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小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇于2021年11月发表在《Mol Cancer》上的文章，题目是“Remodeling of the tumor microenvironment via disrupting Blimp1+ effector Treg activity augments response to anti-PD-1 blockade”，影响因子：27.401。这本期刊今年的影响因子也是飞速飙升~本项研究通过破坏Blimp1+效应物Treg活性重塑肿瘤微环境增强对抗PD-1阻断的反应。
先来介绍一下本篇范文涉及到的肿瘤免疫浸润相关知识。
我们都知道，免疫反应和自身耐受受到Foxp3+Treg细胞的严格控制，但这些Treg细胞在肿瘤内的积累是发展有效的抗肿瘤免疫和免疫治疗的主要障碍。
肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中Foxp3+Treg细胞的频率通常与各种癌症患者的预后不良有关。根据表型和功能特化，Foxp3+Treg细胞分为中枢Treg和效应Treg（eTreg）亚群。eTreg子集显示激活的表型和效应程序，并表达转录因子由Prdm1编码的蛋白Blimp1。
作者的前期工作已经确定Blimp1是持续免疫或炎症反应期间Foxp3+Treg细胞的谱系稳定性和抑制活性所必需的。在本篇文章的研究中作者针对Blimp1+Treg细胞促进肿瘤进展的机制，及其肿瘤特异性调节活性和肿瘤微环境（TME）对其功能的影响进行了深入研究。本篇范文通过各种可移植的肿瘤模型，评估了TME中Blimp1+Treg细胞如何重塑局部和全身免疫应答，及对PD-1检查点阻断的应答效率等问题。
进行比较的角度，深入挖掘西非与结直肠癌相关的特征不佳的分子变化和基因组改变。
作者首先在具有免疫活性的野生型小鼠和具有Foxp3特异性消融Blimp1的小鼠中建立各种可移植的肿瘤模型。临床层面分析了来自转移性黑色素瘤患者的肿瘤标本和TCGA数据集，以支持Treg和TFR细胞在肿瘤免疫中的潜在作用。其中，生信层面分析了TCGA-SKCM数据集中每个患者的生存比例、标准化基因表达数据和临床信息，分析原发组和转移组之间的多基因依赖分数和基因集评分。
机制研究上，通过体外培养测定和体内过继转移测定来分析Treg，TFR细胞和抗体应答如何影响肿瘤。分子层面为肿瘤浸润Treg细胞和肿瘤细胞的转录组数据分析。最后结合治疗效果，评估抗PD-1治疗与Blimp1+Treg活性破坏相结合的相关性。
总体结果揭示了Blimp1作为肿瘤浸润性Treg细胞的新的关键调节因子，并且是调节Treg活性以治疗癌症的潜在靶标，并且两种含有免疫特征的FCERIA可以作为黑素瘤患者的有希望的诊断或预后标志物。
一、表达差异——Blimp1+Treg和TFR细胞在肿瘤中积累
图1
首先，需要了解TME对Blimp1+Treg和TFR细胞的影响程度。作者分析了接种B16-OVA的Blimp1-YFP报告小鼠的Treg细胞。为了便于分析TFR细胞和免疫反应，使用NP-OVA免疫小鼠，因为这种小鼠增强了抗肿瘤免疫应答。
图1a-b即为在第0天用NP-OVA/CFA免疫，第7天用NP-OVA/IFA免疫的小鼠，第21天通过流式细胞术分析来自脾脏和肿瘤的细胞。
图1c为B16-OVA/NP-OVA模型建立的小鼠模型。
图1d-e则是分别对同一患者的黑色素瘤转移性或未受累肺组织的Treg细胞、TFR和CD27+CD38+ B细胞。
结果发现，与脾脏相比，肿瘤中TFR:TFH或TFR:GC B的比例增加2-3倍，表明肿瘤中的免疫抑制可能包括TIL TFR细胞对TFH Ab应答的抑制。
二、主变量调节表型
接下来，作者通过分析来自黑素瘤患者的TIL Treg和TFR细胞表达水平，发现较正常样本相比Blimp1在肿瘤样本中高表达，并能够抑制肿瘤表型。
尽管图1f-g中总B细胞的频率没有显着变化，但增加的TIL TFR细胞和减少的活化B细胞似乎在所有转移组织中是一致的。
图1h中转移淋巴结切片的免疫荧光（IF）分析显示其中一些TFH和TFR细胞紧密定位。该分析表明TIL Treg和TFR细胞可能参与一组黑素瘤患者的肿瘤免疫调节。
而生信层面TCGA-SKCM患者队列的分析显示PRDM1 mRNA表达与FOXP3 mRNA表达正相关，并且在FOXP3hi群体中，PRDM1表达与FUT4和FUT7的水平正相关，编码岩藻糖基转移酶4和7的基因，它们分别是负责CD15和CD15s合成的酶。
