TCGA太俗套？自己的临床数据搞起来照样发高分！
领略高端套路，发表高分文章！
好啦~我们进入正题吧~好久没有提到免疫相关的文章了，2021年的1月菠小萝将以“免疫景观”为专题，带给大家不一样的生信套路套路~很多小伙伴都是临床医生，有大把的宝贵的临床资料呀~生信文章如果用上自己的数据，再用公共数据库验证，听着就很完美，很有意义是不是呢！绝对是学术界今天菠小萝带给大家的就是一篇利用自己的数据，结合大型公共数据库验证的“干湿结合型”生信文章。
今天我们就来解读一篇6分+纯生信文章，看作者如何顺应潮流，一蹴而就！也感谢作者为我们提供了很好的学习典范！范文于2020年4月发表在《CLINICAL CANCER RESEARCH》上，题目为“A four-chemokine signature is associated with a T cell-inflamed phenotype in primary and metastatic pancreatic cancer”，最新影响因子：8.738。
从本月开始，菠小萝将在高分文献精析栏目做出一些升级~我一直在思考该如何更有效的让小伙伴们快速读懂高分生信文章？因为菠小萝同我们所有解螺旋的学员一样，都获益于酸菜校长的36策！我再次重温了酸菜校长的经典。终于！我发现题目要素拆解文献解读的第一步，酸菜校长的“题目四要素”拆解真的是一项伟大的创作！于是，我也试着学习校长的套路，将题目要素拆解的原理运用到生信文章当中。那么生信文章题目都具备哪些要素呢？首先是疾病，然后非常重要的就是研究对象，或者可以理解为目的基因。可以是单基因/基因家族/单细胞等等；当然数据来源是非常重要的，决定了文章的层次。另外，决定文章层次的还有一个更为重要的因素，就是机制！在学过酸菜校长36策后，我们都知道要深入研究机制才能提高文章的档次~生信文章的机制同样非常非常重要！机制就是说明了一个“How”的问题，也就是研究对象如何达到研究目的。间接机制很多呀，比如“圈”出分子的功能意义，“联”出分子间的相关性和网络构建，去说明一些问题。我们的当然也可以有位点分析的直接机制预测！接下来就是生信文章有最主要的几大文章类型，也可以说是研究目的，包括诊断型、预后型，以及综合性文章。其中综合性文章包括诊断&预后综合性套路，还有一些分析特殊的机制类型的文章，比如肿瘤微环境/免疫微环境/免疫逃逸机制等高端一些的套路。创新性可以体现在分子、功能和套路上，想在套路上创新，老司机可以尝试一下~刚上手生信的小伙伴们还是找找新分子和新功能比较稳妥了。
我们今后解读文章的第一步就要先来按照①疾病；②目的基因；③数据来源；④机制；⑤研究目的这五个要素来拆解文章题目，快速构建文章整体逻辑框架！
疾病：primary and metastatic pancreatic cancer ；
目的基因：A four-chemokine signature (CCL4、CCL5、CXCL9、CXCL10)；
数据来源：Unknown；
机制：T cell-inflamed phenotype；
研究目的（文章类型）：肿瘤微环境相关的文章。
Ps：至于是诊断型还是预后型还需要阅读摘要定性。但通过分组（原发性肿瘤 vs. 转移性肿瘤）情况，诊断型模式文章可能性更高~
我们将从文章题目了解到的信息综合一下，按照“挑圈联靠”的思路猜测一下文章有可能的行文逻辑~首先，因为本文的题目就是4-趋化因子，因此推测作者可能仅从趋化因子中挑取了一些合适的分子，而不是大批量的筛DEGs。不过，如果大家自己写文章，也可以通过“挑”原发性PDAC vs. 转移性PDAC得到一组DEGs。因为文章题目中明确提到“associated”，非常明显是在探讨4-趋化因子与浸润性T细胞的相关性。就好像我们在题目中找到“via”就知道是嵌套~由此，我们推测文章中可能通过“联”的思路，使用大量篇幅去分析分子间的相关性，进一步筛选与肿瘤微环境浸润性免疫T细胞的Hub基因。还需要“靠”有生存意义的预后相关Hub基因。接下来是“圈”，论证与免疫表型相关功能富集等等。
通过了解文章的数据来源，发现该项研究是一项队列研究，测试队列是作者自己的数据。包括113例原发性切除的PDAC癌组织和107例PDAC肝转移组织。验证队列包括来自TCGA的182个PDAC样本和来自澳大利亚ICGC的92个PDAC样本。有效的免疫检查点阻断疗法需要在肿瘤微环境中激活CD8+ T细胞。尽管有很多PD-L1表达与CD8+T细胞相关的生信文章，但本篇范文在差异分析和相关性分析上非常深入，创新性也比较强。
