“单基因套路”也能15分+！这样的生信它不香吗？

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。感谢作者为我们提供了很好的学习典范！今天带给大家的是一篇套路，于2020年8月发表在《Adv Sci》上，最新影响因子：15.84.题目是“Direct Targeting of CREB1 with Imperatorin Inhibits TGFβ2-ERK Signaling to Suppress Esophageal Cancer Metastasis”。

期刊简介

“挑圈联靠”题目要素拆解

疾病：Esophageal Cancer；

目的基因：CREB1；

表型：Metastasis；

机制：TGFβ2-ERK Signaling；

研究目的（文章类型）：诊断/预后型分子标志物&药物筛选。

知识背景

本篇文章是由暨南大学肿瘤分子生物学教育部重点实验室何庆瑜教授、李斌研究员、许雯雯副研究员等组成的科研团队完成的，许雯雯副研究员和硕士研究生黄志豪为此文的共同第一作者。感谢这个科研团队为我们提供学习的典范。

转移是癌症患者治疗失败的主要原因，这篇文章的表型也是比较常见的转移。食管癌也没有什么特别的，我们来说说TGFβ2-ERK通路。TGF-β信号转导异常则可能导致多种疾病的发生，比如胚胎发育异常、肿瘤、组织纤维化、心血管疾病和免疫性疾病等。并在细胞和组织的生长、发育、分化中起关键作用,对细胞的增殖、细胞间质等均有重要影响。TGF-β家族具有广泛的生物学功能，其配体二聚体与膜上相应的II型受体和I型受体形成复合物，诱导II型受体磷酸化I型受体并激活其激酶活性，然后I型受体招募并活化下游的Smad蛋白，从而诱导Smad蛋白在细胞核内聚集并作为转录因子发挥转录调控作用。根据在TGF-β信号转导中的功能差异，它们被分为三类：包括受体调控的Smad（receptor-regulated Smad，R-Smad – Smad1/2/3/5/8）；通用Smad（common Smad，Co-Smad – Smad4）；抑制型Smad（inhibitory Smad，I-Smad – Smad6/7）。目前已知在人类中共存在33个TGF-β家族蛋白，包括3个TGF-β（TGF-β1/2/3）、10个BMP（Bone Morphogenetic Protein）和11个GDF（Growth and Differentiation Factor，其中GDF2=BMP9，GDF8=myostatin），以及activin、nodal、inhibin和AMH/MIS等，它们都是二聚体的分泌型多肽，根据序列、结构及信号转导分子的差异, TGF-β细胞因子大致被分为两个亚家族，其中TGF-β、activin和nodal等属于同一个亚家族，而BMP、GDF和AMH等组成BMP亚家族。

关于这条通路，我们解螺旋也有一篇相关的原创文章“姿势 | 一文理清TGF-β信号通路家谱（图文并茂）”，大家可以进一步学习这条通路的相关知识

我们再来说说本篇范文中筛选到的欧前胡素，这是一种具有抗菌、平喘及抗过敏等作用的，极性小且不溶于水的有机溶剂。本篇范文就是首次提出了通过欧前胡素能够通过TGFβ2信号通路，抑制食管癌转移。

数据来源 & 思路框架

肿瘤细胞本身和肿瘤微环境中基质细胞都可分泌大量的细胞因子包括transforming growth factor beta (TGFβ)、vascular endothelial growth factor (VEGF)等，这些细胞因子可通过酪氨酸蛋白激酶受体促进肿瘤细胞的侵袭以及肿瘤组织的血管生成。因尚未有关于TGFβ2能否诱导食管癌转移的报道，该课题组即以这条线索出发，从生物学功能、临床意义等方面探讨了分子机制。首次提出TGFβ2在食管癌肿瘤组织中明显高表达, 并且与患者生存率显著负相关。

数据精析

一.表达差异——获得与肿瘤侵袭和转移相关的DEGs

为了初步分析食管癌（ESCC）侵袭和转移的潜在机制，作者从TCGA数据库中获得了60例ESCC病例的RNA测序数据和临床信息，并将N0与N3阶段肿瘤的基因图谱进行差异分析（图1C）。并以免疫组化验证186例ESCC和160例正常配对组织的TGFβ2的差异表达（图1D-E）。以及通过酶联免疫吸附测定（ELISA）验证与正常组织相比（各100例），ESCC患者血清中能够观察到TGFβ2的浓度明显升高（图1I）。并且作者还在GEPIA数据库中验证了与相应的正常组织相比，TGFβ2在食管癌（ESCC）、胶质母细胞瘤（GBM）和胰腺腺癌（PAAD）中的表达均显着上调（图S1D）。综上所述，这些数据表明TGFβ2可能在ESCC的诊断和预后中具有潜在的应用价值。

（图1C-E）

接下来，还是进一步研究转移组织与非转移组织间的表达差异（图1G-H）。

（图1G-H）

二.功能富集确定

获得的DEGs进行基因本体论（GO）富集分析。结果表明，ESCC转移涉及一系列信号通路，例如细胞外基质的组织（图1A）。并将在ESCC转移中确定的GO富集分析中最显著富集的基因列表列于图1B。

（图1A-B）

三.生存分析

组织用自己的临床数据进行了Kaplan-Meier生存分析。结果表明，TGFβ2高表达的患者较TGFβ2低表达的患者中位生存期短，且与淋巴结转移显着相关（图1F）。

（图1F）

四.间接分子机制

接下来就是探讨分子机制了，作者通过功能丧失等小鼠体内实验验证TGFβ2是驱动肿瘤转移所必需的 (图1K)。结果表明，TGFβ2的敲低能够显着降低KYSE150和KYSE30细胞的侵袭潜能（图1L）。并且，在TGFβ2敲低的ESCC细胞中发现E-钙粘蛋白表达增加，而纤连蛋白和N-钙粘蛋白表达下降（图1M）。

