生信也有队列研究！这篇近9分纯生信SCI教你如何挖别人的数据，发自己的文章！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。在前两周我们分别讲解了两篇非常有特色的免疫相关生信文章，一篇是利用自己的临床队列数据，另一篇则是在CYT高、低组间差异及相关性分析研究比较深入的纯生信文章。今天菠小萝带给大家的是一篇数据非常简单，分析思路却很别出心裁，切入点非常巧妙。文章不仅使用了TCGA数据库，还选择了一项符合纳入标准的临床数据作为独立队列。挖别人的数据，发自己的文章~这篇8分+的免疫相关预后型生信文章，菠小萝墙裂推荐！

本文于2019年6月发表在《Cancer immunology research》上的，题目是“Programmed cell death ligand-1 (PD-L1) and CD8 expression profiling identify an immunologic subtype of pancreatic ductal adenocarcinomas with favorable survival”这是一本非常经典的肿瘤免疫学相关杂志，医学1区，免疫学2区，年发文量: 174，影响因子8.728，大家可以关注一下。

本篇范文思路框架清晰明了，通过PD-L1和CD8表达谱确定了胰腺导管腺癌的一种免疫亚型，具有良好的生存率。并在一个独立的患者队列中使用互补的免疫组化方法来确认这些关系的重要性。

期刊信息

题目要素拆解

疾病：pancreatic ductal adenocarcinomas ；

目的基因：PD-L1 & CD8；

数据来源：Unknown；

机制：可能是分子间的相关性及互作；

研究目的（文章类型）：identify an immunologic subtype，是一篇诊断型生信文章。

知识背景

肿瘤的生长和进展与免疫抑制有关，已知癌细胞能够激活拥有免疫抑制功能的不同免疫检查点途径，从而抑制免疫系统活性以实现逃避免疫细胞的识别和清除。免疫检查点治疗可以通过阻断免疫系统这种抑制信号来增强抗肿瘤免疫应答，最近的报道显示，多种恶性肿瘤的患者已经受益于免疫检查点抑制剂治疗。

然而，尽管肿瘤中PD-L1表达是最确定的主动免疫调节的生物标志物之一，但是其在PDAC中的运用并不理想。在PDAC的多个队列中对PD-L1表达进行了调查，只有少数研究调查了PD-L1表达与CD8表达和其他可能导致PDAC免疫抑制的适应性免疫抵抗途径相结合的重要性有研究表明错配修复缺陷(MMRd)是目前唯一用于识别可能对免疫检查点抑制剂有反应的PDAC病例的生物标志物。作者在本项研究中分析了胰腺癌患者PD-L1表达和生存与肿瘤浸润性免疫亚群之间的关系，并确定了在PDAC上调并可能与肿瘤进展有关的额外免疫检查点。并且，作者利用自己的临床数据创建了一个独立的患者队列，通过IHC来证实这些关系的重要性。

然而，免疫检查点治疗也同时存在一些重要问题，如对免疫疗法的显著反应目前仅限于少数患者和适应症、免疫相关不良事件出现等。由于免疫检查点治疗的低响应率，在许多未选择的肿瘤患者中，免疫治疗没有观察到有意义的临床益处，但一部分肿瘤患者却表现出有益的响应，这说明免疫检查点疗法对于受益的患者群体具有一定的选择性，因此进一步区分肿瘤的免疫亚型对于改进临床试验设计和鉴定可能受益于免疫检查点治疗的患者是十分必要的。本文的研究结果为PDAC免疫分型的依据和预测PDAC免疫治疗疗效提供了理论依据。

数据来源 & 思路框架

在数据的选择上，作者使用了TCGA-PAAD数据集。并从中获取了146例胰腺癌患者的突变注释文件(MutSig 2.0)。作为突变burgen的一种测量方法，我们使用了每个样本中对数10转换的非同义突变的数量来进行进一步的分析。除了数据库，作者同时纳入了一项从2008年至2012年接受胰腺切除术的患者中收集的PDAC数据作为另一独立队列。

