只用1例患者的临床个案也能5+？这个生信研究思路值得你学习！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。感谢作者为作者提供了很好的学习典范！今天带给大家的是一篇单细胞测序的免疫浸润分析套路，于2021年1月发表在《Cancer Immunol Immunother》上，最新影响因子：5.442。题目是“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular immune profile in a Pembrolizumab-responsive PD-L1-negative lung cancer patient”。

期刊简介

“挑圈联靠”题目要素拆解

疾病：lung cancer；

数据来源：单细胞测序；

机制：细胞和分子免疫特征；

研究目的（文章类型）：预测免疫治疗获益人群。

知识背景

本篇范文是基于一个临床问题出发的，由于帕博利珠单抗已经被推荐用于高PD-L1表达[肿瘤比例评分(TPS) ≥ 1%]的转移性非小细胞肺癌患者的一线治疗。然而，仍然有一些PD-L1阴性患者可以从包括帕博利珠单抗在内的PD-1抑制剂的治疗中获益，其潜在机制尚不清楚。由此出发，范文即对PD-L1阴性的肺鳞癌患者外周血单个核细胞进行单细胞测序，意在说明的免疫细胞和分子变化受益于帕博利珠单抗治疗。

尽管已有很多研究在不同的肿瘤类型中广泛检测到PD-L1的表达，并且已经成为与PD-1抑制相关的标记物。但对于治疗获益人群的预测，却缺乏明确的biomarkers。作者考虑到与批量测序相比，单细胞RNA测序(ScRNA-Seq)能够提供复杂组织中单细胞水平的基因表达和细胞异质性的信息，能够揭示肿瘤微环境在肿瘤进展和耐药性中的作用。于是，作者对一名PD-1抗体治疗受益的PD-L1阴性肺癌患者展开研究。

对PD-1抗体治疗前后的外周血单个核细胞(PBMCs)进行ScRNA-Seq检测。通过鉴定免疫细胞标记基因表达，作者鉴定并比较了PD-1抗体治疗前后细胞类型和亚型的变化。在基因水平，进行失调基因和功能分析，以获得PD-1抗体治疗前后的分子变化。这项单一患者研究揭示了受益于帕博利珠单抗的PD-L1阴性肺癌患者的免疫细胞和分子特征，并将阐明PD-L1抑制剂的机制和应用。

数据来源 & 思路框架

本篇范文的数据来源于一名PD-L1阴性的原发性中央型支气管肺鳞状细胞癌患者。该患者为男性，80岁，TNM分期为：T4N2M0，ⅢB期，PD-L1阴性。由于该患者ECOG的PS评分为2分，因此不适合接受铂双合化疗(PT-DC)，而使用了培布罗利珠单抗。作者先是对该名患者进行外周血单细胞测序，然后通过癌症基因组图谱(TCGA)队列验证临床意义。

分析结果中16个簇的3423个细胞能够分为8种细胞类型，包括NKG7+ T、NKG7+ NK、幼稚T、CDC1C+树突状细胞、CD8+ T细胞、B细胞、巨噬细胞和红细胞。NKG7+ T、NKG7+ NK、幼稚T和CD8+ T细胞的细胞比例、差异表达基因等使具有临床意义的，并且通过分析能够发现相关的重要通路。比如，泛素介导的蛋白水解/细胞周期/自然杀伤细胞介导的细胞毒性被确定为NKG7+ NK细胞中PD-1阻断反应途径。凋亡/Th1和Th2细胞分化被认为是NKT细胞中受Pembrolizumab影响的途径。

通过分析发现在基因水平上，ID2、PIK3CD、UQCR10、MATK、MZB1、IL7R和TRGC2，并在TCGA数据库中验证了它们与PD-1表达显著相关，这可能具有作为PD-L1阴性肺鳞状细胞癌患者的预测标志物的潜力，这些患者可以受益于Pembrolizumab。

数据精析

差异分析——免疫细胞异质性

帕博利珠单抗治疗前后外周血单个核细胞的免疫细胞异质性

在原始数据过滤之后，获得了包括治疗前（n=1850）及治疗后的（n=1573）在内的3423个细胞的转录组。通过t-SNE聚类识别出16个聚类，并以治疗前、后分类(图2a-b)。这种分类能够明显区分Pembrolizumab治疗前、后之间的差异。基于典型免疫细胞标记的表达，作者将16个簇分为8种细胞类型:NKG7+ T细胞(簇7，14)、NKG7+ NK细胞(簇1，6，8，9)、幼稚T细胞(簇2，3，4，5，10)、CDC1C+树突细胞(簇16)、CD8+ T细胞(簇11)、B细胞(簇12)、巨噬细胞(簇13)和红细胞(簇15)。最后，作者比较了组间八种细胞类型的分数变化，发现NKG7+ NK细胞和NKG7+ T细胞的相对百分比降低，幼稚T细胞、CD8+ T细胞、B细胞和巨噬细胞增加(图2d)。典型免疫细胞标记的t-SNE和小提琴图如图2b和3a所示:T细胞-CD3D、CD4 (CD4+ T细胞)、CD8A (CD8+ T细胞)、LEF1(幼稚T细胞)；NK细胞——NKG7和GZMBb细胞——CD20(MS4A 1)、IGHM、CD79巨噬细胞-CD68；树突细胞-CD1C和红细胞-HBD。在以下分析中，作者重点研究了NKG7+ T细胞(簇7，14)、NKG7+ NK细胞(簇1，6，8，9)、幼稚T细胞(簇2，3，4，5，10)细胞类型，以研究Pembrolizumab治疗前后PBMCs的细胞和分子特征。

