领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏，2020年的12月，菠小萝将以“你也能发表的高分生信”为专题，带给大家不一样的生信体验~本周菠小萝要教给大家一个省了好多实验还能发高分文章的套路，先埋个伏笔~先来说说范文，我要与大家分享的文章题目是“A serum microRNA signature predicts trastuzumab benefit in HER2-positive metastatic breast cancer patients”，于2018年4月发表在《Nature Communication》上，最新影响因子：12.121。菠小萝选中这篇文献呢，是专门为临床小伙伴们准备的~通过这篇文章，我来给大家讲一讲作者是如何利用临床优势，只做简单的细胞实验结合发表10分+SCI的。
期刊信息
背景知识
我们研究肿瘤的小伙伴们应该都知道曲妥珠单抗是HER2阳性乳腺癌(HER2 +)的标准疗法，但并不是对所有患者均奏效。并且曲妥珠单抗是需要长时间给药，治疗费用也很昂贵。那么用或不用这个药就成为了一个研究方向，也就是筛选曲妥珠单抗治疗的获益人群。
目前已经存在一些与曲妥珠单抗相关敏感性在早期乳腺癌患者接受新辅助或辅助治疗的生物标记,包括HER2扩增子,磷酸酶和胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)信号等,尚且存在一些免疫细胞签名。然而，临床活检的准确性和预测能力也受到肿瘤异质性的极大限制。
因此，作者选择了血清样本筛选Biomarkers。并评估了接受一线曲妥珠单抗联合化疗的HER2+MBC患者血清样本中血清miRNA谱与临床结果之间的关系，为个体化治疗提供了有用的生物标志物。
结果解析
（一）“挑”——血清miRNA签名的模型构建
作者选择了386例接受曲妥珠单抗一线化疗的HER2+MBC患者中筛选254例，并从中随机抽取103名患者作为训练队列，其中61名患者对治疗有反应，42名患者耐药。
通过分析大样本的血清miRNA芯片数据，发现在HER2+ 的MBC 患者中，存在13个差异miRNA对曲妥珠单抗具有明显的应答反应。
其中3个miRNA在敏感患者中下调(miR-10b-3p、miR-940、miR-4310)， 10个miRNA (miR-17-3p、miR-451a、miR-30b-3p、miR-4716-5p、miR-494、miR-29a-5p、miR-22-3p、miR-451b、miR720、miR-16-5p)上调(Fig.1a)。
在训练队列中，通过定量qRT-PCR分析进一步评估13个miRNAs的表达。结果发现一些miRNAs之间存在共线性(Fig.1b)，因此作者选用Lasso回归模型选择患者预后预测的PFS，其中miR451a, miR-16-5p miR-17-3p, miR-940在13个microrna中具有最优加权系数，因此选择这4个miRNA构建一个预后签名(Fig.1c)。
Fig.1a-c
（二）差异表达
为了评估正常人群中这4种miRNA的血清水平，作者收集了55名健康供体的血清样本用于对照。
然而结果发现，尽管与正常对照组相比，抗曲妥珠单抗HER2+MBC患者血清miR-451a、miR-165p和miR-17-3p中表达水平下降，但不存在统计学差异。
而miR-940在对曲妥珠单抗敏感的HER2+MBC患者中较正常组升高，并且耐药患者的miR-940进一步升高(Fig.1d)。
Fig.1d

（三）“靠”——生存风险评估

1、风险计算公式的应用

为了验证风险计算公式的准确性和适用性，研究者除了对训练集，还用测试集和独立验证集做了验证。

依据风险计算公式计算出每个数据集中各样本的风险得分，用X-tile软件将每个数据集的样本分成高风险和低风险组，然后根据样本的PFS和OS，做了Waterfall plots、survival等分析，证明挑取的miRNA和公式具有普适性，可作为marker使用。

作者使用了如下风险计算公式：Risk score = (0.611 × value of miR-940)−(0.482 × value of miR-451a)−(0.525 × value of miR-16-5p)−(0.719 × value of miR-17-3p)。

由此确定最优选择截断分数(0.13)，将训练队列中的患者根据与PFS的关联，分为高风险分和低风险分亚组。结果发现，分布的临床病理特征没有显著变化(Table 1)。