同时，文章中有比较丰富的免疫组化和RNA-seq结果支持。其中免疫细胞定量使用了组织微阵列(TMA)，检测肿瘤内CD3，CD8，CD4和FOXP3。分析了具有CD8+TILs和RNA-seq的79例原发灶切除PDAC用于分析趋化因子表达与CD8+TILs浸润。
我们都知道胰腺癌一起极低的5年生存率而被称为“癌中之王”，胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌的主要病理类型，其5年生存率约9%。且大多数PDAC在确诊时就已伴有肝脏转移，了解PDAC中潜在的免疫生物学驱动效应以及CD8+ T细胞浸润情况，在PDAC的早期诊断中具有很重要的影响，有助于确定患者的免疫治疗策略。免疫检查点抑制剂在PDAC中仍然普遍无效的原因，主要由于免疫微环境中调控功能性抗肿瘤T细胞的分子机制了解有限，治疗反应生物标志物仍然缺乏。
目前针对CTLA4和PD1/PDL1的免疫检查点抑制剂需要激活的效应抗肿瘤CD8+ T细胞的浸润环境。对于一些具有高肿瘤突变负荷(TMB)和基因组不稳定性的癌症能够表现出较高CD8+浸润和良好的预后，如微卫星不稳定结直肠癌。而有研究表明PDAC的TMB较低，其驱动因素是染色体不稳定性。然而，一小部分预后较好的PDAC患者表现出大量的CD8+ T细胞浸润，表明这是一种潜在的抗肿瘤免疫治疗驱动因素。于是，作者就以此为免疫治疗疗效的差异入手，说明其中可能存在的潜在机制。
接下来，由于文章是围绕免疫治疗疗效开展的，且已有多项研究证实在不同肿瘤中，CD8+浸润与趋化因子密切相关。因此，趋化因子的表达可以作为PDAC中现有的和新的免疫治疗策略的预测生物标志物。也是从这点出发，作者对于目的基因的选择上并没有直接去筛DEGs，而是考虑了免疫治疗临床应用价值。有研究表明趋化因子能够驱动启动效应T细胞募集到肿瘤中。由此，作者认为找到有临床价值和意义的趋化因子，比单纯的筛DEGs更能说明问题。
除了DNA错配修复或同源重组缺陷的罕见病例外，大多数胰腺导管腺癌(PDAC)病例中不存在CD8+ T细胞浸润的预测因子，包括高肿瘤突变负荷和新抗原负荷。在本研究中，作者发现PDAC中的CD8+ T细胞浸润与四种趋化因子直接相关。这种4-趋化因子标记标记了具有广泛免疫组化和转录标记的抗肿瘤反应的患者亚群，包括预测其他肿瘤免疫治疗反应的基因集。并且作者在原发部位和转移部位观察到这种关系，提示了一种与PDAC免疫生物学相关的保守机制。因此，作者认为该4-趋化因子签名表达可以作为PDAC中现有的和新的免疫治疗策略的预测生物标志物。
（一）“挑”——表达差异
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与CD8+ T细胞浸润与相关的特异性趋化因子
作者在“挑”分子这一环节非常值得大家学习与借鉴。他是从常识出发，从理论上就直接过滤掉大批没有实际意义的DEGs。我们都知道CD8+ T细胞与肿瘤细胞之间的直接接触是有效抗肿瘤杀伤的先决条件。
第一步，仍然是“表达差异”，但作者没有比较DEGs，而是比较了免疫细胞浸润的组间差异。开篇就来个简单的免疫组化(IHC)实验验证，确定与肿瘤细胞直接接触的CD8+细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的数量，不要太给力~结果在图1A中体现，CD8+ TILs在部分病例中缺失，而大多数PDAC样本中CD8+ TILs数量不同。细胞浸润有差异，并且从大量研究型文章中可以得知这样的差异影响免疫治疗的疗效，那是什么原因导致的这些差异呢？作者还是通过查阅文献，将其定位于特异性趋化因子的表达。于是，79例患者的RNAseq用来分析40种已知的人类趋化因子表达与CD8+ TILs浸润是否相关。发现只有4种与CD8+ TILs计数呈正相关且显著相关，即CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10(图1B)。然后又是一波免疫组化，在原发性切除队列中证实了这4种趋化因子在PDAC组织中的蛋白表达(n = 10)(图1C)。
