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众所周知，细胞内遗传信息由mRNA到蛋白的传递需要核糖体这一分子机器的参与。翻译过程可分为起始、延伸、终止和循环4个阶段，其中延伸阶段可进一步被划分为3个步骤: 解码、肽转移和移位1。
随着冷冻电镜的兴起，延伸阶段的很多中间状态已经被解析，但由于结构解析所用的核糖体被抗生素、GTP类似物或突变锁定在特定状态1-3，细胞内真实、动态的翻译过程仍然是个谜。Cryo-ET的发展使得在细胞原位对核糖体进行成像成为可能，但在过去的研究中，核糖体的分辨率仍停留在纳米级别4，尚不足以支持研究人员发现更多的动态细节。
2022年9月28日，来自欧洲分子生物学实验室 (EMBL)的Julia Mahamid在Nature上在线发表了一篇题为Visualizing translation dynamics at atomic detail inside a bacterial cell的论文，利用cryo-ET解析了M. pneumoniae核糖体的一系列结构，从而构建出细胞内翻译过程的动态谱图 (图1)。此外，研究者还解析了氯霉素 (Cm)、奇霉素 (Spc) 或pseudouridimycin (PUM) 处理细胞后核糖体的原位结构，展示了抗生素是如何重塑翻译过程的。
图1. 核糖体在翻译过程中的一系列动态变化
研究人员首先对未经抗生素处理的M. pneumoniae进行cryo-ET数据采集，对数据集中所有的核糖体进行平均，得到了整体分辨率为3.5 Å的密度图。对30S小亚基和50S大亚基进行进一步的数据处理，可使密度图的质量得到进一步提升，rRNA以及核糖体蛋白氨基酸残基的侧链均清晰可见 (图2)。
图2. M. pneumoniae核糖体的整体结构
对得到的101,696个核糖体进行进一步的分类，结合延伸因子和tRNA结合的特征，研究者获得了10种不同的处于延伸阶段的核糖体结构，整体分辨率在4~10 Å，处于延伸阶段的核糖体占所有核糖体总数的70%。通过将之前所得的原子模型对接进这些密度图，研究者描绘出了核糖体在延伸过程中构象以及组成上的一系列变化 (图1)。
在这10类不同状态的核糖体中，经典的‘A,P’态丰度和分辨率均最高，能够清楚看到mRNA、tRNA以及新生肽段的密度。结合整个谱图，可以发现核糖体内部亚基持续不断的旋转可以导致有效的移位，为延伸因子EF-G的结合提供条件。
核糖体是抗生素最为重要的靶点之一，许多抗生素都是通过将核糖体阻遏在特定的中间态发挥作用的。在前述结构的基础上，研究者进一步探究了Cm、Spc、PUM等抗生素对翻译机制的影响。在Cm处理的细胞中，由于Cm结合在50S大亚基的肽转移中心，转肽反应受到抑制，72%的核糖体被阻遏在‘A,P’态；而在Spc处理的细胞中，67.5%的核糖体被阻遏在‘EF-G,A/PSpc,P/E’态，类似于未处理细胞中的‘EF-G,A/P,P/E’态 (图1, class 7)，在30S小亚基的颈部可以清楚地看到Spc的密度 (图3)。PUM通过抑制RNA聚合酶从而影响转录-翻译偶联，在结构中可观察到59.5%的核糖体处于‘EF-G,A/PPUM,P/E’态，类似于未处理细胞的‘EF-G,A/P,P/E’态以及Spc处理后的‘EF-G,A/PSpc,P/E’态。
图3. 抗生素影响了核糖体延伸状态
对同一mRNA进行翻译的核糖体会在空间上相互靠近，形成多聚核糖体，进一步对处于翻译活跃过程中的核糖体进行空间上的分析，发现多聚核糖体相邻的核糖体之间主要采取2中空间排布：即top-top (t-t; 78.5%, mRNA exit-to-entry distance 4.2 ± 1.4 nm) 或top-back (t-b; 21.5%, 5.4 ± 1.5 nm)。而对于较长的多聚核糖体而言，核糖体可能会组装得比较松散，也可能紧密堆叠 (图4)。
图4. 转录延伸各阶段核糖体在细胞内的空间分布
多聚核糖体内翻译是同步化进行，抑或核糖体之间存在相互配合，是一个领域内一个长期存在的问题。通过对多聚核糖体上前后相邻两个核糖体所处状态出现的配对概率进行分析，发现靠后的核糖体更易处于需要延伸因子结合的状态 (图1, class 1、2a、5)。提示在延伸过程中，相邻核糖体可能通过阻碍延伸因子的结合存在相互协调。
对多聚核糖体中两个核糖体之间的接触界面进行进一步的数据处理，发现前一个核糖体的L9采取延伸构象，其C端结构域插入下一个核糖体中延伸因子的结合位点 (图5)，而这种构象在所有的L9中占了20.2%。
图5. 紧密堆叠的多聚核糖体之间存在两个核糖体之间的相互作用
综上，本文第一次在细胞内以如此精细的尺度观察到了核糖体在翻译延伸过程中的一系列动态变化。为理解核糖体功能的执行、空间上的协同性以及抗生素的作用机制提供了更近一步的信息。本文的数据处理基于作者所在团队前期开发的针对cryo-ET数据处理的算法5。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-022-05255-2
参考文献
参考文献
1.Voorhees, R. M. & Ramakrishnan, V. Structural basis of the translational elongation cycle. Annu. Rev. Biochem. 82, 203–236 (2013).
2.Rodnina, M. V. Translation in prokaryotes. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 10, a032664 (2018).
3.Brown, A. & Shao, S. Ribosomes and cryo-EM: a duet. Curr. Opin. Struct. Biol. 52, 1–7 (2018).
4.O'Reilly, F. J. et al. In-cell architecture of an actively transcribing–translating expressome. Science 369, 554–557 (2020).
5.Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P. & Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome–antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat. Methods 18, 186–193 (2021).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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