2张Fig的单癌种生信文章10分+？到底出彩在哪里！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏。本周我要与大家分享的是一篇2019年7月发表在《J Natl Cancer Inst》上，题目是“Genomic, transcriptomic, epigenetic, and immune profiling of mucinous breast cancer”，最新影响因子11.577。大家跟着菠小萝学过了不少TCGA数据库大样本&多数据类型的泛癌研究了，难道只有泛癌才能发10分+？今天菠小萝就为大家介绍这篇仅有2张Figure的单癌种高分生信文章，保证你们大开眼界。

期刊信息

题目要素拆解

疾病：Breast cancer ；

目的基因：Unknown；

数据来源：Genomic, transcriptomic, epigenetic, and immune profiling（包含这么多数据类型的数据库非TCGA不可）；

机制：可能是分子间的相关性及互作；

研究目的：多组学整合分析诊断/预后型文章。

背景知识

浸润性导管乳腺癌(IDC)是乳腺癌最常见的组织学类型，但也有少量亚型，如黏液性乳腺癌(MuBC)。本文研究的疾病是单纯黏液性乳腺癌(MuBC)，与浸润性导管癌(IDC)相比，MuBC患者一般年龄较大，预后良好，但在病理水平上，肿瘤细胞漂浮在细胞外黏液中。MuBC的特征在于细胞外粘蛋白的存在，通常表达雌激素（ER）和黄体酮（PgR）受体，缺乏HER2扩增。MuBC患者通常年龄较大并且预后良好。虽然早期的研究发现初级黏液样本和IDC样本在基因表达、拷贝数和突变水平上存在差异，但先前的研究从样本数量或从技术角度来讲都比较局限。

为了揭示MuBC的分子结构，我们应用低通全基因组测序和显微镜评估基质肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对30个MuBC的回顾性研究队列。我们进一步分析了两个独立的数据集，包括28个MuBC和429个雌激素受体阳性/ her2阴性的IDC。MuBC的特征是低TIL水平(中位= 0%，平均= 3.4%)。与IDC相比，MuBC具有更低的基因组不稳定性(尽管在多次测试校正后没有统计学意义)，以及PIK3CA突变发生率降低(IDC为39.7%，MuBC为6.7%，P=. 008, 34.8% vs 0%， P=.006)。最后，我们的报告确认MUC2异常的DNA甲基化可能是MuBC细胞外产生粘蛋白的一个原因。

本项研究的目的即，通过TCGA & ICGC两大数据库的大样本队列研究，在基因组和免疫水平上分析转录组、基因组和DNA甲基化水平的差异，并由此进一步阐明这种疾病的生物学效应。先前有研究表明，MuBC通常显示低TILs水平，只有5/30(16.7%)的肿瘤有>10% TILs。因而，作者进一步评估基质肿瘤的浸润性淋巴细胞，以阐明MuBC的分子结构，并分析可能存在的MuBC细胞外产生粘蛋白的原因。

数据来源 & 思路框架

本文主要研究的内容是，通过训练一个回顾性研究数据的基因组和免疫水平，包括在1989年1月至2015年12月间在Jules bort研究所确诊的103例MuBC患者，使用了这些患者病理样本和低通全基因组测序数据，并评估了TIL的浸润情况。并在TCGA & ICGC两个独立的数据集中验证，使用了两数据库中转录组和基因组数据。由于MuBC的基因组改变相对较少，作者又进一步研究了DNA甲基化驱动模式，使用HumanMethylation450K芯片的DNA甲基化数据，能够进一步阐明这种疾病的相关生物学。

数据精析

“挑”——差异分析

（一）全基因组差异分析

首先，第一步仍然是组间的差异分析，本文在这一部分涉及到疾病全局和部分两方面的差异比较。一者是疾病间的差异分析，另外就是两验证队列间的差异比较。通过大样本、全基因组的数据分析以明确肿瘤内TIL分布差异以及存在的空间异质性。