此外，图1i-j中Treg细胞的CXCR5和PRDM1高表达的转移患者比例增加，表明Treg细胞中高水平的CXCR5和PRDM1与黑素瘤转移风险增加相关。
总之，这些结果表明Treg细胞中Blimp1的缺失能够回复促肿瘤表型，其与肿瘤中适应性和先天性效应细胞的活化增强相关
接下来，作者证实了在Foxp3特异性缺失的Blimp1+小鼠中，能够延迟肿瘤生长和增强抗肿瘤效应物应答。
图2
通过以上分析，作者将研究方向指向Treg和TFR细胞中的Blimp1表达是否能够调节肿瘤免疫。为了干预eTreg亚群（Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre），作者将B16或MC38细胞植入Foxp3YFP-Cre（WT）小鼠和Foxp3+T细胞中携带Prdm1缺失的小鼠。
图2a-b展示了虽然B16和MC38肿瘤在WT小鼠中逐渐发展，但Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠肿瘤生长延迟。
然而，图2c-d展示Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠仍然以比WT小鼠更慢的生长速率促进肿瘤生长，而杂合Prdm1fl/+Foxp3YFPCre小鼠中Blimp1的部分缺失也阻止了肿瘤生长。
图2e为TIL CD4+Foxp3中IFNγ，TNFα和GzmB表达的免疫分析，显示与WT小鼠相比，试验组小鼠肿瘤浸润中CD4+Foxp3−T eff，CD8+T细胞和NK细胞表达显着更高。
除了这些效应细胞外，图2f-g显示与WT小鼠相比，树突状细胞（DC）和MHCII+M1型巨噬细胞相对于CD206+M2型巨噬细胞−Prdm1fl/flFoxp3YFPCre小鼠的肿瘤增加。
总体结果显示，在具有Foxp3特异性缺失Blimp1的小鼠中延迟的肿瘤生长和增强的抗肿瘤效应子应答，其与肿瘤中适应性和先天性效应细胞的活化增强相关。
验证了高表达，接下来就是验证TIL Blimp1缺陷型Treg细胞转化为效应T细胞，分析受损的抑制活性。
图3
作者接下来分析了来自这些荷瘤小鼠的Treg区室。与WT Treg细胞相比。
图3a-c为定量Treg细胞的频率和Foxp3 MFI（a）；Treg细胞中的IFNγ，TNFα和GzmB表达水平（b）或表达这些分子的TIL Treg细胞的频率（c），表明TIL Blimp1缺陷型Treg细胞不稳定并重新编程为T eff。图3d在用GVAX接种的Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠中也观察到TIL Treg细胞的转化。
相比之下，比较Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠与WT小鼠的脾Treg细胞的频率和效应分子表达没有显着差异，表明Blimp1缺陷型Treg细胞转化为T eff主要限于肿瘤区室。TIL Blimp1缺陷型Treg细胞的转化可能反映了这些细胞抑制活性的丧失。为了验证这一命题，作者使用从肿瘤中分离的Treg细胞与来自两组小鼠的脾脏进行体外抑制测定。
图3E为CTV标记的CD8+T细胞增殖的体外抑制在每个实验组中一式两份进行，显示了抑制率。发现来自WT小鼠的TIL Treg细胞能够抑制CD8+T细胞增殖而来自Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠的TIL Treg细胞对CD8+T细胞增殖的抑制大大降低。
整体图3分析了TIL Blimp1缺陷型Treg细胞转化为效应T细胞并显示受损的抑制功能。这些发现表明只有肿瘤中的Treg细胞被转化并且不再有效地抑制T eff。
三、主变量经由因变量调节表型
然后是必要性的验证，作者分析了Foxp3特异性缺失的Blimp1导致抗肿瘤体液免疫增加。
图4
接下来，作者分析了Blimp1缺陷型TFR细胞的转移诱导更好的抗肿瘤反应。
图4a-b为与WT小鼠相比，Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠在肿瘤中具有增加的TFH和GC B细胞频率；在脾脏中未观察到这种差异，并且来自两组小鼠的脾脏和肿瘤中的TFR细胞频率没有显着差异。尽管存在高滴度的血清IgG和抗OVA（肿瘤）IgG抗体，但在Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠中仅观察到轻微增加。相比之下，Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠血清IgE和抗OVA（肿瘤）IgE抗体滴度显着升高。