在研究方法上，作者首先通过cBioPortal数据库估计了免疫检查点标记过度表达的阈值。并根据肿瘤样本中位表达值将数据分为高和低淋巴细胞浸润组，以及高和低CD8+ T细胞密度组。并在临床预后分析中使用KM生存分析和单变量Cox比例风险回归模型构建的方法。对于Th1/IFNγ基因签名，作者结合了来自Bindea等人发表的Th1签名的基因，以及Reactome数据库的IFNγ信号通路基因集合。当然分子相关性分析也是必不可少，作者分析了PD-L1 (CD274)和IDO1表达与CD8A、CD68、GZMB、NOS2和Th1/IFNγ基因特征的相关性的突变负荷分析。

数据精析

（一）差异聚类分析——免疫检查点基因表达差异

与单基因生信套路不同的是，本文的目的基因本身就为明星Biomarkers的文章不需要“挑”目的基因。但这并不代表不需要差异分析，有差异是前提！作者研究目的在于，找到可能在PDAC肿瘤微环境中诱导肿瘤免疫抑制的候选免疫检查点。本篇范文基于TCGA的RNA表达数据，分析PDAC病患者适应性免疫抵抗标志物的基因表达。通过免疫检查点基因将样本分类，并且观察到PD-L1（CD274）表达与IDO1具有显著的正相关性，表明二者呈现协同表达模式。并且发现许多PDAC肿瘤只上调了少数适应性免疫途径，但是在PDAC肿瘤的一个亚组中观察到了选择性适应性免疫抵抗途径的上调，包括PD-L1。

(Fig.1)

(二) “靠”——免疫检查点基因的临床预后意义

作者基于上述分析得到的PDAC亚组，进一步分析了免疫细胞亚群与PD-L1和IDO1表达的相互作用基于TCGA队列中基因表达的5年生存率(n = 152)。

5年总生存率(OS)的分析结果显示，PD-L1 (CD274)的肿瘤表达与PDAC的不良生存率相关，IDO1的表达也与不良OS相关 (图2A)。然而，在PDAC标本中，肿瘤微环境中的多个其他免疫检查点(如LAG3、TIGIT和TIM-3(透明质酸VCR2))的表达与生存率之间没有关联(图2B)。CTLA-4在肿瘤微环境中的表达与生存率的增加有一定的相关性。有研究表明，在许多肿瘤类型中，高密度的肿瘤浸润淋巴细胞是一个有利的预后指标。然而，基于TCGA数据的基因表达，我们没有发现肿瘤内任何典型免疫亚群标志物(包括CD8A、CD4、CD19或CD68)的表达与生存率之间存在任何显著关系。作者进一步分析了这些标记物与肿瘤分期之间的关系，结果同样没有观察到PD-L1 (CD274)或IDO1的表达与肿瘤分期间存在相关性。总之，PD-L1 和IDO1与不良的预后有关，CTLA4则与较好的预后有关。而LAG3、TIGIT等则与预后没有关系。

总之，以上分析中作者使用来自TCGA的RNA表达数据将免疫调节途径的肿瘤表达与5年生存率曲线相关联。

(Fig.2)

在确定PD-L1 (CD274)和IDO1表达导致PDAC预后不良后，作者随后研究了已知导致其表达的因素。尽管大多数胰腺癌的肿瘤突变负荷较低，但仍有一小部分胰腺癌存在错配修复缺陷(MMRd)，这导致无法修复肿瘤DNA中碱基对错配的错误，从而产生较高的肿瘤突变负荷。作者假设高肿瘤突变负荷可能导致肿瘤微环境中新抗原特异性CD8+淋巴细胞密度增加，从而上调肿瘤细胞如PD-L1 (CD274)或IDO1的适应性免疫通路。因此，作者研究了PD-L1病(CD274)或IDO1的表达是否与PDAC的肿瘤突变负荷相关，但结果并不具有统计学意义。TCGA-PAAD队列中只有两个样本的MMRd在MLH1、MSH2、MSH6或PMS2中有突变。

