circRNA, lncRNA and mRNA in human blood exosomes
嗨，小伙伴们大家好！这里是每周一弘毅专栏，我志向用小小文字助力你的SCI发表之路。上周给大家分享的是EVmiRNA数据库，老腊肉miRNA搭讪外泌体蹭新潮的戏码，这周我们继续外泌体话题，给大家分享exoRBase数据库，人类血液外泌体RNA表达谱数据和功能注释，跟着弘毅的脚步一起来康康吧~！
数据库概览
进入exoRBase主页（http://www.exorbase.org/）可见数据库简介，exoRBase由复旦大学医学院上海肿瘤研究所黄胜林教授课题组于2018年发表在Nucleic Acids Research杂志，该数据库基于归一化处理的人类血液外泌体RNA-seq数据和已发表文献数据进行整合，旨在表征人类血外泌体中circRNA、lncRNA和mRNA表达及可视化结果、功能注释和可能的组织来源信息，识别血液外泌体分子标记，为疾病循环标志物的发现和功能预测研究提供便利。
该数据库目前共收录92例血液样本，58330个circRNA、15501个LncRNA和18333个mRNA数据。点击Sample，可见其中包括健康对照者32例、冠状动脉心脏疾病患者6例、结直肠癌12例、肝细胞癌21例、胰腺腺癌14例、乳腺癌2例和全血样本5例。
点击FAQ，下拉至第7项可见该数据库整合的RNA-seq数据集，可通过GSE号在GEO数据库检索，或者点击Download进行相关数据集下载，包括表达谱数据、注释文件以及实验性验证文件。
点击Community，为该数据库整合的高质量文献信息。
另外，该数据库支持上传个人数据，仅考虑人类血液外泌体来源的circRNA，lncRNA和mRNA数据，并要求提取的血液外泌体满足ISEV（国际细胞外囊泡协会）最低要求。
数据库功能及操作演示
1. 信息浏览：Browse
首先，外泌体cirRNA信息浏览，可从主页点击进入，或点击Browse目录下cirRNA进入，以检索肝癌患者血液外泌体中表达上调的cirRNA为例，Samples types栏下拉菜单选择HCC，Detection frequency表示所有样本中检测到RNA的频率，填入0~1的数（0表示在任何样本中都没有检测到，1表示在所有样本中都能够检测到），Different group下拉菜单选择HCC（up），其他默认即可，其中Samples types栏允许输入单个或多个样本类型，点击Search得到检索结果。
结果栏中，Expression rank表示同一类型RNA表达水平排序，如0-10%表示表达水平在前十分位，点击Expression rank按照降序排列，以表达水平排在第一条的为例，该cirRNA在exoRBase中的ID为exo_circ_046669，circBase ID为hsa_circ_0017109可链接至circBase数据库，基因组位置为chr1:236029549-236038253，对应的Gene symbol为NID1，还有样本类型，表达差异组别，Validation栏信息表示没有对应的已发表文章的实验证据。
点击exo_circ_046669进入详情页面，首先是5种疾病和全血外泌体中表达情况，页面下拉是exo_circ_046669详细信息，比前文表格多了Cells/Tissues条目。
其次，外泌体lncRNA和mRNA信息浏览，同样可从主页点击进入，或点击Browse目录下lncRNA and mRNA进入，以检索结直肠癌患者血液外泌体中结肠组织特异性的表达上调的lncRNA和mRNA为例，Samples types栏下拉菜单选择CRC，Gene type下拉菜单选both，Tissue specificity表示在某个特定组织中特异性表达，此处勾选Colon，Detection frequency填入0~1的数，Different group下拉菜单选择CRC（up），其他默认即可，同样Samples types栏允许输入单个或多个样本类型，点击Search得到检索结果。
检索到一条结果，表格内容与前文类似，另外可见组织特异性评分，有2条与之相关的circRNA，可用于ceRNA候选，点击进入可查看其表达情况可视化结果，底部可选择以热图或线图形式展示。
页面下拉，是2条circRNA详情，点击Box plot栏可显示不同疾病来源外泌体中表达值箱图，点击circRNA ID查看详情，内容同前文。
2. 检索功能：Search
首先，首页快速搜索功能，输入示例TRAF3，点击Search得到结果，内容基本同前文类似，可见12条与之相关的circRNA，点击可查看其表达情况可视化结果，点击Box plot栏可显示不同疾病来源外泌体中表达值箱图，点击Gene symbol查看TRAF3详情。
然后，Search模块，点击进入检索界面，包含lnRNA and mRNA、circRNA、Chromosome region共3个子模块，如下图所示，可分别输入多个Gene symbol和circRNA ID或输入基因组位置信息进行检索。以Chromosome region示例，点击Search进入结果界面，此功能可供查询暂未命名的新发现circRNA。
结果得到8个位于目标基因组位置的circRNA，同前，可逐一浏览其在不同疾病来源外泌体中表达值可视化结果，具体的基因组位置信息，对应的Gene symbol有3个，样本类型有4个来源，还有表达差异分组等信息。
文献单图复现