而当把病人风险评分的分布与反应状态相关联时,能够发现患者低风险组较高风险组能够更好的应对曲妥珠单抗治疗(Fig.2a-d)。

Table 1
(Fig.2）
2、验证组的单变量分析和多变量分析

作者对OS和PFS的4-miRNA特征和临床病理特征进行了单因素和多因素生存分析。4个miRNA的单因素分析显示，每个miRNA都是HER2+ MBC曲妥珠单抗治疗患者的独立预后因素(Table 2)。

Table 2

接下来，作者对临床病理进行分层分析,预测HER2的PFS + MBC患者独立的临床病理特征,包括转移性网站的数量、年龄、Ki67, ECOG, ER/PR状态和更年期(Fig.3)。

Fig.3
3、与其他预后因素的比较
为了进一步评估4-miRNA签名对风险评分预测的累积效应，作者分别计算了训练队列、内部队列和独立队列中受试者工作特征曲线(AUC)下面积(Fig.4a-c),表明这个签名能够很稳定的预测以及审查以上生存数据。
并且为了开发一种更敏感的预测工具，作者基于训练队列，构建了一个结合两个独立预后因子4-miRNA签名和转移位点数量的预后评分模型。
在所有的队列中，这两种因素联合使用的曲线下面积(AUC)高于4-miRNA特征或单独转移部位，尽管差异没有达到统计学意义(Fig.4d-f)。
Fig.4
4、4-miRNA签名对曲妥珠单抗反应的预测价值
为了探索4-miRNA标记是曲妥珠单抗敏感性的特异性预测标记，还是仅仅是较差临床结果的预后标记，作者通过截断值将179名接受不含曲妥珠单抗的二线化疗的HER2+MBC患者分成了4-miRNA标记的高分组和低分组。
并比较了仅接受化疗的队列与验证队列(n=283)的临床结果，以评估该特征是否具有预测性。结果与预期的一样，与单纯接受化疗的患者相比，接受曲妥珠单抗联合化疗的患者OS延长了。
亚组分析中，接受曲妥珠单抗治疗的患者中低分亚组OS改善(HR 1.86;95%可信区间1.35 - -2.55;P< 0.001)和PFS (HR 2.58;95%可信区间1.90 - -3.52;P < 0.001),而PFS没有显著区别(Fig.5)。
总的来说，这些数据表明，4-miRNA签名是HER2+MBC患者曲妥珠单抗反应的预测标志物。
Fig.5
（三）基因签名功能和机制研究
1、间接机制验证
最后一部分仍落脚于基因签名的功能和机制上，这一部分也是文章的亮点。
为了确定这四种miRNA的来源，作者首先从手术切除的样本分离了原发肿瘤细胞和免疫细胞，包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和粒细胞。
培养之后进行了体外细胞增殖凋亡测定；并对分离的细胞外囊泡通过EV标记CD63和Alix，进行了Western Blot(Fig.6b)，和透射电镜(Fig.6c)进行实验验证。
Fig.6b-c
结果提示miR-940在肿瘤细胞无EV上清中表达高。而miR-451a和miR-17-3p在T淋巴细胞的EV中优先表达。此外，在肿瘤细胞和造血成分中均观察到miR-16-5p的高表达，其中单核细胞EVs中miR-16-5p表达水平最高(Fig.6d-g)。
Fig.6d-g
综上，结果表明miR-940主要由肿瘤细胞释放，而miR-451a、miR-16-5p和miR-17-3p主要来自免疫细胞的EVs。其实到这里就已经能发很好的文章了，但是作者进行到了这一步，为什么不利用一些简单的细胞实验深入挖掘机制，发更高分的SCI呢？当然要啦，科研总是这样，需要锲而不舍的精神哈哈~
为了研究这四种miRNA是否影响了HER2+乳腺癌细胞的曲妥珠单抗敏感性，作者又利用HER2+乳腺癌细胞系(SKBR3和BT474)对这些miRNAs进行过表达和沉默的“一正一反”操作。
发现与未处理组或阴性对照组的肿瘤细胞相比，沉默miR-940或过表达miR-451a、miR-165p、miR-17-3p的肿瘤细胞显著促进了曲妥珠单抗处理的肿瘤细胞的死亡。
