申课题没有前期？5+干湿结合文章教你如何巧用生信数据！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。2021年的2月菠小萝陪您过大年！2021年的2月菠小萝陪您过大年~这一年的干货全部奉献给大家！本周，菠小萝继续推出“2021年必备生信套路|圆你的晋升梦”系列文献解读之——逻辑清晰的干湿结合文章。今天我为大家带来的是一篇比较有意思的文章，于2020年12月发表在《Oncoimmunology》上，最新影响因子5.869，题目是“MIF inhibition as a strategy for overcoming resistance to immune checkpoint blockade therapy in melanoma”。虽然影响因子并不高，但通过这篇文章作者可以学到在生信文章中如何做到“老分子新用”！感谢作者为作者提供了很好的学习典范！

期刊简介

这本杂志5年影响因子都比较稳定，适合一些免疫相关方向，加些简单实验验证的生信文章发稿。有这类文章的小伙伴们，菠小萝推荐这本杂志哦~

“挑圈联靠”题目要素拆解

疾病：黑色素瘤（melanoma）；

目的基因：MIF；

数据来源：Unknown；

机制：免疫检查点抑制剂治疗耐药机制；

研究目的（文章类型）：单基因（免疫治疗耐药）的预后分析。

知识背景

本篇范文呢，也是一篇肿瘤微环境相关的文章，具体的基础知识已经讲稿太多遍了，也就不过多赘述了。本篇范文的侧重点在于微环境中细胞间的相互作用，主要是由促耐受性因子的分泌介导，导致先天和适应性免疫细胞功能丧失。作者接下来就来说说作者的目的基因——MIF。近年来,巨噬细胞移动抑制因子(MIF)一直被视为TME中分泌的一种重要的致耐受性因子,布鲁姆和班尼特在1966年被定义为T细胞分泌的促炎细胞因子,作为一个强有力的巨噬细胞迁移抑制剂。MIF不仅由淋巴细胞分泌，也由其他免疫细胞如巨噬细胞和非免疫细胞如内皮细胞、上皮细胞和肿瘤细胞分泌。MIF分泌后，在TME中可与肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞(DC)、调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)上表达的受体CD74结合，促进免疫逃逸和肿瘤生长。MIF除了对先天免疫细胞有免疫抑制作用外，还可以通过抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来调节适应性免疫应答。作者在之前的研究中已经证明，阻断巨噬细胞和树突状细胞上的MIF- CD74信号通路可以回复对转移性黑色素瘤的抗肿瘤免疫应答。还有很多研究表明肽基免疫治疗阻断MO巨噬细胞和DCs上的MIF/CD74信号通路可恢复其促炎和抗肿瘤功能。MIF也能够通过减少CD4+和CD8+T细胞的浸润对适应性免疫应答产生抑制作用。或者还能够通过调节IL-2的产生而增加Treg的积累来促进肿瘤的生长。并且有研究表明，MIF高表达水平与临床预后差相关。于是，作者猜测适应性免疫增强(抗CTLA-4)与逆转先天免疫抑制机制(MIF抑制)的联合治疗方法可能在晚期黑色素瘤患者中产生协同临床反应。

伊匹单抗是一种单克隆抗体，能有效阻滞一种叫做细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA-4)的分子。CTLA-4会影响人体的免疫系统，削弱其杀死癌细胞的能力。

数据来源 & 思路框架

本篇范文的研究重点在于MIF的表达水平与总生存率和对检查点抑制剂的不良反应的相关性。这也是一个经典分子，属于明星分子了~作者都知道常见的单基因生信文章都是研究一个比较创新的分子，对于明星分子而言，如果仅仅使用作者常规的套路必然是没有新意的，而且也确实没有必要毕竟它的功能已经被研究的很透彻了。那么作者就来看看如何对一个明星分子展开分析，还能发高分！作者研究分析中使用的mRNA表达和临床数据都来自TCGA-SKCM数据集(n = 477)。以及抗CTLA-4治疗病人的组(n = 26),并将730个基因的nCounter泛癌免疫图谱基因应用于UCSC癌症基因组学，研究与MIF表达水平相关的生物通路。所得结果以CSV格式进行提取，并通过GraphPad进行相关性分析。