文献案例一：PMID: 33169793，IF=2.943分
本文旨在探索在胰腺癌临床预后中有预测价值的胞外囊泡相关基因，前文基于TCGA和ICGC胰腺癌转录组测序数据差异分析，构建PPI网络，并进行通路富集分析和生存资料分析，获得与肿瘤微环境相关的15个基因（GPR18，GPSM2，CXCR5，CX3CR1，CNR2，NMU，GNGT1，NPY1R，SSTR5，GIP，NTS，LEP，H3F3C，HIST2H3C和HIST1H2BC），而后通过HPA和GEO数据库验证其蛋白和mRNA水平表达情况，最后在exoRBase数据库分析得知，与正常组织相比，其中CXCR5，HIST2H3C，CNR2, CX3CR1和GPR18共5个基因在肿瘤来源外泌体中的表达有显著差异，如下图Figure9。
单图复现如下：进入exoRBase主页，点击Search，点击lncRNA and mRNA，然后分别输入15个基因，以逗号隔开，点击Search得到检索结果。
选择以热图形式展示如下，右上角可下载图片，即原文Figure9A。
页面下拉，分别点击CXCR5，HIST2H3C，CNR2, CX3CR1和GPR18这5个基因Box plot获得在不同疾病来源外泌体中的表达值箱图结果，即Figure9B~F。值得注意的是，不知是否作者疏忽或是数据库更新导致，表格中可以看到的是，在胰腺癌中只有2个基因显著差异表达，GPR18表达显著下调，HIST2H3C表达显著上调。
最后在PS或AI中，将获得的A~F图片进行组合，编号，即可得到原文Figure9如下，网站下载的图片规格基本一致，只需要遵循对齐的原则即可。
文献案例二：PMID: 33292256，IF=4.175分
本文探讨结直肠癌（CRC）外泌体中hsa_circ_0004831及其参与的ceRNA网络对CRC临床预后的预测价值，首先从exoRBase数据库获得CRC患者和正常组织来源的外泌体circRNA和mRNA表达矩阵进行差异分析，结果得知hsa_circ_0004831在CRC中表达水平平均增加3.92倍，在Figure3A中展示。而后从BBCancer数据库下载相应的细胞外囊泡miRNA表达矩阵进行差异分析，获得显著下调的13个miRNA，进一步从Circbank数据库获得hsa_circ_0004831可能结合的22个miRNA，二者取交集获得一个结果，即hsa-miR-4326与hsa_circ_0004831可能存在ceRNA关系。此后，作者在TargetScan预测到hsa-miR-4326靶基因3629个，与之前exoRBase数据库mRNA差异分析结果显著上调的mRNA取交集，获得12个mRNA，均与hsa_circ_0004831表达存在正相关关系，最后通过PCR验证50名健康志愿者和81例CRC患者血液样本中的外泌体mRNA表达情况，12个mRNA中ZBED1显著上调。因此可知，hsa_circ_0004831/hsa-miR-4326/ZBED1 mRNA构成ceRNA关系。本文Figure3A和Figure5C均可利用exoRBase进行复现，方法类似，原文利用limma包实现差异分析及可视化，现以Figure3A为例，通过Excel+prism演示如下。
单图复现如下：进入exoRBase主页，点击Download，分别下载CRC来源和正常患者来源的外泌体circRNA、mRNA数据集和注释文件，备用。
用Excel打开注释文件，circBase_ID列查找hsa_circ_0004831，查到其对应的exoRBase数据库ID为exo_circ_011671。
用Excel打开CRC来源外泌体circRNA数据文件，在exo_circ_ID列查找exo_circ_011671，将其对应的CRC1~CRC12样本表达量值复制到Graphpad Prism，同理将正常患者来源外泌体circRNA数据集文件中exo_circ_011671行对应的N1~N32样本表达量值复制到Graphpad Prism。
在Graphpad Prism中绘制散点图，添加标题和差异性指标，修缮细节后，如下图所示，即原文Figure3A。

乌鸦反哺，羔羊跪乳！吃水不忘挖井人，开发并维护数据库不易，小伙伴们使用exoRBase数据库时，别忘记引用以下参考文献哦！

写在结尾
Li S, Li Y, Chen B, Zhao J, Yu S, Tang Y, Zheng Q, Li Y, Wang P, He X, Huang S. exoRBase: a database of circRNA, lncRNA and mRNA in human blood exosomes. Nucleic Acids Res. 2018 Jan 4;46(D1):D106-D112. doi: 10.1093/nar/gkx891. PMID: 30053265; PMCID: PMC5753357.
好啦~这期关于exoRBase数据库加餐就到这里！食不厌精，脍不厌细，美食需要用心烹饪，更需要用心细品，小伙伴们莫要着急，外泌体这道大餐会慢慢呈现给大家~欲知更多生信知识，我们相约“挑圈联靠”公众号~下期再见了~！
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撰文丨弘   毅
排版丨四金兄
值班 |菠小萝

主编丨小雪球

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