外泌体实验不会做，高质量文献不会找，EV-TRACK帮你搞定哦~！

EV-TRACK：外泌体实验方法学数据库

哈喽~大家好！这里是每周一弘毅专栏。钟期既遇，奏流水以何惭！与解螺旋的小伙伴们相逢恨晚，我只想用小小文字助力你的SCI发表之路。前两周给大家分享的是miRNA搭讪外泌体蹭新潮和血液外泌体RNA数据库的戏码，想必不少小伙伴都蠢蠢欲动，恨不得赶紧把外泌体搞起来。秉承把饭喂到嘴里的少妇体验原则，这周就给大家带来外泌体实验方法学数据库EV-TRACK，做外泌体实验，哪里不会点哪里，快来康康哦~！

序章：外泌体分离与鉴定

外泌体（exosome）是胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）的一种，经由细胞胞吐作用而释放的脂质双层膜囊泡，大小在30~150nm，能够运载内源性蛋白质、脂质、ssDNA和RNA等信息物质，参与多种生物学过程。

EVs研究一般包括以下步骤：外泌体分离提取和鉴定，表达差异检测，功能验证和后续机制探索。

EVs的分离方法通常有多种，基于外泌体密度和大小特征的超速离心法、密度梯度离心法和超滤法，基于外泌体特异性标志物的免疫亲和捕捉法，以及基于不同溶解性和扩散性特征的沉淀法，方法各有优劣。鉴定方法有，纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）和Western blot等。其中NTA用于检测外泌体粒径大小，检测范围为1nm~1000nm；透射电镜用于观测检测外泌体形态特征，鉴定外泌体双层囊膜超微结构；Western blot检测外泌体表面markers，鉴定不同来源外泌体。文献中多见以上三种方法联合使用。

数据库概览

进入EV-TRACK主页（http://www.evtrack.org/），点击ABOUT可见数据库简介，往往不同细胞类型甚至是不同单个细胞类型来源的EVs，在大小和内容物如蛋白质、核酸与脂质等方面均不相同，而其他类似结构的细胞外大分子的存在，使得EVs分离和鉴定通常变得复杂。不同的分离方法可得到不同内容物组成和不同纯度的单个或多个EVs亚型，每种检测和表征方法在评价EVs方面都有其自身的优缺点。因此，常常表现为依赖于方法学的EVs表达和功能注释结果。故而EVs研究方法的实施需要有充足的实验条件参数来进行严格的质控，否则便会导致难以解释和复制的实验数据。鉴于此，国际细胞外囊泡学会（ISEV）引入EVs研究最低要求标准。EV-TRACK基于促进EVs研究的标准化目标，收录有关EVs生物学和方法学研究文献数据，在研究人员之间建立EVs相关实验条件参数的交流渠道，便于将实验规范应用于实际研究中，进而提高EVs研究相关实验数据的透明度、再现性和解释性。

主页可见，EV-TRACK目前包括1549个出版物和2803个实验数据，而且每年都有数据更新。右侧栏可见该数据库相关资讯，感兴趣的小伙伴可以点击查看。

数据库功能及操作演示

检索功能：点击Search进入检索功能页面，可输入的检索条件有EV-TRACK ID、Pubmed ID、Auther和EV-METRIC得分和其他多种条件。

需要说明的是，EV-METRIC反映数据库中收录的实验参数的透明度，以9个参数中已实现部分的百分比表示。研究人员在提交论文供同行评审之前获得此EV-METRIC，在上传所要求的实验参数后，分配到一个EV-TRACK ID，并计算出一个初步的EV-METRIC，可以写在稿件的“材料和方法”部分，期刊编辑和审稿人可以访问相应的EV-TRACK条目信息，查看稿件相关实验数据的全面概述。在文章发表后，管理员将计算最终EV-METRIC，并添加到数据库检索模块。值得注意的是，不一定EV-METRIC得分越高的文献质量越好，有时候研究者上传实验条件参数时有疏漏，EV-METRIC评分的意义在于评估实验的透明度和可重复性。上述9个参数分别介绍如下：

1、Protein analysis，蛋白质分析实验参数

（1）EV-enriched proteins，分析3种或更多种富集在细胞外囊泡的蛋白质；

（2）non EV-enriched protein，分析至少1种富集在非细胞外囊泡的蛋白质；

（3）antibody specifics，可参考的抗体货号和稀释度信息，为非必须筛选条件；

（4）lysate preparation，可参考的裂解液组成和货号信息，为非必须筛选条件。

2、Particle analysis，外泌体鉴定实验参数

（1）qualitative and quantitative analysis，定性和定量分析，定性分析如EM和AFM，定量方法如NTA、DLS、TRPS和高分辨率流式细胞技术；