数据精析

一、“挑”——表达差异

作者在本项研究中阐述问题的逻辑链条非常清晰，这里虽然作者的重点没有放在如何挑分子上，他的研究首先集中在了挖掘TCGA数据，也就是分析MIF在泛癌中的表达差异，从而确定发现MIF在许多癌症类型中高表达，且在黑色素瘤中的表达差异尤为明显(图S1a)。

(图S1a)

二、“靠”——生存预后

作者为了分析MIF在黑色素瘤中的意义，分析了多方面的组间生存预后分析，主要包括了一下两种分组方式：① 以MIF高低表达分组；② 以免疫治疗疗效评价分组。

具体来说，作者对230例黑色素瘤患者的生存数据进行分析，结果表明MIF的高表达与较差的生存率相关(图1a)。随后，作者合并了GTEx数据库中正常皮肤组织样本(n = 1025)再次分析了表达差异(图1b)。接下来，作者分析了治疗(化疗或免疫治疗)后TCGA数据库中黑色素瘤患者的MIF表达水平。与完全缓解患者相比，预后不良患者队列(即临床进展性疾病患者)中的MIF表达水平显著更高(图1c)。

生存分析后，作者继续不同临床变量的队列研究。首先，作者评估了转移性黑色素瘤队列，发现MIF高表达水平也与转移性患者生存率显著下降相关(图1d)。通过挖掘接受伊匹单抗治疗(抗CTLA-4抗体)的患者队列，作者发现，在总生存期(OS)(图1e)和无进展生存期(PFS)分析中，高MIF表达水平与不良反应相关(图S1b)。最后，作者研究了一组接受抗pd -1治疗的患者(n = 37)，结果表明，高MIF表达水平与显著不良反应和生存期相关(图1f)。综上所述,这些研究结果证实,高MIF表达水平与SKCM贫困生存预后密切相关,表明高表达强烈与不良反应immune-checkpoint抑制剂在患者接受治疗,导致作者假设结合免疫——检查点堵塞与MIF抑制剂治疗可能改善病人的结果。

总之，在转移性黑色素瘤队列中，MIF表达水平升高与较差的总生存率和对检查点抑制剂的不良反应相关。

(图1)

三、主变量通过因变量介导表型

这一部分作者论证了阻断MIF/CD74轴能够克服抗CTLA -4治疗的耐药性，并能够抑制黑色素瘤的生长和转移。MIF的主要结合受体是CD74，这一对组合也是很明星了，很多研究都证明其在黑色素瘤细胞以及巨噬细胞、DC细胞和B细胞等免疫细胞上表达。作者使用了4-IPP来阻止MIF与其受体CD74结合。在体内研究中，作者使用了B16/BL6 TMT黑色素瘤模型(对CTLA-4免疫治疗有反应)和衍生的B16/BL6 3I-F4细胞(对CTLA-4免疫完全耐受)的两组进行对照研究。治疗方案包括4次注射抗CTLA-4抗体或抗PD-L1抗体(绿色箭头标记)，如图2a所示。作者发现，单独使用抗CTLA-4抗体治疗(图2b蓝色曲线)，仅在敏感黑色素瘤细胞系(TMT)中显著降低了肿瘤生长，而在耐药细胞(3I-F4)中则没有(图2c蓝色曲线)。当抗CTLA-4与4-IPP联合使用时，作者观察到敏感(TMT)和耐药(3I-F4)细胞株的肿瘤大小均显著降低(图2b、c中的红色曲线)。

作者还评估了4-IPP与单独或联合使用抗PD-L1抗体治疗之间的关系。在TMT模型中，PD-L1抗体单独表现出降低肿瘤大小的抗肿瘤活性(图2d)。3I-F4细胞对抗PD-L1单独治疗也有反应，肿瘤大小适度缩小(图2e)。此外，尽管抗PD-L1和4-IPP联合治疗有改善TMT细胞抗肿瘤反应的趋势，但与单独使用抗体相比，并没有显著改善结果(图2d)。然而，与单独使用抗体相比，该治疗组合确实显著提高了检查点耐药3I-F4细胞的抗肿瘤反应，减少了肿瘤大小(图2e)。