（图1J-M）

五.药物筛选及鉴定

接下来就是本文的亮点，也是文章能够15分+的关键部分。即筛选靶向TGFβ2促进肿瘤转移的潜在抑制剂。图2A展示了筛选方法的第一步就是量化了57种候选化合物在KYSE150细胞中的抗侵袭作用（图2B）。然后，用不同浓度的欧前胡素处理KYSE150和KYSE30细胞24 h，Western blot、ELISA分别检测TGFβ2在细胞和血清中的表达，还做了细胞侵袭实验（图2C-E）。然后是裸鼠体内验证对肺、肝、肾和脾转移进行定量分析（图2F-J）。

（图2）

六.“药物+通路”二元变量的间接机制论证

作者通过SILAC定量蛋白质组学鉴定了欧前胡素调节的蛋白质（图3A）。维恩图显示了在两个生物学特征中重叠的蛋白（图3B）。将差异变化倍数变化≥1.5的差异表达蛋白进行IPA分析（图3C）。随后，Western验证用欧前胡素处理24 h的KYSE150和KYSE30细胞中p-ERK和ERK的表达（图3D）。以及将KYSE150和KYSE30细胞分别暴露于指定剂量的TGFβ2敲低后的重组蛋白，鉴定p-ERK和ERK的表达水平（图3E-G）。并将KYSE150和KYSE30细胞暴露于有或没有U0126的TGFβ2中，比较纤连蛋白，N-钙粘着蛋白，E-钙粘着蛋白，p-ERK和ERK的表达。Boyden室法比较在存在或不存在TGFβ2的情况下，用欧前胡素处理的KYSE150和KYSE30细胞的侵袭潜力（图3H）。发现TGFβ2减弱了欧前胡素对EMT标记物和p-ERK表达的影响（图3I）。综上，结果表明欧前胡素能诱导TGFβ2-ERK信号转导失活。

（图3）

然后，就需要探讨欧前胡素在肿瘤微环境中有何影响，也就是药物对表型有何影响。图4就展示了从中收集条件培养基开始，使用欧前胡素处理过的ESCC细胞或未处理过的ESCC细胞做对比，验证一些癌症相关实验。比如常用的成纤维细胞（CAF）迁移实验、qRT-PCR，ELISA和Western，检测CCL2的各种表达情况。

（图4）

七.直接机制论证

接下来就是要分析欧前胡素是经由那条途径产生表型的对不对！作者通过qRT-PCR、萤光素酶试验、Western分析了欧前胡素直接与CREB1结合，并抑制CREB1与TGFβ2启动子之间的交互关系作用。BiaCore实验验证明欧前胡素与CREB1蛋白之间存在交互（图5H）。通过ChIP-qPCR检测CREB1在TGβ2启动子中的富集，及其通过欧前胡素处理的抑制作用（图5I）。并给出了欧前胡素如何在细胞内和细胞外抑制肿瘤侵袭和转移的示意图（图5K）。

（图5）

直接机制验证的重头戏来了！图6中进行了我们期待已久的Rescue。验证了CREB1对于欧前胡素对TGF-β2-ERK信号传导和ESCC转移抑制作用的必要性。作者先是做个铺垫，分析了186例ESCC和160例正常组织配对的p-CREB1的代表性图像和表达模式（图6A）。并根据肿瘤p-CREB1高低表达进行分组，对186例ESCC患者的总生存期进行Kaplan-Meier分析（图6B）。证明ESCC患者中p-CREB1的表达与TGFβ2表达正相关（图6C）。以及p-CREB1在40例原发性食管鳞癌和匹配的转移性肿瘤中的表达差异（图6D）。

然后就是Rescue，作者通过通过细胞迁移和侵袭实验比较了欧前胡素对KYSE150-CREB1野生型-KO和KYSE30-CREB1突变体-KO细胞侵袭的作用（图6E-F）。CREB1敲除能够回复欧前胡素对KYSE150-Luc细胞形成肿瘤转移的能力的抑制，当野生型CREB1重新过表达时，欧前胡素的抗转移作用得以恢复，而突变体CREB1无此作用（图6H）。

（图6）

全文总结

总体来看，文章通过TCGA公共数据库分析了TGFβ2在临床样本中的表达，并首次指出TGFβ2在食管癌中显著高表达，并且利用该课题组自己的临床病理数据进行生存分析。最后选择在线平台进行高通量药物筛选，发现了通过TGFβ2信号通路，抑制食管癌转移和的小分子药物欧前胡素。

本篇范文利用了TCGA、GEPIA数据库进行生信分析，并筛选验证新型药物。范文是一篇“一上一下，体内体外，细胞动物”都做到了的二元变量直接论证文章。探索了欧前胡素抑制侵袭转移的分子机制，发现欧前胡素通过与CREB1蛋白直接结合，抑制p-CREB1及其对TGFβ2的转录调控作用，进而降低TGFβ2表达，并阻断ERK信号通路，最终发挥对食管癌侵袭转移的抑制作用。

好了，这篇从生信分析、临床意义、分子调控直接机制的多维度方法的二元变量直接论证模式大家学会了吗？后台回复“欧前胡素”获取范文原文和补充材料吧，我们下周再见啦，拜拜！

参考文献

[1] Wen Wen Xu,Zhi‐Hao Huang,Long Liao,et al.Direct Targeting of CREB1 with Imperatorin Inhibits TGFβ 2‐ERK Signaling to Suppress Esophageal Cancer Metastasis.Advanced Science .First published: 01 July 2020 https://doi.org/10.1002/advs.202000925