IDC与MuBC的基因组改变

作者在纳入研究的26例MuBC病理样本中比较肿瘤内TIL分布存在空间异质性。作者为了扩大数据量，选择了大样本的全基因组分析全基因组分析。结果显示，同一原发肿瘤不同区域间的差异≥15%。并且测序显示除了两个肿瘤样本之外的所有肿瘤都是二倍体，并且几乎没有体细胞拷贝数变异(Fig.1A），与之前的报道一致。虽然有报道称这些扩增在复发的MuBC患者中富集，但是本文的队列患者中，没有一个具有任何上述扩增的患者复发。于是，作者进一步比较了ICGC和TCGA中ER+/ HER2- IDC与MuBC的基因组改变。在ICGC数据中，两种组织学之间未观察到临床病理学特征的统计学显着差异。

(Fig.1A)

也就是说，很少有体细胞拷贝数变化ICGC数据表现出较低的单核苷酸变异，插入,重组和多倍体突变负荷。

ICGC和TCGA队列差异比较

在ICGC的MuBC数据集中，PIK3CA突变率为IDC 39.7% vs MuBC 6.7%，p=0.01；TCGA的MuBC数据集中，PIK3CA突变率为IDC 34.8% vs MuBC 0.0%, p=0.02(Fig.1B-E)。即MuBC的特征是低肿瘤浸润淋巴细胞水平，并且与IDC相比，MuBC具有较低的基因组不稳定性和较低的PIK3CA突变率(Fig.1F)。

(Fig.1B-E)

PS：这里简单介绍一些基因组不稳定性的理解。首先，基因组不稳定性(CIN)和发生突变是癌症发生的重要标志之一。主要代表在肿瘤细胞有丝分裂时染色体分离错误，导致子细胞中整条染色体非整倍体突变,或者DNA损伤引起染色体结构改变,造成的基因易位、缺失、反转、断裂等的统称。

在基因的突变和重排方面，作者观察到在MuBC中载脂蛋白（Apobe）相关的基因表达显著降低。尽管结果在统计学上不显著，在MuBC中PIK3CA突变的频率显著低于IDC，且MYC和ZNF703/FGFR1在MuBC中扩增（Fig.1G-H)。TCGA队列中观察到癌症基因改变频率的类似差异（Fig.1I-J)。

（Fig.1G-J)

（二）DNA甲基化数据差异分析

差异甲基化程度及差异位点分析

由于MuBC中存在相对较少的基因组改变，那还需要继续找出MuBC细胞外产生粘蛋白的原因。一种数据类型没变化，当然要换其他类型的数据继续分析啦~阴性结果总是能在一定程度上佐证阳性结果的，所以并不要慌。既然表型有差异，那一定存在导致这种差异的原因。于是，作者进一步研究其典型表型是否可以由特定的DNA甲基化驱动模式。作者使用了两大数据库中HumanMethylation450K甲基化芯片数据生成数组,确定了ICGC和TCGA的ER+/HER2- IDC和MuBC的差异甲基化CpGs 。结果非常令人兴奋，在MUC2中存在许多差异甲基化CpGs(ICGC中有14个，TCGA中有18个，其中12个很常见)。那就说明MUC2是接下来研究的重点。

MUC2属于粘蛋白家族，它是大型糖蛋白，要么是膜结合的，要么是成胶的。在不同器官的黏液肿瘤(包括乳腺癌)中，分泌凝胶形成黏液蛋白MUC2的蛋白过表达已被报道。这就更令人兴奋啦！

MUC2基因表达与甲基化水平的相关性

确定了差异位点，那就继续对比吧~与IDC相比，在ICGC和TCGA中，MuBC的mRNA水平也出现过表达MUC2（Fig.2A & D)。作者进一步计算了两个基因表达签名，并观察到在ICGC和TCGA中，只有形成胶蛋白(“Gel-MUC”)和膜结合胶蛋白(“Membrane-MUC”)的形成在两种肿瘤组织间存在统计学差异（Fig.2B-C & E-F)。作者又查阅文献发现位于启动子区域的CpGs的DNA甲基化，在调控一些凝胶形成黏液的表达中可能发挥的作用。

（Fig.2B-C & E-F)