（2）electron Microscopy images，提供大视野和近距离电子显微镜图像。

3、Experimental parameters related to EV separation include，外泌体分离实验参数

（1）density gradient，密度梯度；

（2）EV density，EV密度；

（3）ultracentrifugation specifics，超速离心的重力、持续时间和转子类型等细节信息，为非必须筛选条件。

检索时其他可输入的参数如下，包括样本类型、研究目标、外泌体分离和鉴定方法、物种信息、蛋白分析方法和发表年份，可按需选择。

举个栗子，检索人类血清来源外泌体的Biomarker研究，EV-METRIC评分≥22，涉及到蛋白质分析，外泌体鉴定方法包含定量和定性结果，以及电子显微镜图片，分别选择对应的参数，点击SEARCH进入结果界面。

首先，可以看到设置的检索参数，再看RESULT LIST，共有5个检索结果，列表展示各自对应的EV-TRACK ID、Experiment Number、物种信息、样品类型、分离实验方案、第一作者、出版年和EV-METRIC评分。点击Details栏加号，可查看详细信息。点击右上角DOWNLOAD CURRENT SEARCH，可以下载结果txt格式文件，点NEW SEARCH 返回检索页面。

以EV180026为例，点击加号显示详细信息如下，提供文献题目，可点击进入全文页面查看该文献研究方法部分。在Study data目录下，Protein markers为该研究涉及到的EVs相关蛋白，Separation protocol为外泌体分离方法，点击旁边问号可查看。

然后，点击MOST USED SEPARATION PROTOCOLS可查看该研究中用到的外泌体分离实验的ROTOCOLS，点击TOP EV-ENRICHED PROTEINS查看该研究中表达TOP10的蛋白质（这两张图好丑，原谅我对颜色分辨不敏感/捂脸.JPG）。

另外，在REVIEWERS & EDITORS模块还可以搜索其他研究者上传的暂未发表的实验数据；当然，也可以在MYEV-TRACK模块注册账号，并上传自己的实验数据。

文献案例演示

文献案例一：PMID: 33335695

本文作者发现EVs from red blood cells （RBC-EVs）在肝组织中天然累积，并可以被肝脏环境通过诱导巨噬细胞以依赖C1q的方式吞噬，因此RBC-EV可作为传递治疗肝病药物的天然工具。本研究相关实验参数的信息上传至EV-TRACK数据库，EV-TRACK ID为EV200089。

检索该研究实验数据，演示如下：进入EV-TRACK数据库，点击SEARCH进入检索页面，EV-TRACK ID栏输入EV200089，点击SEARCH进入结果页面，首先可见该研究概述。

页面下拉，点击SHOW ALL INFO可见该研究EVs相关实验全部信息，包括Study aim\Species\Sample type\Separation Method\Protein analysis\Particle analysis等信息，研究者在检索时设置合适的关键词，即可检索到该文献。

文献案例二：PMID: 33292256

既往研究表明，细胞外囊泡（EVs）可通过传递病毒成分、介导免疫反应以及可能的直接传播病毒方式，成为病毒感染过程中的重要角色。目前缺乏可靠且有效的分离、纯化并去除EVs携带病毒颗粒的方法，极大限制了开发针对EVs的临床诊疗方案。基于此，考虑需要克服EVs与病毒颗粒的大小、密度、膜组成和生物合成模式的相似性对EV研究带来的困难，作者建立了一种使用体积排阻色谱法（size exclusion chromatography）结和基于亲和力特征的纯化方案，从含乙肝病毒的血浆中纯化EVs，以不含病毒颗粒，以及HBV表面抗原、核心抗原和抗体或其他传染性物质为目标。本研究相关实验参数的信息上传至EV-TRACK数据库，EV-TRACK ID为EV200040。

检索该研究实验数据，演示如下：进入EV-TRACK数据库，点击SEARCH进入检索页面，EV-TRACK ID栏输入EV200040，点击SEARCH进入结果页面，基本同前。

吃水不忘挖井人，开发并维护数据库不易，小伙伴们使用EV-TRACK时，别忘记引用以下参考文献哦！

写在结尾

EV-TRACK Consortium, Van Deun J, Mestdagh P, et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nat Methods. 2017;14(3):228-232. doi:10.1038/nmeth.4185