(图2）

(图3a）

经帕博利珠单抗治疗后NKG7+ NK细胞异质性和分子改变

由于簇1、6、7、8和9显示NKG7的高表达，而簇1、6、8、9不表达CD3D，作者将簇1、6、8、9描述为NKG7+ NK细胞。在簇1、6、7、8中鉴定了六种高表达的细胞标记，包括NKG7、FCGR3A、KRLB 1、GNLY、GZMB和CTSW(图4a-b)。为了了解四种NK细胞群在Pembrolizumab治疗后共有的分子变化，作者进一步分析了差异表达基因和富集途径。如图4c所示，除了Th1和Th2细胞分化，T细胞受体信号传导途径和自然杀伤细胞介导的细胞毒性途径这两条通路外，氧化磷酸化、内质网中的蛋白质加工、细胞衰老、胞吞和有丝分裂等通路，在至少两个集群中显著富集，提示了这些通路在Pembrolizumab治疗中影响NK细胞的潜在作用。与簇1、8和9相比，虽然簇6中三种途径没有显著富集，但氧化磷酸化显示出最显著的富集。在基因水平上，图4d显示了≥ 2个簇中的21个差异表达基因，包括INADL、IGHA 1、IFITM1、ID2和NCOR1等21个差异表达基因。接下来，作者在TCGA及GEPIA中验证了以上DEGs的表达及其与PD-1的相关性。结果发现只有ID2，PI3KCD和UQCR10这三个基因显示出与PD-1的相关性，并具有预后意义。如图4e所示，与正常组织相比，ID2在肺腺癌(LUAD)和肺鳞癌(LUSC)组织中的表达显著降低。总体的生存分析结果显示，PIK3CD表达较高的患者比PIK3CD表达较低的患者存活时间更长。此外，小提琴图展示了在经过帕博利珠单抗治疗前后，泛素介导的蛋白水解、细胞周期和自然杀伤细胞介导的细胞毒性等通路中，UQCR10是差异最显著的基因(图4i)。在自然杀伤细胞介导的细胞毒性方面，治疗后ZAP70和PIK3CD表达明显降低，RAC1和SH2D1A表达明显升高。

在这一部分中，作者鉴定了四个NKG7+ NK细胞群，并通过小提琴图展示了它们的标记物、百分比和经帕博利珠单抗治疗后的通路变化。

(图4）

功能及特性分析

经帕博利珠单抗治疗后NKG7+ T (NKT)细胞的特性

由于簇7和簇14都表达CD3D和NKG7，作者将其表征为NKG7+ T (NKT细胞)（图5a-b）。随后，作者通过TCGA数据库验证它们在肺癌样品中的表达后，MATK和CD59显著低表达，而MZB1、SSR3、GGCT和IDH2与正常组织相比在LUAD和LUSC组织中都高表达(图5c)。相关分析结果表明，MATK和MZB1与PD-1呈正相关(图5d)。其次，经帕博利珠单抗处理后，簇7的相对百分比显著降低，而簇14的相对百分比明显增加(图5e)。因此，作者进一步分析了两个集群中差异表达基因富集的途径。由于在聚类7中只有10个基因显示出显著差异。于是。作者关注聚类14中的基因表达和途径改变。如图5f所示，簇14，也就是代表Th1和Th2细胞分化的簇中988个差异表达基因与凋亡、自噬、B细胞受体信号通路、NF-κB信号通路、T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化和Th17细胞分化显著相关(图5g)。对于Th1和Th2细胞分化途径，作者发现经帕博利珠单抗治疗后，HLA-DRB5和MAPK14表达显著增加，而MAML2、STAT4、PRKCQ、IKBKB、JAK3和IL-4R表达明显降低。