(三) “联”——免疫标记物之间的相关性分析

通过查阅文献，发现肿瘤微环境中的CD8+ T细胞可以产生干扰素-γ(IFNγ)，导致适应性免疫抵抗途径的上调，包括PD-1/PD-L1轴和IDO1。因此，作者分析了肿瘤微环境中CD8A或其他免疫亚群的表达是否与PD-L1 (CD274)或IDO1的表达相关(图3)。结果观察到CD8A和PD-L1 (CD274)，以及CD8A和IDO1之间，IDO1和PD-L1(CD274)的表达也存在正相关 (图3A-C)。PD-L1 (CD274)也可以由单核细胞谱系细胞表达，因此我们研究了PD-L1 (CD274)和CD68(巨噬细胞和其他单核细胞谱系细胞的标志)之间的关系。还观察到微环境中CD68和PD-L1 (CD274)表达之间的相关性(图3D)。PD-L1/IDO1表达和CD8A/CD68表达之间的联系延伸到颗粒酶B (GZMB)，一种CD8+ T细胞溶解活性的标记物和NOS2(也称为iNOS)，一种M1巨噬细胞表型的标记物(图3E-I)。

(Fig.3)

作者还检测了PD-L1 (CD274)和IDO1表达与Th1/IFNγ基因组合特征之间的关系(图4)。Th1偏向于分泌干扰素γ，主要负责激活抗肿瘤免疫反应。作者分析了PD-L1 (CD274)和IDO1的表达与Th1/IFNG基因特征相关性，即PDAC肿瘤免疫微环境中细胞毒性T细胞抗肿瘤反应的结果。提示PD-L1 (CD274)和IDO1的表达与Th1/IFNG基因特征相似。

(Fig.4)

(四) “靠”——分层生存分析

虽然CD8A表达（Th1/IFNγ）与PD-L1上调表达有关，但是有些患者却出现CD8A表达而对应的PD-L1表达缺失（无表达），因此还需研究CD8A High/Low与PD-L1-/PD-L1+对预后的影响。作者通过联合免疫调节途径和CD8A的表达，对患者5年生存率进行分层。虽然CD8A表达和Th1/IFNG基因特征与PD-L1 (CD274)表达相关，但一些患者在没有PD-1/PD-L1表达的情况下CD8A表达升高。因为PD-L1 (CD274)和CD8A的不同表达模式可能提示生物学和临床上潜在的不同生物学行为。于是，作者按CD8A表达分层，进一步分析了PD-L1表达升高或正常的患者的生存率(图5A)。虽然CD8A表达单独与PDAC的生存率无关，但5年生存率较好的患者CD8A浸润增加。当队列按IDO1和CD8A表达分层时，获得了相似的结果，高CD8A表达和低IDO1表达组显示最高的存活率(图5B)。这些数据表明CD8A和PD-L1(或IDO1)表达的联合分析产生不同亚型的PDACs。也就是说，结果提示了CD8A在缺乏PD-L1或IDO1表达的情况下的表达与PDAC存活率的提高有关。

(Fig.5)

(五) 独立队列IHC验证PD-L1和IDO1的表达与CD8表达的相关性

作者进一步将来自约翰·霍普金斯大学(n=33)的PDAC作为另一独立队列，验证TCGA-PAAD数据集。IHC的结果证了实PD-L1/IDO1的表达与患者存活率差之间的关系，以及CD8高表达 & PD-L1/IDO1表达低的亚型存活率提高之间的关系。作者对这些样本进行了PD-L1、IDO1和CD8染色，其中11个(33.3%)在肿瘤细胞上呈阳性表达，7个(21.2%)在肿瘤细胞上呈阳性表达。PD-L1状态或IDO1表达与任何临床肿瘤特征(包括病理分期、组织学分级、切除边缘、静脉或神经周围浸润)之间无显著相关性。与TCGA的数据一致，IHC结果显示PD-L1阳性表达的患者比没有检测到PD-L1表达的患者存活率更低（图6A）。在IDO1表达组中也观察到更差的存活趋势，但是没有达到统计学显著性的阈值(图6B)。在该队列中IDO1和PD-L1表达重叠，6/7的IDO1+样本对PD-L1也呈阳性染色。当将6个PD-L1+IDO1+样品与未表达任一标记物的样品进行比较时(n=21)，可以看到生存曲线的明显分离（图6C）。

对比TCGA-PAAD队列，在没有PD-L1 (CD274)表达的情况下CD8A的高表达与生存率升高有关。鉴于PD-L1+病例数量较少，我们将队列分为三组:PD-L1+组、PD-L1-/CD8低组和PD-L1-/CD8高组。同样，与我们之前的TCGA研究结果一致，在没有PDL1表达的情况下CD8高表达的患者组(PD-L1-/CD8高表达)的存活率最高，而PD-L1+病例和PD-L1-/CD8低表达病例的存活率相似(图6D)。根据IDO1和CD8表达的分层分析仅显示了IDO 1/CD8 HiGH亚型预后改善的趋势(p = 0.11图6E)。

