年初重磅福利！0实验轻松发表6分+~包你2021开年红！
领略高端套路，发表高分文章！
小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。在上一期的肿瘤免疫微环境范文解读后，小伙伴们是不是对免疫景观有了比较深入的理解呢？免疫方向是当今肿瘤研究的大热门，必须不能少了生信的存在！继上周起，菠小萝将为大家连续解读不同的免疫景观相关高分生信文章，带大家深入学习免疫景观生信套路。我们上一期的范文是利用自己的临床数据，并且有一些免疫组化和RNA-seq结果的支持。今天我继续来分享更加适合初学者一篇纯生信文章，于2020年3月发表在《Cancers》上，最新影响因子6.126。题目是“Immune Cytolytic Activity for Comprehensive Understanding of Immune Landscape in Hepatocellular Carcinoma”。文章整体通过免疫细胞溶解活性全面了解肝细胞癌的免疫景观。
疾病：Hepatocellular Carcinoma （HCC）；
目的基因：Unknown；
数据来源：Unknown；
机制：免疫细胞溶解活性；
研究目的：全面了解肝细胞癌的免疫景观。
Ps：本文的题目比较宽泛，可以从摘要中了解到作者这里使用的是单数据库的mRNA数据分析，是一项包含371例TCGA-LIHC患者样本的队列研究。
T细胞通过向T细胞表达T细胞耗竭标记物或“刹车”，效应功能的逐渐丧失。T细胞衰竭标志物的识别和随后在癌症免疫方面的深入研究推动了免疫检查点抑制剂(ICIs)的发展。肿瘤免疫原性是ICI逆转T细胞衰竭的先决条件。新的证据显示ICIs的抗癌效果取决于肿瘤微环境(TME)的特点，因为它们需要有功能的细胞毒淋巴细胞。具有大量肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的TME，如细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞M1，被称为“热”或“免疫炎症”，而具有免疫抑制淋巴细胞(如调节性T细胞)的“冷”TME则是“热”或“免疫炎症”。可以想象，ICIs在“热的”TME中是高度有效的，因为TILs的高密度可以识别大量的肿瘤特异性抗原及其不同的受体。同样，也发现了一些ICIs的预测性生物标志物，如PD-L1的高表达、错配修复缺陷以及肿瘤突变负荷的增加。
癌症的突变增加是由多种机制引起的，包括外源性诱变剂和内源性过程。这些大家都太熟悉了，我就不过多展开了~另一方面，ICIs的阴性预测因子，即所谓的“免疫排斥”，也在各种癌症中进行了研究。β-catenin通路激活或CTNNB1评分升高可导致T细胞排斥，并在黑素瘤和肝细胞癌(HCCs)中显示出对ICIs的耐药性。然而，作者认为目前仍然缺乏ICIs的可靠预测因子，以便根据免疫景观对患者进行分层，进行适当的免疫治疗。
Rooney等人报道了一种基于颗粒酶a (GZMA)和穿孔素1 (PRF1)表达水平的免疫细胞溶解活性(CYT)定量测量方法，细胞毒性T细胞活化显著上调了颗粒酶a (GZMA)和穿孔素1 (PRF1)的表达水平。细胞毒性T细胞主要利用这两种酶杀死癌细胞;穿孔素是靶细胞膜上形成孔的一种酶，颗粒酶通过孔进入靶细胞膜，激活caspase无关的凋亡细胞。然而，有研究表明由于GZMA和PRF1对异质性肿瘤中细胞毒性T细胞非常特异性，在15个肿瘤样本中，CYT通过基因表达来衡量抗肿瘤免疫，而不是通过IHC简单地通过TILs密度预测T细胞功能。CYT最大的优点是它的广泛可用性和可重复性，且成本不高，因为它只需要从肿瘤中获得GZMA和PRF1的RNA序列。
于是，作者以此为着手点，分析高CYT的HCC是否具有更强的免疫原性和良好的免疫TME，能否创造更好的肿瘤生物学和临床结果。
让我们通过摘要了解一下这篇文章的主要思想，首先呢作者应用了一个有用的基础免疫标记物，叫做细胞溶解活性评分（CYT），它是由GZMA和PRF1表达来确定的。作者做出了一个假设，认为CYT评分高的肝细胞癌（HCCs）具有更强的免疫原性和良好的肿瘤微环境，因此会有较好的临床结果。文章就是以该假设为基础对HCC患者肿瘤免疫微环境进行了鉴定。好啦，让我们一起来看一看作者都做了哪些研究吧~