（Fig.1A-C）
问题又来了，这4种趋化因子的表达是否与肿瘤细胞邻近的CD8+ TILs直接相关，还是由突变负荷（TMB）的潜在差异导致的呢？作者又评估了单核苷酸变异(SNVs)数量和新抗原计数的潜在关联。发现CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达与SNV(图1D，上)和新抗原计数(图1D，下)均无相关性。此外，在PDAC肿瘤中SNV和新抗原计数均与CD8+ TILs无关(图1E，左)，而14例MMRd/HRD患者是显著相关的(图1E，右)。总之，CD8+ TILs作为T细胞炎症性肿瘤的组织学指标，在PDAC肿瘤细胞邻近的CD8+ TILs的数量与4种特异性趋化因子(CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10)的表达直接相关。
（Fig.1D-E）
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4-趋化因子通过独特的免疫特性区分PDAC患者
在确定了与CD8+ TILs直接相关的4-趋化因子后，“表达差异”这部分还没有结束，找到目的分子后的差异分析才是重点！接下来，作者评估了PDAC中CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达是否存在共调控或标记独立的患者亚群。根据113例未经治疗的、非MMRd/HRD、肿瘤富集、可切除的PDAC的RNAseq数据进行无监督分层聚类结果，作者发现所有四种细胞因子表达水平之间存在显著相关性(随后被称为“4-趋化因子签名”)，并以相关性热图展示(图2A)。CXCL11表达也与CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10表达相关(图2A)，但由于与CD8+ TIL计数缺乏强正相关，CXCL11未被纳入签名中。
为了深入了解这四种趋化因子在PDAC免疫生物学中的作用，作者基于CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10共表达均值的四分位数，将队列分为三组：4种趋化因子-高(n=29)；4种趋化因子-中(n=55)和4种趋化因子-低(n=29)。差异基因表达分析显示，与4趋化因子-高组相比，4趋化因子-低组中有245个上调基因和35个下调基因(图2C，左)。其中最主要的上调基因是IDO1——一个T细胞衰竭的标志(图2C，右)，并且100位上调的15个基因中有62个具有众所周知的免疫相关功能。总的来说，基于4种趋化因子-高和4种趋化因子-低分组使用edgeR包进行差异分析，火山图显示了各种功能的差异基因；热图显示了4种趋化因子-高组具有更多的免疫活性相关基因(IL2RB，IL2RA，ZAP70，ITK，CD8A，CD3E，CD38)。
（Fig.2A-C）
(二) “圈”——功能富集
在上述edgeR包差异分析后得到了差异基因，经去除CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10后，作者进行了GSEA分析，并使用Cytoscape进行可视化。结果显示，4种趋化因子-高组中富集固有免疫相关通路(如免疫活化，MHC-II呈递和抗原呈递相关的通路，以及KRAS信号通路上调等)(图2D)。综上所述，共同调控的4趋化因子信号的表达水平表明了人类PDAC免疫特性的主要差异。
（Fig.2D）
（三）“联”——分子间的相关性
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在原发性PDAC中，不同的免疫细胞谱与4-趋化因子签名相关
基于4- chemokinehi与4-chemokinelo PDAC肿瘤之间免疫相关基因和通路表达的差异，接下来作者分析了两组患者的免疫细胞谱。他使用ssGSEA确认了4种趋化因子-高组具有更高活性的免疫细胞浸润，并且树突状细胞(包括激活的和未成熟的)、中性粒细胞和B细胞的标记分数也升高(图3A)。利用IHC证明了原发性PDAC组织中具有更多数目CD8+T，CD3+T和FOXP3+细胞，然而CD4+T细胞在2组之间无明显差异(图3B)。但作者同时观察到FOXP3+ T调节细胞在这组中增加，这表明启动了一种抗肿瘤反应，从而触发了调节反应。
