绝了！10分+生信SCI，解锁免疫浸润最新玩法~
领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。感谢作者为作者提供了很好的学习典范！今天带给大家的是一篇免疫浸润相关的“干湿”结合套路，于2020年6月发表在《Ann Surg》上，最新影响因子：10.13。题目是“Poor Clinical Outcomes and Immunoevasive Contexture in Intratumoral IL-10-Producing Macrophages Enriched Gastric Cancer Patients”。
疾病：Gastric Cancer；
目的基因：高表达IL-10的巨噬细胞；
数据来源：未涉及；
机制：免疫逃逸；
研究目的（文章类型）：预后型文章。
本篇范文是关于胃癌的，因对于Ⅱ/Ⅲ期胃癌根治术后的患者，氟尿嘧啶术后辅助化疗(ACT)已被推荐为标准的术后治疗方案。然而，由于不确定的化疗敏感性和随后获得的化疗耐药性，许多患者在接受ACT后仍遭受高复发率。以此为出发点，作者选择了临床胃癌样本及TCGA中的胃癌数据集进行详细分层，并探讨了免疫相关机制。
这里就引出了范文的主角——肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。这是实体瘤中最丰富的免疫细胞，被认为是分化为抗肿瘤M1或肿瘤前M2子集。作者前期已发现M2极化的TAMs决定了胃癌的不良预后。目前仍然缺乏关于不同TAM亚群功能及其对肿瘤进展的独立作用的基础知识。因此，进一步阐明不同TAM亚群在癌症中的特定作用可能会提供显著的临床益处。
IL-10 (IL-10)是由包括巨噬细胞和T细胞亚群在内的多种细胞类型分泌的IL-10超家族的主要成员。IL-10通过下调抗原呈递细胞(APCs)中MHC类和肿瘤细胞中MHC类的表达来减少或抑制抗原呈递，从而有助于免疫抑制环境。并且IL-10还可以产生TAMs促进免疫逃避。
范文中的肿瘤组织样本来源于接受了根治性或姑息性胃切除术和标准D2淋巴结切除术的468例胃癌患者。作者将其随机分为两个独立队列，包括发现集(n=219)和内部验证集(n=249)。并从癌症基因组图谱(TCGA)中收集了数据完整的298名患者数据作为外部验证集。由此，范文中总共包括了三个独立队列。
总体的文章思路是从确定IL-10肿瘤相关巨噬细胞在胃癌中的临床意义开始的。由于TAMs的可塑性和多样性，作者想到对TAMs的亚群进行表型和功能分类，可能更好地说明TAMs在癌症进展中的关键作用。那么，分析表达IL-10 的TAMs在胃癌中的作用就是一个很好的创新点。通过IHC和流式细胞术检测IL-10水平和免疫环境，再结合临床数据进行生存预后分析，确实是一套非常优秀的分析思路。
“挑”——表达差异
文章是以IHC和流式细胞术的结果开始的，分别用于检测胃癌组织微阵列和新鲜手术标本中IL-10的浸润(图1A-B)。发现高表达IL-10 的TAM浸润更晚期的肿瘤阶段相关(图1C-D)。流式细胞术分析显示，与匹配的肿瘤周围组织相比，肿瘤组织中CD45免疫细胞中的IL-10 TAMs比例更高(图1E)。此外，作者还发现Ⅲ期肿瘤中IL-10调节蛋白的比例高于Ⅱ期肿瘤(图1F)，这验证了组织微阵列的发现(图1C，D)。因此，这些数据表明肿瘤浸润的IL-10受体激动剂可能与肿瘤进展有关。总之，上来的第一部分说明了IL-10受体拮抗剂在胃癌中积累并与疾病进展相关。
(图1)
“靠”——临床意义
1
生存分析——高浓度IL-10决定胃癌患者的不良预后
肿瘤组织中表达有差异，并与疾病进展相关这就已经可以继续接下来的分析了。为了加强这一论证的意义，当然就是要“靠”患者的临床数据啦~于是，作者评估了纳入的三个独立队列中IL-10浸润在胃癌中的生存预后价值。在发现集和内部验证集中，与总抑制因子相比，高水平的IL-10抑制因子能够预测胃癌患者的不良预后(图2A-D)。然而，在外部验证组中，高水平的IL-10的肿瘤坏死因子信号仅与较差无复发存活时间相关(图2E-F)。此外，多因素Cox回归分析显示IL-10 TAMs是预测胃癌患者不良预后的独立预后因素。综上所述，这些结果表明IL-10受体拮抗剂可能是预测胃癌患者复发和存活的一个有用的独立预后因子。