过表达miR-940或沉默miR-451a、miR-165p、miR-17-3p均显著降低肿瘤细胞对曲妥珠单抗的敏感性(Fig.7a-d)。
Fig.7a-d
综上所述，这些数据提示上调miR-940、下调miR-451a、miR-16-5p、miR-17-3p可在体外诱导肿瘤细胞曲妥珠单抗耐药。
为了研究这些miRNA的潜在靶点，作者使用靶标预测工具TargetScan和MicroTar。在候选靶基因中，PTEN是miR940的潜在靶基因，IGF1R是miR-451a和miR-16-5p的潜在靶基因，SRC是miR-173p的潜在靶基因(Fig.7e)。
Fig.7e
2、直接机制验证（Rescue）
为了进一步验证这些靶点，作者通过荧光素酶报告基因实验证明，miRNA种子序列的突变完全回复了miRNA模拟物诱导的荧光素酶减少，由此证实了miRNA靶点的特异性(图7f-i)。
图7f-i
以上数据表明，PTEN、IGF1R和SRC分别是miR-940、miR-451a/miR-165p和miR-17-3p的靶基因。
思路总结
范文呢也比较套路，选择了从miRNA入手，这样显得文章更加与时俱进。但这还要看研究的结果啦~很多小伙伴会走入这样一个误区，我选择miRNA啦，或者lncRNA呀，再或者circRNA等等，在分子类型上想要创新去给文章加分。
然而，有些时候还是看运气~菠小萝想告诉大家的是，评价一篇文章质量，主要是看科学假说是否新颖，或者换句话说是否与时俱进；逻辑框架是否严谨；研究设计是否合理；数据样本是否达标等等这些因素。审稿专家也不会因为我们选择了一个什么样的分子类型而给我们加分呀，毕竟你认为新的，他们可能并不这么认为呢~
这就体现了文章选题的亮点，先不说作者选择了什么样的分子类型，就说说样本类型。与大部分文章不同的是，一般我们会选择一些简单的免疫组化，但是作者选择了血清样本。这也是为什么作者会选择miRNA作为主要研究对象，因为miRNA的特征之一就是“循环”。从这点来看作者选择miRNA很大因素是由于血清样本的选择啦！血清样本有两大优势，第一就是便于获取，第二就是便于筛查。因此大大提升了文章研究结果的实用性。我们继续回顾全文。
这篇文章的第二大亮点就在于大量的临床样本这也是基于样本本身的特性。本篇范文围绕着miRNAs能否作为HER2+转移性乳腺癌(MBC)患者的生物标志物这一个初步问题展开分析。作者利用miRNA芯片，在对曲妥珠单抗有不同反应的HER2+MBC患者的血清中，首先鉴定出13个差异表达的miRNA，并选择其中4个miRNA构建一个签名。“挑”好分子后，需要验证表达差异啦。作者比较了4个miRNA在3组样本（55例正常样本/134 例曲妥珠单抗耐药患者/252例曲妥珠单抗敏感患者）中的表达情况。
接下来就是“靠”，作者使用LASSO模型去预测生存意义，也就是。既然有意义，那就继续讨论咯~讨论什么呢？当然是分子功能啦~作者这四种miRNAs，包括miR-940主要来自于肿瘤细胞，而miR-451a、miR-16-5p和miR-17-3p主要来自于免疫细胞。四个分子都直接靶向在调节曲妥珠单抗耐药性中起关键作用的信号分子。于是，作者就有理由将这四个miRNAs开发为一种基于血清的miRNA签名，能够预测曲妥珠单抗对HER2+MBC患者潜在的治疗效果。
总结一下，作者通过临床大量血清样本的芯片筛查，加上临床数据挖掘与机器学习，构建了一个可用于预测曲妥珠单抗对HER2+ MBC 患者治疗效果好坏的模型。而预后分子分型的建立可成为制定治疗方案的重要依据，是一种更为积极主动的肿瘤防治方法。
好啦，小伙伴们学习完这篇临床数据 & 简单细胞实验的生信文章，是不是觉得自己临床工作成为了一种很厉害的优势呢！快快吧自己的临床数据拿来用呀，说不定下一篇10分+生信就是你的哦~我们下周再见吧，拜拜！
—END—
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