接下来，作者研究了抗CTLA -4或抗PD-L1抗体与4-IPP联合应用于实验性肺转移模型(图2f)。结果发现单独使用抗CTLA-4抗体可以减少敏感的TMT黑色素瘤细胞系中肺转移瘤的数量(图2g)。正如作者预期的那样，在耐药细胞中单独使用抗CTLA-4并没有显示出抗转移反应(图2h)。然而，联合使用抗CTLA-4和4-IPP显著减少了两种细胞系的肺转移数量(图2g)。单独或联合使用抗PD-L1均不影响敏感和耐药模型肺转移的数量(图2g，绿色标记h)。综上所述，这些数据表明，抗CTLA -4抗体联合4-IPP可以克服免疫检查点抵抗，提示了一种新的治疗方法，即在抗CTLA -4的基础上加入4-IPP，以改善患者的治疗效果。

(图2)

三、“联”——主变量与肿瘤微环境免疫抑制表型相关性分析

MIF的高表达水平与肿瘤微环境免疫抑制网络相关

为了研究MIF高表达水平在TME免疫网络调控中的作用，作者使用nCounter Pan Cancer定义的730个免疫基因，通过TCGA-SKCM 数据集的RNA-seq数据进行相关性分析。作者在接受抗CTLA -4治疗的患者队列中发现195个免疫相关基因与高MIF表达水平相关。其中有160个基因呈负相关，35个基因呈正相关。基于这些差异基因，作者评估了接受抗CTLA -4治疗的患者队列中每个基因与MIF表达值的倍数变化间的关系。图3a描述了与MIF表达式相关的从负到正折叠变化的方差对应的颜色等级。这些结果表明，高MIF表达水平与免疫抑制TME基因签名相关。在无反应的抗CTLA-4治疗抵抗的患者中进行的分析结果表明，高MIF表达组的免疫基因与肿瘤微环境中的免疫抑制相关性最高。随后，作者同时将所有与MIF高表达相关的免疫基因分为不同的免疫反应亚类【免疫激活类别(绿色标记);免疫抑制类别(红色标记);和一般免疫类别(蓝色标记)(图3b)】，用于构建一个交互转录组网络，以显示由MIF高表达水平的SKCM驱动的重要免疫基因表达谱。且该网络对高MIF表达水平具有可塑性。作者的研究结果表明,大多数免疫基因与免疫抑制通路显著相关,包括Treg功能,抑制Th1、Th2激活,T细胞耐受反应,抑制树突状细胞,M2巨噬细胞和免疫检查点受体(ICR)。图3b中绿色线表示与抗肿瘤反应相关的免疫网络，主要与低表达变异相关，红线表示的免疫抑制网络主要与高表达变异相关。综上所述，这些分析表明，抗CTLA -4治疗后的黑色素瘤患者中MIF的高表达与高免疫抑制环境的存在相关。

接下来是文章生信部分的重点内容，涉及到很多分析流程，小伙伴们主要学习这一段内容哦~

作者通过询问TIDE(肿瘤免疫功能障碍和排除)和TIMER(肿瘤免疫估计资源)数据库，来扩展分析原发性和转移性黑色素瘤患者队列中MIF高表达水平与免疫细胞浸润谱(CD4, CD8 T细胞和巨噬细胞)之间的相关性。作者发现，在转移性患者队列中，MIF高表达水平与CD4+T细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞免疫浸润呈负相关。TIDE数据库的分析结果显示，MIF表达水平与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)浸润呈负相关。且在转移性SKCM患者队列中，低MIF表达与高CTL浸润相关，预后生存更佳(n = 317)(图3c)。利用TIMER数据库，作者试图将MIF表达与转移性黑色素瘤患者队列中的Treg标记物(FoxP3和IL2RA)和T细胞衰竭标记物(HAVCR2, TIGIT, LAG3, PDCD1, CXCL13和CTLA-4)联系起来(n = 368)。结果观察到MIF高表达组与FoxP3和IL2RA表达水平呈正相关，并与HAVCR2、TIGIT、LAG3、PDCD1、CXCL13和CTLA-4表达水平呈正相关(图3d)。综上所述，这些结果表明MIF高表达与免疫细胞浸润抑制相关，并可能在转移性SKCM患者中引起免疫耐受。

(图3)