在这一部分中，作者鉴定了两个NKG7+ T细胞(NKT)簇，并揭示了它们的标记物、百分比和经帕博利珠单抗治疗后的通路变化。

（图5）

帕博利珠单抗治疗后幼稚T细胞群、标记物和通路的变化

由于簇2、3、4、5和10都高度表达CD3D、IL-7R和幼稚T细胞标记LEF1，这五个簇都被鉴定为LEF1+幼稚T细胞。但其中只有簇2和簇5高度表达另一种幼稚的T细胞标记CCR7(图6a-b)。与正常组织相比，RCAN3和IL-7R显著较低，MAML2在LUAD和LUSC组织中均显著高表达(图6c)。相关分析结果表明，白介素-7R与PD-1呈正相关(图6c)。在用Pembrolizumab处理后，发现簇3变化最显著(图6d)，因此，在下面的分析中关注簇3，其中差异表达基因的通路主要富集于B细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、mRNA监视通路、蛋白质转运、RNA降解、RNA转运、T细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化、Th17细胞分化(图6e)。图6f显示了Pembrolizumab处理后RNA转运中差异最显著的基因，如POP5、KPNB1、NUP50和NUP133。此外，作者还描述了T细胞受体途径中差异最显著的基因（图6g）。

（图6）

帕博利珠单抗治疗前后CD8+ T细胞特征

CD8+ T细胞(簇11)的所有六种细胞标记物（图7a-b）。作者发现CD8A、CD8B、KLRG1、CTB-91J4.1和TRGC2仅在簇11中表达。在TCGA数据库的验证中，与正常组织相比，TRGC2在LUAD和LUSC组织中的表达明显较低。相关分析结果表明TRGC2与PD-1呈正相关(图7c)。作者发现簇11的KEGG富集分析结果与B细胞受体信号通路、核糖体、趋化因子信号通路、溶酶体、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和Wnt信号通路显著相关(图7d)。Violin图显示了在使用Pembrolizumab前后核糖体、趋化因子信号通路、溶酶体和Wnt信号通路中差异最显著的标记(图7e)。结果提示，经帕博利珠单抗治疗后，RAC2、CXCR4、ITGB1和PPBP表达升高。相关分析结果表明RAC2与PD-1呈正相关，且CXCR4与PD-1呈正相关(图7f)。

（图7）

全文总结

本篇范文最大的优势就是通过单细胞测序，联合TCGA数据库的生信分析验证，将一例“个案报道”套上了绝美的“外衣”。作者的结果首次揭示了受益于培布罗珠单抗治疗的PD-L1阴性患者的血液免疫细胞异质性，以及PD-1阻断反应基因和途径。通过鉴定出Pembrolizumab治疗前、后提取的细胞分成16个簇，并基于典型标记物表达分为NKG7+ NK细胞、NKG7+ T (NKT)细胞、幼稚T细胞、CDC1C+树突状细胞、CD8+ T细胞、B细胞、巨噬细胞、红细胞等。NKG7+ NK和NKG7+ T (NKT)细胞显著减少，而幼稚T细胞和CD8+ T细胞增加。

通过探讨ID2、PIK3CD、UQCR10、MATK、MZB1、IL7R和TRGC2在TCGA数据集及GEPIA队列的表达差异，又分别进行了与PD-1表达的相关性分析。当然通路富集分析是说明潜在机制的必要环节。最后，作者在TCGA肺癌样本和PD-L1抗体治疗“后”组中验证了差异表达，由此能够预测帕博利珠单抗治疗的益处。

好啦，小伙伴们学习完这篇文章，单细胞测序该如何应用是不是已经非常清楚了呢。赶快选个独特的案例，来个单细胞测序，分分钟发个5分+吧！后台回复“菠小萝0410”获取范文原文吧~我们下周再见，拜拜！

参考文献

[1]Zhong R, Zhang Y, Chen D, Cao S, Han B, Zhong H. Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular immune profile in a Pembrolizumab-responsive PD-L1-negative lung cancer patient. Cancer Immunol Immunother. 2021 Jan 27. doi: 10.1007/s00262-021-02848-0. Epub ahead of print. PMID: 33506299.

往期传送门

CELL的TCGA数据挖掘有什么不一样？全面驱动基因突变景观拓展你的眼界！（内附图文精讲）

Cancer Cell最新纯生信文章，TCGA数据再度深入挖掘！

惊！TCGA多组学分析套路，还能发到9分加？葫芦里卖的什么药？

重磅最新消息！DeepMind首次突破蛋白折叠的历史难题，这项AI技术能否成为生信领域的下一匹黑马？

揭秘！8分+经典高端“基因家族”纯生信套路大放送~

“基因家族”套路过时了？最新10分+纯生信文章发给你看！

临床搞得你焦头烂额？这篇Nature子刊教你巧用临床数据发顶级生信文章！

TCGA太俗套？自己的临床数据搞起来照样发高分！

年初重磅福利！0实验轻松发表6分+~包你2021开年红！

生信也有队列研究！这篇近9分纯生信SCI教你如何挖别人的数据，发自己的文章！

2张Fig的单癌种生信文章10分+？到底出彩在哪里！