(Fig.6)

思路总结

免疫检查点疗法在未选择的胰腺腺癌(PDAC)病例中未能证明有意义的临床益处，但已知PDACs的一个亚组上调了参与获得性免疫抑制的通路。进一步描述PDAC的免疫亚型对于改进临床试验设计和识别可能受益于免疫检查点疗法的患者是必要的。本文总体是一篇免疫相关的预后型生信文章，从PD-L1和CD8表达谱确定了胰腺导管腺癌的一种免疫亚型，具有良好的生存率。本文仍然是从一个临床问题出发，通过聚类分组，比较组间差异。然后是发现新分子，确定新亚型，继续分析生存预后这样的套路。作者通过两个不同的队列的分层生存分析，支持了积极的抗肿瘤免疫反应是PDAC长期生存的特征的观点，并促进了新的PDAC免疫生物标志物开发，及潜在的新的免疫疗法以改进患者选择的机会。

作者发现在适应性免疫抗性途径中，PD-L1和IDO1的表达分别与低生存率相关。尽管CD8表达单独与生存率无关，PD-L1和高CD8表达联合分析能够得到具有良好生存率的亚型。于是，作者推测可能存在PD-L1+/CD8高PDAC患者的子集，对这样的人群来说，阻断PD-1途径可以提高CD8+ T细胞反应，从而提高生存率。由此出发，通过查阅文献，作者发现已有研究确定了“免疫原性”疾病子集的存在，但并没有进一步的分层分析。从前面的结果中，作者认为IDO1的表达与PDACs的不良生存率相关，这与以前的观察结果一致。另一个发现是，在PDAC几乎没有免疫检查点的聚集，一部分患者高度表达至少一种适应性免疫抵抗途径。

查阅文献发现已有研究表明，肿瘤细胞上的PD-L1表达可由IFNγ诱导，作为抗肿瘤T细胞反应的结果，CD8+ T细胞构成抗肿瘤免疫的主要效应因素。因此，作者着重分析了PD-L1表达和CD8表达之间的相关性。紧跟着就是生存预后分析，在得到PD-L1/CD8表达亚型的不同存活结果，作者也同时强调了PDAC中PD-L1表达时考虑CD8表达的重要性。

总之，在这项研究中，文章主要的工作是利用TCGA和GEO临床生存数据和基因表达数据来构建免疫调节途径和免疫亚型标记之间的关系，以及对肿瘤患者存活的影响。作者根据免疫调节途径的表达和CD8A的表达分析了一种PDAC亚型。基于这个亚组进行了不同分层的生存分析，以探讨其临床相关性。最后，使用自己的临床样本作为独立队列，通过IHC佐证分析结果。

文章得到的结论总体分为三大部分：

① “靠”——生存意义。高PD-L1表达与PDAC的不良生存率相关；

② “联”——分子间相关性及分层分析 PDAC中PD-L1表达与CD8A表达、IDO1表达和Th1/IFNγ基因特征相关；

③ 尽管CD8A浸润密度本身并不能预测PDAC存活率的提高，但PD-L1/CD8高表达确定了PDAC存活率良好的亚型。

相对于前两周分享的免疫相关生信文章，本篇范文在思路框架和数据分析上，应该更加适合想要从免疫方向入手的小伙伴们。大家可以再结合三篇文章，综合回顾学习，相信大家会在理解免疫相关的生信文章有新的高度。好啦，后台回复“免疫亚型”获取范文文献吧~我是你们的菠小萝，我们下周再见吧，拜拜！

参考文献

[1] Danilova L, Ho WJ, Zhu Q, Vithayathil T, De Jesus-Acosta A, Azad NS, Laheru DA, Fertig EJ, Anders R, Jaffee EM, Yarchoan M. Programmed Cell Death Ligand-1 (PD-L1) and CD8 Expression Profiling Identify an Immunologic Subtype of Pancreatic Ductal Adenocarcinomas with Favorable Survival. Cancer Immunol Res. 2019 Jun;7(6):886-895. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-18-0822. Epub 2019 May 1. PMID: 31043417; PMCID: PMC6548624.

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