作者通过TCGA-LIHC获得临床和基因组数据。从cBioportal下载临床和拷贝数信息。从GDC portal获得基因表达和突变数据。为了计算CYT，作者使用的是基因表达数据每百万转录本（TPM）格式。然后进行了RNA-seq数据预处理和数据标准化，剔除没有基因表达数据的样本后，将371名患者纳入研究。
本篇范文主要分析的重点是细胞溶解活性评分（CYT）。作者将CYT定义为TPM中GZMA和PRF1表达值的平均值。由CYT的中位数确定了CYT高组（n=185）和CYT低组（n=186）。
肿瘤免疫微环境套路文章中必不可少的就是免疫浸润的分析，作者这里使用的是CIBERSORT和TIMER方法，估算肿瘤免疫微环境（TME）中浸润的免疫细胞组成。CIBERSORT和TIMER分别通过在线计算器使用每个肿瘤组织中的RNA序列数据可以计算22种和8种免疫细胞类型的比例。由于TIMER与CIBERSORT相比仅能计算8种免疫细胞类型，因此它没有能力区分特定的免疫细胞类型。最后使用Mann-Whitney检验比较TCGA LIHC队列中CYT高（n=185）和CYT低（n=186）肿瘤之间的每个免疫细胞组分。接下来就是组间的GSEA富集分析。
作者整理出TCR丰度和BCR丰度值，以分析TCR多样性。通过使用每个样本中独特的CDR3细胞的数量除以TCR区域中的总读取计数来测量TCR多样性，并表示为每kilo读段克隆型（CPK）。HLA-A和HLA-B是HLA-A/B基因的表达水平。随后，作者通过取体细胞样本和正常样本之间的片段平均变化之和≥0.6或≤-0.4来定义体细胞拷贝数改变（SCNA）。最后用Mann-Whitney检验比较组间的各项评分。
当然，生存分析必不可少，作者在CYT高和低组之间比较了无进展间隔（PFI），无病间隔（DFI），疾病特异性存活率（DSS）和总生存期（OS）。通过Kaplan-Meier图描绘生存差异。同样地，用TCR的中值将PFI、DFI、DSS和OS在TCR高和低的两组之间进行比较。并通过构建Cox风险模型，对包括年龄，性别，分期，病毒感染状态，邻近的肝炎状态在内的多种临床变量进行预后分析。
（一）临床基线资料
作者首先列出了TCGA-LIHC患者基线资料，队列包含185例(49.9%)患者的CYT高值，186例(50.1%)患者的CYT低值。颗粒酶A和穿孔素基因表达在该队列中分布正常(图S1a)。与正常肝组织相比，HCC中CYT含量较低(p = 0.019，图S1b)。这可能是由于TME中包括免疫细胞在内的基质细胞较少所致。一般来说，癌症组织中的免疫系统被认为比正常肝脏组织的免疫系统更不活跃。根据基线资料表，TCGA的LIHC队列中185例患者的CYT高，186例患者的CYT低。作者发现与正常肝组织相比，HCC中的CYT较低。这可能是由于基质细胞较少，包括TME中的免疫细胞。通常，与正常肝组织相比，癌组织中的免疫系统被认为活性较低。结果显示，除了通过免疫组织化学（IHC）检测到TIL的存在外，CYT高和CYT低组之间的临床人口统计学没有显著性差异（p <0.0001，表1）。
（表1）
(图S1a)
（二）表达差异及相关性分析
1
CYT和APOBEC3家族基因表达的相关性
在高突变负荷的肿瘤中，已经观察到高突变负荷与ICIs的最高应答率之间存在相关性。据报道在多种肿瘤类型中，细胞溶解活性与新抗原负荷和突变负荷呈正相关。APOBEC3家族成员是引起各种癌症的DNA突变和RNA编辑的突变酶，促进了癌症的异质性。因此，作者研究了CYT高的HCCs中APOBEC3成员的基因表达情况，并分析了CYT高、低组间APOBEC3家族个体基因间的表达差异。结果发现，CYT高表达的HCCs与APOBEC3家族成员的显著高表达相关(图1a)。接下来作者通过定义APOBEC3评分，取以下分子的转录本每百万(TPM)的对数平均表达量得出的:APOBEC3A、、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G和APOBEC3H。这一评分在CYT高的肿瘤中也有所升高(图1b;p < 0.001)。此外，作者还研究了TME的突变负荷。发现在CYT高、低组间存在的突变负荷并没有不具有显著差异(图S1d;p = 0.40)。可能的原因有HCC中总体突变负荷相对较低。并且在体细胞拷贝数改变(SCNAs)方面，高CYT组也较低CYT组明显减少(图1c;p = 0.003)。