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4-趋化因子签名与原发性PDAC的T细胞炎性转录特征有关
之前的分析提示4趋化因子-高组表现出具有显著增高的免疫细胞溶解活性得分（CTY）(提示功能活跃的细胞毒性淋巴细胞；图3B)，T细胞共刺激程度和IFN-I/II表达(图3C)。此外，4趋化因子-高组具有更高的免疫检查点相关基因的表达(图3D)和T细胞炎性相关表达谱(图3E）。
（Fig.3）
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4-趋化因子签名与原发性PDAC的抗原递呈细胞(APCs)和固有免疫通路相关
通过查阅文献，作者得知有效的T细胞应答依赖于抗原的呈递和抗原递呈细胞(APCs)对T细胞的诱导。于是，作者探究了APCs成熟和免疫系统固有臂各自参与的过程，并发现4趋化因子-高组具有更高水平的MHC-I，共刺激APC(图4A)和Batf3依赖的树突状细胞得分(图4C)。此外，IHC证明了CD11C(DCs标志物)和CD8(CD8+T细胞标志物)均存在于4种趋化因子-高组的组织中。作者进一步观察到干扰素基因刺激因子(STING)和NLRP3炎性小体通路在4-chemokinehi组中上调，这2个基因集的ssGSEA分析中显示了4种趋化因子-高组具有更高的得分(图4D)。总之，这些数据表明，4-趋化因子在PDAC中的表达与固有免疫传感途径和APCs活化有关，这对T细胞激活至关重要。
（Fig.4）
（四）公共数据库验证——ICGC和TCGA队列分析
首先是验证分子间的相关性。4-趋化因子签名的表达在TCGA队列中呈显著正相关(图5A)。然后是聚类分析表达差异的结果验证（图5B）。以及免疫细胞特异性基因集表现出不同的表达模式及通路富集，包括免疫评分等4种趋化因子-高组在免疫细胞，CTY得分，T细胞炎性的ssGSEA得分，免疫检查点相关基因，树突状细胞得分和细胞因子得分均显著高于4-趋化因子-低组(图5D-H)。ICGC队列与上述结果一致。
（Fig.5）
（五）“靠”——临床表型分析
PDAC肝转移组显示出T细胞炎性表型
在上述分析中，作者探讨了4-趋化因子签名的免疫相关功能及与分子间的相关性，还需要将这些结果与肿瘤的特征相联系，也就是去靠临床。不同于以往的生存分析，作者选择了联系临床免疫相关表型。他接下来需要确定4-趋化因子签名与抗肿瘤表型的关联在PDAC肝转移中是否保守。为此，作者分析了107例来自前瞻性试验的肿瘤强化肝脏活检，也就是对肝脏转移的PDAC进行分析。以相关性热图显示PDAC肝转移样本中CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10表达呈现显著正相关 (图6A)。并将趋化因子表达水平进行分组后分析免疫细胞，CTY得分，T细胞炎性的ssGSEA得分，免疫检查点相关基因，DCs得分和细胞因子得分在4种趋化因子-高组和4种趋化因子-低组的差异，结果显示肝脏转移的PDAC也具有T细胞炎性的特征(图6)。最后，作者总结了用于解释PDAC中抗肿瘤免疫力的互补机制模型(图6G)：最后得出结论：在MMR/HRD PDAC中，经典的免疫治疗预测标志物(如TMB)将更为适用；而对于非MMR/HRD PDAC而言，4种趋化因子signature(CCL4，CCL5，CXCL9和CXCL10)可能更有利于区分T细胞炎性与否这一表征。
（Fig.6）
在本篇范文中，作者展示了趋化因子在PDAC中建立活跃的T细胞介导免疫的潜在作用。首先，作者通过筛选与CD8+ TILs密切相关的趋化因子，包括CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10。并在接下来的研究中发现这4个趋化因子的共同表达，能够广泛识别具有T细胞炎症表型的原发性肿瘤和肝转移。
这里小伙伴们需要注意的是，“表达差异”这部分作者分了两步！CD8+ TILs的差异是为了体现肿瘤免疫微环境的意义，找到与CD8+ TILs相关的趋化因子。这才引出了文章的主角~目的分子（CCL4、CCL5、CXCL9和CXCL10）在PDAC中的表达是否存在共调控或标记独立的患者亚群才是更重要的差异分析！