免疫检查点阻断治疗联合4-IPP增强M1样巨噬细胞表型，降低M2样表型

接下来，作者通过实验验证巨噬细胞(MOs.)在调节免疫应答对抗癌症中发挥核心作用。先前的研究已表明，在黑色素瘤和其他实体肿瘤中，促炎性M1-MOs被肿瘤细胞抑制，进而失去了触发和应答抗癌免疫反应的能力。在TME中，TAM通常获得一种M2样表型，抵抗抗肿瘤免疫反应，从而导致肿瘤发展、转移和治疗的耐药性。于是，作者使用TMT(抗CTLA -4敏感)或3I- F4(抗CTLA -4耐药)，在小鼠黑色素瘤模型中单独接受抗CTLA -4或抗PD-L1抗体或与4-IPP联合的治疗方式(图2a)。结果显示，仅在TMT肿瘤中单独使用抗CTLA -4抗体(蓝条)可显著增强M1-MOs样表型浸润(F4/80+iNOS +)，且抗CTLA-4联合4-IPP(棕条)在TMT和3I- F4中均促进了M1样表型(图4a-b)。当评估M2-MOs样表型(F4/80+Arg1+)时，TAM浸润减少(图4c)，抗CTLA -4治疗并不能调节3I-F4中的M2样表型(图4d)。正如预期的那样，作者也发现联合治疗在TMT和3I-F4(图4c-d)中均显著降低了M2样表型。同样的分析在单独使用抗PD-L1抗体治疗(蓝条)或联合使用4-IPP(棕条)治疗TMT和3I-F4小鼠中，M1样表型显著增加(图4e-h)。此外，作者发现，抗PD-L1与4-IPP联合治疗均导致TMT(图4g和S6b)和3I-F4(图4h和S6d)两种黑色素瘤模型中M2样表型的减少。这些发现表明，免疫检查点抑制剂和4-IPP联合治疗增加了M1样巨噬细胞的数量，从而为检查点的敏感性和更重要的抗肿瘤免疫应答提供关键的先天免疫支持。

(图4)

四、Rescue——阻断MIF/CD74轴联合免疫检查点阻断治疗可增加CD8+ TIL并触发抗肿瘤反应

先前的数据显示，大量TIL的患者对免疫检查点抑制剂治疗表现出更好的反应。因此，作者使用TMT和3I-F4细胞评估了皮下模型中的TIL(图2a)。作者进一步发现单独使用抗CTLA-4抗体(红色)显著提高了CD3 +(图5a), CD4(图5b)和CD8 + T细胞的浸润(图5c),以及颗粒酶B的表达(图5d)。值得注意的是,作者发现抗CTLA-4抗体结合4-IPP能够进一步显著提高CD3 +, CD4 +和CD8 +的浸润和颗粒酶B表达。抗PD-L1抗体单独或结合4-IPP同样能够增加这两个模型中的CD3, CD4, CD8的浸润和颗粒酶B的表达(图5a)。总之，这些发现表明，免疫检查点阻断疗法与4-IPP联合治疗可通过增加CD8+ T细胞的浸润，以及触发抗肿瘤功能恢复适应性免疫应答。

(图5)

五、直接机制——阻断MIF/CD74轴能够下调乳酸代谢通路

作者先前的研究报道过MIF由B16F10黑色素瘤细胞分泌，在肺转移灶中高表达。在本项研究中，作者进一步采用ELISA法检测TMT和3I-F4细胞中MIF的分泌情况。发现MIF在3I-F4耐药细胞中的表达显著高于抗CTLA-4敏感的细胞(图6a)。于是，作者查阅文献得知激活MIF/CD74轴可以触发“Warburg效应”。基于这一原理，作者进行了一项体外研究，以评估4-IPP处理后TMT和3I-F4细胞产生的乳酸。结果发现4-IPP处理后，TMT或3I-F4均显著降低了乳酸的生成(图6b)。作者还分析了缺氧条件下MIF/CD74轴抑制后的乳酸产量，发现3I-F4细胞分泌的乳酸明显多于TMT细胞(图6c)，而4-IPP处理后，两种细胞系的乳酸产量均显著降低(图6d,e)。已知HIF-1α诱导糖酵解代谢途径，提高丙酮酸/乳酸浓度，进而提高HIF-1α活性。因此，作者研究了阻断MIF/CD74轴是否会干扰HIF-1α的表达。于是，在缺氧条件下使用TMT和3I-F4细胞进行Western，发现4-IPP能显著降低两株细胞(TMT)和(3I-F4)中HIF-1α的表达(图6f)。