(图1）
(图S1d）
2
CYT高组的HCC样本具有较高的抗癌免疫细胞浸润，促癌免疫细胞浸润明显降低
作者接下来深入探讨HCC的免疫景观，分析了CYT与CIBERSORT和TIMER中肿瘤浸润免疫细胞组成的关系。CIBERSORT分析表明，高CYT的肿瘤具有很高的抗癌免疫细胞浸润性，例如细胞毒性T细胞（图2a），γ-δ T细胞（图2b），M1巨噬细胞（图2c）和活化的记忆CD4 + T细胞（图2d）。相反，CYT高的肿瘤对促癌免疫细胞的浸润明显较低，如中性粒细胞（图2e）、M2巨噬细胞（图2f）和调节性T细胞（图2g）。TIMER显示高CYT的HCC对各种免疫细胞的浸润明显更高（图2h–l）。然而，除了CD8+T细胞外，TIMER没有区分抗癌和促癌免疫细胞类型的能力。
（图2）
3
CYT与肿瘤浸润淋巴细胞受体遗传多样性有关
范文的研究重点在于探讨CYT高、低组间的免疫浸润差异发挥了什么样的作用。那么，除了浸润性免疫细胞以外，同样需要分析其他细胞免疫成分。作者发现在高CYT的HCC中，主要组织相容性复合体（MHC）-I的关键分子人类白细胞抗原（HLA）-A和HLA-B的表达明显较高（图3a，b）。抗原特异性T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）也是免疫系统识别恶性细胞和病原体的重要特征。作者发现CYT高的HCC与TCR丰度，BCR丰度和TCR多样性的升高显著相关（图3c-e）。
（图3）
4
CYT与T细胞衰竭标志物的表达相关
接下来仍然是组间的表达差异，作者分析了这么多的相关性，明星Biomarkers怎么能放过呢！作者继续分析CYT和调节性T细胞标记基因表达之间的联系。几乎所有主要的T细胞衰竭标志物在CYT高的HCC中都有显著的高表达，包括PD-1、PD-L1、CTLA4、IDO1、IDO2、LAG3、TIM3、PD-L2， TIGIT、ADORA2A和VISTA（图4a）。并且由关键的T细胞衰竭标志物表达产生的免疫抑制检查点在CYT高的HCC中显著升高（图4b）。
（图4）
（三）功能富集
由于CYT高的HCC已显示出更强的免疫原性，作者进行了GSEA分析研究其潜在机制。结果显示CYT高HCC与免疫反应相关基因集显著相关，如防御反应、免疫应答、炎症反应、免疫系统过程，T细胞活化和先天性免疫应答（表2）。这些结果表明在高CYT的HCC中发生先天性免疫和适应性免疫之间的串扰，并且可以通过使用CYT适当地选择免疫原性HCC。总之，GSEA富集分析表明，与免疫应答相关的基因集在CYT高HCC中显著富集。
（表2）
（四）临床意义
1
生存预后分析
在上述研究中，已分析了CYT高、低组间免疫浸润的差异，接下来就是要分析这个差异具有什么样的临床意义。于是，作者进一步研究了TCR丰度对HCC生存的影响。由于CYT高的肿瘤具有良好的肿瘤免疫微环境，作者推测CYT高的肿瘤具有更好的生存率。作者发现高CYT的肿瘤的PFI和DFI明显更长（图5a，b），以及更好的DSS（图5c）和OS（图5d）。总体的结果显示高TCR的肿瘤显著改善了PFI，DFI和DSS，而对于OS没有显著差异。于是，作者进一步比较了按CYT和TCR分层的OS。与TCR无关，CYT较高的患者表现出明显较长的OS，很可能是由于CYT和TCR之间的显著相关性(p = 0.014;图S3)。这些结果反映了增加的TCR丰度会增强抗癌免疫。总体而言，CYT高组肝癌患者的PFI和DFI明显更长，预后更好。
（图5a-d）
（图S3）
2
在得到了生存分析结果后，作者并没有戛然而止，而是继续通过Cox多因素回归分析确定影响HCC患者生存的预后因素。在表3中，作者根据四种主要的T细胞衰竭标记物（PD-1、CTLA4、PD-L1和LAG3）表达的进一步分层，分析了高CYT是HCC患者生存的重要预后因素之一。由每个标记物的中值分为两组，CYT低/衰竭高组的总体存活率最差，而CYT高/衰竭低组的总体存活率最好（图5e-h）。最后作者进一步比较了由CYT和TCR分层的OS。CYT较高的患者无论TCR如何均显示OS明显更长，最有可能是由于CYT与TCR之间的显著相关性。
（表3）
（图5e-h）