(图2)
2
IL-10受体介导的肿瘤浸润增加与Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者术后辅助化疗的疗效减弱相关
在确定了IL-10具有临床生存意义后，作者进一步评估了IL-10的浸润是否与氟尿嘧啶术后辅助化疗（ACT）的疗效相关。在发现集合内部验证队列中，ACT在Ⅱ/Ⅲ期患者中的OS明显优于RFS(图3A-B)。然而，在将患者分为IL-10高和低浸润组后，发现在IL-10浸润较低的患者中ACT对OS合RFS均有所改善，而在IL-10浸润较高的患者中未发现有总体获益(图3C-F)。对IL-10 TAM浸润和ACT疗效之间的分析显示，接受ACT的患者中IL-10 TAM低浸润的RFS远优于IL-10 TAM高浸润的患者(图3C-F)。因此，这些结果表明IL-10受体激动剂可能减弱胃癌对ACT的反应。
(图3)
“联”——联系潜在的免疫逃逸机制
由于IL-10 TAMs在胃癌中可能形成免疫逃避环境。基于IHC染色评估白介素-10 TAMs和CD4+细胞、CD8+T细胞等免疫之间的联系。发现组织芯片中IL-10转录因子与Foxp3转录因子与CD8+T细胞比率的相关性和关联性。新鲜胃癌标本中高、低IL-10 TAMs浸润的CD8+T细胞、Foxp 3+TREGs及Foxp 3+TREGs与CD8+T细胞比值的比较。作者进一步IL-10 TAMs对其产生了何种影响。通过CIBERSORT分析检测IL-10 TAM mRNA水平与TCGA数据库中22种人类造血细胞表型(LM22)中的18种免疫细胞类型的相对比例。如图4A所示，高IL-10 TAM信号与高水平的记忆B细胞(Bm)、CD8+T细胞、记忆激活的CD4T细胞和Treg细胞相关。接着，作者对肿瘤显著浸润的免疫细胞进行了IHC染色。与CIBERSORT的结果一致，IL-10 TAMs与CD8呈正相关，与浆细胞呈负相关，这在之前的研究中已经被确定为胃癌的抗肿瘤免疫疗法。此外，作者还发现NK细胞、Treg细胞和中性粒细胞的浸润与IL-10 TAM的浸润呈正相关(图4B)。虽然IHC染色显示CD8+T细胞和Treg细胞在IL-10 TAM高浸润亚群中都上调，但在IL-10+ TAM高浸润亚群中Foxp3+ Treg细胞/CD8+T细胞的比例显著增加(图4C)，这提示了免疫抑制性更强的TME。这些发现通过流式细胞术分析得到进一步验证(图4D)。因此，IL-10可能在胃癌中形成免疫逃避的环境。
(图4)
“圈”——富集分析
随后，作者进一步研究了IL-10调节蛋白与CD8+T细胞功能状态的关系。通过GSEA作者发现与IL-10 TAMs高浸润的肿瘤组织相比，衰竭的CD8+T细胞基因组在IL-10 TAMs低浸润肿瘤组织中显著富集(图5A)。并且，结合之前的IHC结果，IL-10 TAM高浸润肿瘤组织中的CD8+T细胞也同样显示出衰竭表型，表现为Ki-67的减少，但程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3 (LAG-3)表达增加(图5B-C)。此外，CD8+T细胞表达的效应分子包括CD107a和穿孔素(PRF1)在高IL-10 TAM浸润肿瘤中减少(图5D)。总之，这些数据表明IL-10受体激动剂可能与CD8+T细胞功能障碍有关。
“靠”——临床预后分析及治疗疗效分析
为了进一步探讨IL-10抑制的CD8+T细胞功能障碍的临床意义，作者基于上述得到的IL-10和CD8+T细胞浸润的相关分析，继续进行分层分析，以预测胃癌的预后以及ACT的疗效。作者将IL-10抑制的TAM与CD8+T细胞水平相结合进行生存分析。发现CD8+T细胞浸润较高的样本与整个患者队列更好的OS。然而，在IL-10 TAMs高浸润亚群中，CD8+T细胞的这种有益作用被抑制。这些发现表明，IL-10 TAMs的存在可能有助于胃癌CD8+T细胞的免疫耐受。