图4j观察到与对照小鼠相比，用携带Blimp1缺失的TFR细胞的滤泡T细胞转移的小鼠具有更小和延迟的肿瘤生长，其与总的，特别是OVA特异性的IgG和IgE增加相关。
接下来，作者证实了来自Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre荷瘤小鼠的血清能够增加巨噬细胞的抗肿瘤活性。
图5
图2g中作者发现肿瘤内M1增加Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠中的巨噬细胞。为了确定肿瘤中IgE增加如何影响针对肿瘤细胞的细胞免疫，作者进行IF分析IgE定位与肿瘤中巨噬细胞的关系。
图5a-b与WT小鼠相比，巨噬细胞标记物CD68与IgE或其受体FcεRIα的共染色显示Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠的肿瘤中IgE+CD68+和FcεRIα+CD68+细胞增加。此外，在Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre肿瘤中的所有IgE+细胞中，超过85%的细胞对CD68呈阳性，而较少的CD68− 细胞与IgE共染色，表明巨噬细胞是主要的IgE效应细胞。
然后，作者研究了这些小鼠中增加的Ab产生是否可以使用体外培养测定法促进巨噬细胞介导的吞噬作用和/或杀死肿瘤细胞。于是，将来自成年WT小鼠的BMDM与用或不用从Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre或WT荷瘤小鼠收集的相同体积的血清处理的CTV标记的B16-OVA细胞共培养。
结果发现在血清的添加增加了F4/80+CTV+细胞，并且用Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre血清处理后的这些细胞比WT血清更多（图5c），表明巨噬细胞的吞噬作用增加。
相应地，图5d观察到对于用Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre血清和巨噬细胞孵育的肿瘤具有最高的杀伤作用。通过用抗IgE预孵育血清来中和IgE活性显着减少了巨噬细胞介导的吞噬作用和肿瘤杀伤。
接下来是TCGA数据集的进一步分析，结果显示FceRI与CD68群体内的M1巨噬细胞标记物CD86正相关（图5e）。基于从TCGA数据集CD68，CD86和FCERIA中提取的3种因子的转录水平，推定的抗肿瘤巨噬细胞特征的定量测量，发现其高表达与更好的SKCM预后相关（图5f）。
图6
为了理解为什么Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠中的Treg改变在肿瘤中而不是在外周被选择性诱导，作者分析了来自Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠的TIL-eTreg细胞显示不同的转录组谱。
验证了来自WT的脾和TIL CD44+Treg细胞中，及TIL Blimp1缺陷细胞与WT eTreg细胞中共同存在的13个DEGs（图6a），表明Blimp1缺陷在eTreg细胞中施加的差异基因表达的程度很大程度上取决于组织微环境。
这些脾脏和肿瘤eTreg细胞关系的主成分分析还显示，无论Blimp1基因型如何，TIL eTreg细胞形成与脾脏eTreg细胞最远的组（图6b）。随后，进行了通路富集分析。
三、直接机制验证
接下来需要证实在Blimp1缺陷型Treg细胞中的必要性，是否可以回复Eomes促进肿瘤生长的表型。
图7
作者注意到，与WT eTreg细胞相比，TF Eomes在TIL Blimp1缺陷的eTreg细胞中高度上调（图6d、7a）。
于是，作者推断TIL Blimp1缺陷型eTreg细胞中增加的抗肿瘤活性和细胞毒性样遗传程序可能至少部分由Eomes的上调介导。
为了验证这个命题，图7b-c分析结果发现即使在比WT小鼠更大的程度上，Blimp1缺陷型Treg细胞中Eomes的缺失加速并增强了肿瘤生长。
对TIL Treg细胞的分析显示DKO小鼠具有与WT小鼠相似频率的Treg细胞，并且与来自试验组小鼠的Treg细胞相比，Foxp3表达增加（图7d）。