然后就是找证据~查阅文献得知这4个趋化因子在提高有效抗肿瘤免疫方面具有已知的主要功能，这应该不是巧合了。那么，作者需要分析这些趋化因子功能，以确定潜在的肿瘤免疫反应性。因此，作者利用TCGA & ICGC这两个大型公共数据库，观察目的趋化因子之间强而排他的协同调节，用于说明PDAC中存在类似的机制。
接下来就是这篇范文的高潮部分！为什么这么说呢？因为生信文章相对来讲在机制探讨部分较为缺乏，而本篇文章就是一篇生信文章中很好的探讨机制的例子，非常值得深入学习！作者在这项研究中着重评估了浸润性T细胞在PDAC癌症免疫周期的三个基本过程。对胰腺导管腺癌(PDAC)的4-趋化因子签名与免疫特征(免疫细胞，免疫检查点相关基因，免疫相关通路，免疫原性和免疫得分)等做了详细研究。
到这里范文解读就接近尾声了~该研究是基于独立队列(COMPASS 临床试验: NCT02750657)的研究，使用了全转录组测序和全基因组测序数据。文章的整体思路是，通过差异分析确定与CD8+ T细胞浸润与直接相关的特异性趋化因子。并通过聚类分析发现4趋化因子-高组具有显著增加的CD8+TILs浸润和更高的免疫活性特征。利用IHC和RNA-seq结果证明了PDAC中存在免疫细胞和免疫相关的蛋白。并在公共数据库(TCGA和ICGA)进一步验证上述结果。该研究的主要分析方法为差异分析，GSEA分析，ssGSEA分析，相关性分析等等。
最重要的是，作者的思路是通过查阅大量文献，找到相关机制，利用生信大样本数据的优势去证明这些机制。这就很好的改善了生信文章在探讨机制方面比较欠缺的问题。
综上，这项研究表明特定的趋化因子与转录，以及PDAC中T细胞炎症表型相关指标和APC参与的流程直接相关,所需的抗肿瘤免疫和有可能成为预测应对免疫疗法,尤其是在较低TMB水平下。作者发现4个趋化因子均与T细胞炎症和免疫检查点封锁反应有关，并且这种关联在原发性PDAC和肝转移中都可见到。由此，作者希望推动和建立PDAC抗肿瘤免疫治疗的机制研究。且这项研究的结果在PDAC的早期诊断中具有很重要的影响，有助于确定患者的免疫治疗策略。
好啦~菠小萝想通过今天这篇利用自己临床数据发高分的生信文章，带给大家不一样的写作思路！生信文章同样可以有机制有意义！今天的分享就到这里吧~
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参考文献
[1] Romero JM, Grünwald B,Jang GH, Bavi PP, Jhaveri A, Masoomian M, Fischer SE, Zhang A, Denroche RE,Lungu IM, De Luca A, Bartlett JMS, Xu J, Li N, Dhaliwal S, Liang SB, ChadwickD, Vyas F, Bronsert P, Khokha R, McGaha TL, Notta F, Ohashi PS, Done SJ, O'KaneGM, Wilson JM, Knox JJ, Connor A, Wang Y, Zogopoulos G, Gallinger S. AFour-Chemokine Signature Is Associated with a T-cell-Inflamed Phenotype inPrimary and Metastatic Pancreatic Cancer. Clin Cancer Res. 2020 Apr15;26(8):1997-2010. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-19-2803. Epub 2020 Jan 21. PMID:31964786.
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撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
值班 | 风间琉璃
主编丨小雪球
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