本项研究是基于TCGA-LIHC数据集中符合要求的371名患者的队列研究。既然是队列，就是要基于一种分组。肿瘤免疫微环境套路文章中必不可少的就是免疫浸润的分析，作者通过CIBERSORT和TIMER方法，估算肿瘤免疫微环境（TME）中浸润的免疫细胞组成。并根据TPM中GZMA和PRF1表达值的平均值定义了CYT。由CYT的中位数确定了CYT高组（n=185）和CYT低组（n=186）。作者整理出TCR丰度和BCR丰度值，以分析TCR多样性。随后作者用大量篇幅描述了自己所作的组间的差异表达以及相关性分析，包括APOBEC3家族基因表达差异、体细胞拷贝数改变(SCNAs)差异、各种免疫细胞的表达差异、肿瘤浸润淋巴细胞受体、T细胞衰竭标志物表达差异等。并通过这样的组间差异进行GSEA富集，结果支持强烈的免疫反应富集。这与抗肿瘤免疫细胞的高浸润及T细胞衰竭标志物在这些肿瘤中的显著表达一致。于是，作者推测，在CYT高的HCCs的TME中，先天免疫应答和适应性免疫应答之间发生了活跃的交互作用。并进一步利用CYT分析列TME的免疫景观。分析T细胞和B细胞库的多样性与淋巴细胞识别抗原的能力密切相关，而且增加的TCR储备与更好的临床结果之间的联系反映了这一点。
随后，作者还进行了进一步的分层分析，根据免疫环境对肿瘤进行亚分类，确定了另一种分组。其中一组以表达适应性免疫应答基因为特征，另一组以表达免疫抑制信号为特征。由此能够分析CYT和T细胞衰竭标记物的表达相关性。
最后的生存分析和临床预后因素是必不可少的，作者在CYT高和低组之间比较了无进展间隔（PFI），无病间隔（DFI），疾病特异性存活率（DSS）和总生存期（OS）。通过Kaplan-Meier图描绘生存差异。同样地，用TCR的中值将PFI、DFI、DSS和OS在TCR高和低的两组之间进行比较。并通过多因素Cox回归分析构建风险模型，对多种临床变量进行预后分析。
这篇范文着重CYT这个点描述了HCC的免疫景观，对其中的各种免疫相关Biomarkers都做了比较充分的差异分析和相关性分析，并探讨了预后价值和影响HCC预后的因素。逻辑清晰，分析也是比较深入的。纯生信文章写到中国程度可以说是非常不错了，思路也是推陈致新！好了，本次分享就到这里了，我是菠小萝~后台回复“CYT”获取范文全文和补充材料哦~我们下周再见吧，拜拜!
往期传送门
重磅最新消息！DeepMind首次突破蛋白折叠的历史难题，这项AI技术能否成为生信领域的下一匹黑马？
欢迎大家关注解螺旋生信频道-挑圈联靠公号~
—
END—
撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
值班 | 风风
主编丨小雪球
最新评论
推荐文章
作者最新文章
你可能感兴趣的文章
Copyright Disclaimer: The copyright of contents (including texts, images, videos and audios) posted above belong to the User who shared or the third-party website which the User shared from. If you found your copyright have been infringed, please send a DMCA takedown notice to [email protected]. For more detail of the source, please click on the button "Read Original Post" below. For other communications, please send to [email protected].
版权声明：以上内容为用户推荐收藏至CareerEngine平台，其内容（含文字、图片、视频、音频等）及知识版权均属用户或用户转发自的第三方网站，如涉嫌侵权，请通知[email protected]进行信息删除。如需查看信息来源，请点击“查看原文”。如需洽谈其它事宜，请联系[email protected]。
版权声明：以上内容为用户推荐收藏至CareerEngine平台，其内容（含文字、图片、视频、音频等）及知识版权均属用户或用户转发自的第三方网站，如涉嫌侵权，请通知[email protected]进行信息删除。如需查看信息来源，请点击“查看原文”。如需洽谈其它事宜，请联系[email protected]。