由于IL-10 TAMs高浸润组中的CD8+T细胞不能有效的预测预后，作者将IL-10 TAMs和CD8+T细胞浸润的最佳临界值应用于各种风险亚组，即分为低、中及高风险组。进一步的分析表明，低风险组显示出最有利的预后，而高风险组显示出最差的OS和RFS(图6A-C)。多因素Cox回归回归分析也用于评估不同风险群体之间的关系。结果显示风险模型分类可以作为预测胃癌患者复发和生存结局的独立预后因素(图6B-D)。并且该风险分类还能够很好的预测Ⅱ/Ⅲ期胃癌患者对ACT的疗效，高危组患者对ACT的治疗反应性可能较差(图6E-F)。总之以上数据表明IL-10 TAMs和CD8+T细胞的水平可用于将患者分为不同的风险亚组，从而预测不同的预后和对ACT的反应。
(图6)
“联”——IL-10的浸润与分子特征的关系
基于肿瘤微环境中肿瘤细胞和免疫细胞之间的复杂相互作用，作者进一步研究了胃癌中IL-10的浸润与肿瘤内在分子特征之间的关系。微卫星不稳定性和肿瘤突变负荷的分析中，作者发现IL-10 TAM浸润与两者均无关(图7A-C)。然而，在TCGA和ZSH的队列中，发现在EBV阳性的肿瘤中IL-10 TAM的浸润高于EBV阴性的肿瘤，IHC染色结果也进一步证实了这一点。在IL-10浸润较高的样本中，PD-L1T细胞显著增加(图7E)。在TCGA队列中，IL-10标记高表达的患者更常见，且EBV阳性和GS亚型的样本更加明显(图7F)。此外，这一发现在发现集和内部验证队列中用基于以TCGA亚分型算法进行了验证(图7G)。总之，这些数据表明IL-10的浸润与包括胃癌的EBV状态、PD-L1表达和基因组稳定性在内的肿瘤内在特征相关。
(图7)
本篇范文最大的亮点就是针对IL-10 TAMs浸润这一个问题展开了深入的探讨。尽管文章中只有IHC和流式细胞分析这两种比较常规的检测方法，也将一份临床数据发表以免疫浸润的展新面孔发表在了10分+的杂志上。总结作者的优秀思路，首先出发点创新的很巧妙，从一个临床问题出发，可以将老分子分析的绘声绘色。另外很重要的一点就是将临床数据分为发现集和内部验证集，又将TCGA数据作为外部验证集。相比于仅将TCGA数据验证一下的“干湿”结合套路来讲，这一点就已经使文章层次分明了。
总体的文章框架呢，作者鉴定了胃癌组织中表达IL-10的TAMs亚群，并分析了其对胃癌患者的预后和预测价值。研究发现，IL-10浸润程度高的胃癌患者预后差，ACT反应性差。进一步的分析表明，IL-10的TAMs与CD8的T细胞功能障碍有关，也与包括EBV状态、PD-L1表达和基因组稳定性在内的胃癌内在特征有关。这些发现强调了IL-10 TAMs作为胃癌潜在预后和预测标志物的重要性。进一步分析Ⅱ/Ⅲ期患者IL-10 TAM浸润和ACT反应性之间的关系显示，只有IL-10 TAMs浸润低的患者才能从辅助化疗中显著获益。以上的这些结果都将有助于更好地选择和管理接受辅助化疗的患者。
到这里还没有结束，作者进一步探讨了IL-10 TAMs高、低分组之间的免疫环境异质性，并发现IL-10高浸润与胃癌免疫逃避微环境有关，这为IL-10高浸润患者生存率差和对ACT治疗反应差提供了合理的解释。
好啦，通过菠小萝的解读，大家是不是更加理解范文的思路了呢！关注每周六的生信文献解读栏目，为大家提供最高效的学习~后台回复“白介素10”获取范文文献吧~作者下周再见啦，拜拜！
参考文献
[1] Zhang H, Li R, Cao Y, Gu Y, Lin C, Liu X, Lv K, He X, Fang H, Jin K, Fei Y, Chen Y, Wang J, Liu H, Li H, Zhang H, He H, Zhang W. Poor Clinical Outcomes and Immunoevasive Contexture in Intratumoral IL-10-Producing Macrophages Enriched Gastric Cancer Patients. Ann Surg. 2020 Jun 11. doi: 10.1097/SLA.0000000000004037. Epub ahead of print. PMID: 32541216.
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