于是，作者进一步研究差异甲基化位点，发现直到第一个外显子出现前，MUC2在MuBC中才发生显著低甲基化。说明MUC2甲基化水平和基因表达之间具有统计学意义的负相关。然而，在更下游的外显子中，与IDC相比，CpGs在MuBC中被高甲基化。这些结果在两个队列中是一致的(Fig.2G-H)。

(Fig.2G-H)

综上所述，作者的发现在一定程度上完善了关于MuBC这个小众癌种的的低基因组不稳定性的研究结果。并进一步强调了其低免疫浸润状态，可能是被作为免疫识别障碍的细胞外粘蛋白阻碍了。由此提出MUC2的差异甲基化可能是这些肿瘤细胞外产生粘蛋白的机制。

到这里，文章就结束了！虽然看似有些戛然而止的感觉，但是范文却是一个非常完善的队列研究。既有自己的数据集，又有公共数据集的结果验证。不仅仅有验证这么简单~而且还是毫不敷衍的两个大样本公共数据库！有了数据库的验证作者还嫌不够，还有多组学的验证！这篇文章真的回味无穷~引人深思~生信界绝对是卧虎藏龙~不发不知道，一发吓一跳呀~如此简洁清晰的文章框架，如此丰富的数据量和多组学分析。既有临床样本病理组织和全基因组测序数据，又有两大权威数据库验证支持！

我只能说一句，快点学起来吧小伙伴们！把细碎的思路整合起来，多多运用才能融会贯通。菠小萝教给大家的绝对不是死板的套路，生信文章就有这么一个特点，每篇优质的文章，都是各种套路的“套餐”，拼出来总是独一无二的。这也是当代生信飞速发展的原因，只要你能说出个所以然，数据一验证，就是篇文章。至于文章的层次嘛~还记得我们分析题目的五大要素吗？哈哈哈点到为止~跟着菠小萝品读高分生信，每周带给你新鲜感~

思路总结

菠小萝想总结给大家的是，一篇好文献在于它的科学假说和思路框架。几张Figure不重要，但重要的是研究中用到的数据和研究方法。这里数据包括对样本量和质量的要求。无论是泛癌还是单一癌种，最好纳入多数据库的样本，一是扩大样本量，二是排除一些混杂因素的干扰，增加分析结果的可信度。

我们再回顾范文，浸润性导管乳腺癌（IDC）是乳腺癌最常见的组织学类型，而纯粘液性乳腺癌（MuBC）是一种特殊的乳腺癌组织学亚型，占所有浸润性乳腺肿瘤的约2％。MuBC的特征在于细胞外粘蛋白的存在，通常表达雌激素（ER）和黄体酮（PgR）受体，缺乏HER2扩增。MuBC患者通常年龄较大并且预后良好。尽管有早期研究揭示MuBC和IDC样本之间基因表达，拷贝数和突变水平的差异，但受限于样本数量或技术水平。

本篇文章出发点找到很好，第一是小众癌种，第二是不仅纳入了自己的临床数据，还对两大数据库进行了队列研究。通过分析MuBC和IDC样本之间基因表达，拷贝数和突变水平的差异，揭示MuBC的分子结构。再基因组数据分析没有得到显著结果后，作者又利用甲基化数据分析，通过获得差异甲基化位点，确定MUC2在MuBC中的重要意义。并进一步表明MUC2基因的DNA甲基化异常可能是MuBC胞外粘蛋白产生的原因。

尽管两大数据库中MuBC病例个数也并不是很理想，但作者改进了以前关于MuBC较低基因组不稳定性的文献的结果。结果发现，低免疫浸润状态下，可能被细胞外粘蛋白作为免疫识别屏障而阻碍。并且本研究结果中比较有价值的地方，就是首次报道了MUC2的差异甲基化作为这些肿瘤中细胞外粘蛋白产生的可能机制。

好啦，小伙伴们~本周的分享接近尾声，本篇范文虽然仅用了两张Figure，但言简意赅，一张Figure说明了基因组数据分析，另一张则是甲基化水平的差异分析哦~一个阴性结果，一个阳性结果，缜密的逻辑和严格的队列研究设计，让这篇文章显得格外精彩！有兴趣的小伙伴可以再细细品味~后台回复“菠小萝MUC2”获取范文原文哦，我们下周再见吧，拜拜！

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