相应地，图7d-e发现尽管TFR频率没有显着变化，但与Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠的TIL相比，DKO TIL中的TFH和GC B细胞显着减少。
图7f则是DKO与Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠相比下，总IgG和未改变的抗OVA的 IgG水平也是增加的。
总之，这些结果表明，Blimp1缺陷型Treg细胞中Eomes的缺失阻止了它们的重编程并恢复了它们的抑制表型，这可能至少部分地促成了篡改的抗肿瘤反应和更大的肿瘤生长。
三、临床疗效验证
最后呢，作者为了进一步升华主变量的临床意义，验证了Treg细胞中Blimp1的缺失重塑TME并使肿瘤对抗PD-1治疗敏感。
图8
作者通过分析分选的CD45的基因表达来确定Blimp1特异性缺失对Treg/TFR抑制活性的破坏程度对肿瘤的影响程度（图8a-c）。
富集分析显示与IFN-1签名相关的基因（包括Mx2，Cxcl11，Oas2和Irf7）富集并下调，而Vegfa在CD45中上调。图8d显示除了MHCII和CD74，CD45− 来自Prdm1fl/flFoxp3YFP-Cre小鼠的细胞也上调PD-L1，尽管没有达到显着性，并且具有较少的Ki-67+增殖细胞。
所有这些发现表明，Treg细胞中Blimp1的缺失不仅增强了TIL抗肿瘤免疫细胞，而且改善了肿瘤免疫原性。
了解肿瘤与TIL Treg细胞之间的共生关系对于控制癌症治疗的Treg活性至关重要。本研究揭示肿瘤中的Treg细胞被TME印记并受Blimp1调节，Blimp1施加TIL Treg细胞，其具有独特的特征，负责其稳定的抑制和细胞毒性。Treg细胞中Blimp1的缺失将这些细胞重编程为T eff，其对TIL Treg细胞特异，但对外周Treg细胞不特异，导致抗肿瘤细胞和体液免疫增加，并且肿瘤生长减少。
此外，该Treg细胞的功能稳定性已被广泛研究，已有研究证实通过破坏Treg活性来重塑TME能够改善对抗PD-1治疗的反应。基于Blimp1标记具有高度抑制活性的TIL Treg细胞子集和Blimp1消耗对TIL Treg细胞的稳定抑制的特异性作用的发现，作者的研究揭示了Blimp1作为TIL Treg细胞的另一关键调节剂。该项研究证实了TIL Blimp1缺陷型Treg细胞是构成抗肿瘤效应物活性的新来源，靶向Blimp1+Treg细胞可产生强大的抗肿瘤作用，同时限制全身毒性。
作者在研究中，首先证实了肿瘤中富含Blimp1+ Treg和TFR细胞，即表达差异。并且结合临床信息分析，发现较高的肿瘤TFR信号提示黑色素瘤转移风险增加。Treg细胞中Blimp1的缺失导致抑制活性受损，并重新编程为效应T细胞，这在很大程度上仅限于肿瘤浸润的Treg群体。这种不稳定与抗肿瘤效应细胞反应增加、滤泡辅助性T细胞扩增、肿瘤IgE沉积增强和TFR细胞失调后的巨噬细胞活化相结合，重塑了肿瘤微环境并延缓了肿瘤生长。MHC上调增加的肿瘤免疫原性改善了对抗PD-1阻断的反应。从机制上讲，Blimp1通过一个依赖于Eomesodermin (Eomes)表达的独特转录程序来增强肿瘤内Treg细胞；Blimp1缺陷型Treg细胞中Eomes的缺失恢复了肿瘤生长并减弱了抗肿瘤免疫。
总之，作者的研究揭示了Blimp1是肿瘤浸润性Treg细胞的新的关键调节因子，也是调节Treg活性治疗癌症的潜在靶点。研究结果还揭示了两种含有FCERIA的免疫标记物作为黑色素瘤患者有希望的诊断或预后标记物。
好了，这篇近30分的联合TCGA数据库分析的高分文献就解读到这里了，下期再见了，拜拜！
参考文献
[1] Dixon ML, Luo L, Ghosh S, Grimes JM, Leavenworth JD, Leavenworth JW. Remodeling of the tumor microenvironment via disrupting Blimp1+ effector Treg activity augments response to anti-PD-1 blockade. Mol Cancer. 2021 Nov 20;20(1):150. doi: 10.1186/s12943-021-01450-3. PMID: 34798898; PMCID: PMC8605582.
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撰文丨菠小萝
排版丨四金兄
主编丨小雪球
关键词
T细胞
作用
Treg细胞
巨噬细胞
细胞中
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