诱导一致，导致肿瘤细胞凋亡显著增加(图7J)。而两种抑制剂的细胞毒性作用在AOM/DSS诱导的肿瘤中更为突出！与人异种移植物相比，与更高程度的浸润性中性粒细胞相关(图7J-K)。这些发现证实了PMN+肿瘤中的NHEJ活性是结直肠癌生存和发展所必需的。这些发现进一步表明，NHEJ的特定药理学抑制可用于诱导合成致死性和限制PMN浸润的结直肠癌的进展。也就是说，PMN靶向NHEJ-浸润性肿瘤抑制结直肠癌的生存和生长。
(图7)
好啦，通过本篇范文，大家需要掌握的是解读思路。首先明确主变量、因变量、表型。把控住整篇文章的主线思路，再去看作者研究了哪些“分支”机制。还有重要的是如何加入生信层面的数据分析~我总结了一下几点：① 表达谱矩阵。Ⅰ.可以用于分析某基因的表达差异及表达量，大家可以联合之前讲过的SNP、CNV等突变分析丰富数据；Ⅱ.另外就是基因间的相关性分析，这一部分可以扩展思路，但一定要把握相关性分析的重要性；②临床数据。Ⅰ.最常规的就是癌症样本的生存数据，可以拿来分析生存曲线，以及临床变量的相关信息用于相关性分析；Ⅱ.其实很多数据库还包含了用药的信息，也都是可以拿来验证的。
最后，再来总结一下全文思路。作者的研究结果表明，通过miR-155/RAD51轴，中性粒细胞抑制肿瘤细胞的HR，导致DSB积累，细胞毒性增加和细胞凋亡/死亡，并延迟缺乏HR的低级肿瘤的生长。而在晚期结直肠癌中，在存在遗传毒性应激和对合成致死性的抗性的情况下，中性粒细胞促进了癌细胞的NHEJ依赖性存活。中性粒细胞的促瘤效应是由于NHEJ信号的上调，表现为K70病灶形成增加和NHEJ介导的DSB修复增强。总之，作者证明了在结直肠癌的进展过程中，肿瘤浸润的中性粒细胞表现出功能双重性，通过增加遗传毒性应激和促进DNA损伤修复景观的动态变化，可以介导抗肿瘤和促肿瘤的双重结果。
好啦，今天的分享就到这里啦，后台回复“0424”获取范文原文吧~我们下期再见啦！拜拜！
参考文献
[1] Bui TM, Butin-Israeli V, Wiesolek HL, Zhou M, Rehring JF, Wiesmüller L, Wu JD, Yang GY, Hanauer SB, Sebag JA, Sumagin R. Neutrophils Alter DNA Repair Landscape to Impact Survival and Shape Distinct Therapeutic Phenotypes of Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2021 Mar 19:S0016-5085(21)00536-9. doi: 10.1053/j.gastro.2021.03.027. Epub ahead of print. PMID: 33753103.
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撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
值班 | 阿 琛
主编丨小雪球
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