其他研究报道过MIF/CD74轴与肿瘤细胞中HIF-1α表达水平升高相关，且与PD- L1表达密切相关。因此，接下来作者决定评估4-IPP处理后的缺氧条件下，TMT和3I-F4细胞中PD-L1的表达水平。结果发现4-IPP显著降低了两种细胞系中PD-L1的表达水平(图6g)。为了验证“阻断MIF/CD74轴抑制可以调节乳酸生成”这一假设，作者评估了乳酸脱氢酶A (LDHA)在皮下模型中的表达水平。结果显示单独使用抗CTLA-4只显著降低了TMT肿瘤细胞中LDHA的产生(图6h)，但没有降低3I-F4肿瘤细胞中LDHA的产生(图6i)。更重要的是，抗CTLA-4与4-IPP联合治疗降低了肿瘤模型(TMT)和(3I-F4)中LDHA的产生(图6h)。此外，联合治疗导致LDHA表达显著降低(图6h,i）。最后，作者利用公共TCGA数据库TIMER(肿瘤免疫估算资源)来评估转移性黑色素瘤患者队列中MIF和LDHA或CD274 (PD-L1)表达水平之间的相关性。分析表明MIF表达水平与LDHA和CD274表达水平均呈正相关。综上所述，这些结果表明，阻断MIF/CD74轴可以降低耐药细胞株(3I- F4)产生的乳酸水平。

(图6)

总之，作者的研究结果支持了阻断MIF/CD74轴，能够降低HIF-1α和PD- L1的表达水平，导致TME的代谢重编程，并回复肿瘤对免疫检查点抑制剂的敏感性。

全文总结

免疫检查点抑制剂(ICB)在转移性黑色素瘤患者中显示了令人印象深刻的结果，然而，持久的完全缓解;即使是伊匹单抗/尼鲁单抗组合也低于30%。对ICB的原发性和获得性耐药通常是由于肿瘤微环境(TME)支配的肿瘤免疫逃逸机制。巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration Inhibition Factor, MIF)是TME中分泌的一种免疫抑制因子。作者之前已经证明，阻断巨噬细胞和树突状细胞上的MIF/CD74信号可以恢复抗黑素瘤的免疫反应。本篇范文使用抗CTLA-4治疗的TCGA-SKCM队列，探究免疫基因与MIF高表达的相关性。此外，作者使用GEPIA 评估了几种癌症类型中MIF的表达水平，以及基于癌症类型和癌症亚型的总体生存分析，以确定MIF表达水平对预后的显著影响。免疫浸润分析也是不能少啦，作者评估MIF与Tregs及其他标记物签名表达水平之间的相关性表达。这些基本分析完成后，就进入了本篇范文独具特色的部分——伊匹单抗疗效评估。作者使用TIDE数据库评估了在接受抗CTLA-4治疗的SKCM患者队列中，MIF高表达水平与较差的总生存期(OS)相关。

在本篇范文中，作者通过生信+实验验证，证明阻断MIF/CD74轴可增强CD8+ T细胞的浸润，并促进巨噬细胞在TME中向M1样表型转化，从而提高黑色素瘤对CTLA-4抑制剂的反应。此外，抑制MIF能够减少耐药细胞中乳酸的生成，降低HIF-1α和PD-L1的表达，导致黑素瘤肿瘤代谢的重编程。从TCGA数据库中提取的黑色素瘤患者数据支持这一假设，即MIF的高表达与ICB治疗的不良反应密切相关。这些数据支持了靶向MIF抑制剂能够作为黑色素瘤免疫检查点抑制剂耐药的潜在策略的理论基础。通过激活先天免疫和肿瘤代谢的重编程以及降低PD-L1在黑色素瘤细胞中的表达，将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。

（图7）

好了小伙伴们，今天的文章还算精彩吧！相信大家也更加了解了如何将生信分析融入你的课题。

后台回复“免疫抑制剂耐药”领取范文原文及补充材料吧~我是菠小萝~我们下周再见啦~拜拜！

参考文献

[1] de Azevedo RA, Shoshan E, Whang S, Markel G, Jaiswal AR, Liu A, Curran MA, Travassos LR, Bar-Eli M. MIF inhibition as a strategy for overcoming resistance to immune checkpoint blockade therapy in melanoma. Oncoimmunology. 2020 Dec 6;9(1):1846915. doi: 10.1080/2162402X.2020.1846915. PMID: 33344042; PMCID: PMC7733907.

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