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叶酸是一碳转移反应中关键的辅助因子，对于核酸的合成不可或缺1。哺乳动物由于缺乏叶酸从头合成途径，依赖于从食物中摄取叶酸2。对人类而言，还原型叶酸载体蛋白 (human reduced folate carrier, hRFC) 在细胞对叶酸的摄取中发挥主要的作用， hRFC也是化疗药甲氨蝶呤 (methotrexate, MTX) 主要的作用靶点3，编码RFC的基因突变会导致对叶酸拮抗剂耐药性的发生。
hRFC又称SLC19A1，属于SLC19家族，为有机阴离子转运体4,5，主要通过转运硫胺素单磷酸 (thiamine monophosphate, TMP) 或硫胺素焦磷酸 (thiamine pyrophosphate, TPP) 驱动还原型叶酸和叶酸拮抗剂的反向转运6。相比于叶酸和其他阴离子化合物，RFC对还原型叶酸和叶酸拮抗剂具有明显的偏好性，除此之外，hRFC对其他一系列的有机或无机阴离子都具备一定的转运能力。虽然对RFC的研究可追溯至上世纪60年代，但其转运叶酸或叶酸拮抗剂的分子机制仍不清楚。
2022年9月7日，来自杜克大学的Seok-Yong Lee团队在Nature上在线发表了题为Methotrexate recognition by the human reduced folate carrier SLC19A1的科研论文。文章揭示了hRFC无底物结合以及结合MTX的冷冻电镜结构。在此基础上，研究人员结合分子动力学模拟和一系列功能验证，提出了hRFC选择性转运叶酸和叶酸拮抗剂的分子机制，并对其阴离子选择性做出了解释。
hRFC缺乏可见的胞外结构域，且分子量仅有60 kDa，给结构解析带来了极大的困难。通过在TM6与TM7之间融合Bril28，作者解析得到了hRFC无底物结合状态3.6 Å的结构以及结合MTX 3.8 Å的结构，但在结合MTX的结构中，并未明显观察到相应的信号。
由于蛋白纯化条件或小分子本身结合特性的影响，MTX在hRFC中的结合可能是动态的。为了进一步稳定MTX，研究者利用偶联了N-羟基丁二酰亚胺的MTX (NHS-MTX) 对hRFC的K411进行共价修饰，最终解析得到hRFC结合MTX 3.3 Å的结构，且配体结合的位置能够确定 (图1)。hRFC为经典的MFS fold，本文最终得到的3个结构均呈向内开口构象。hRFC的TM1、TM4和TM7不连续，共同围绕形成中央腔隙，腔隙中容纳有MTX。
图1. hRFC结合MTX的密度图
hRFC的中央腔隙高度保守，含有电性相对的两个区域。靠近胞内的一侧为正电环 (electropositive ring)，含R42、R133、R373和K411。另一侧为负电口袋 (electronegative pocket), 含E45、E123和D310。在非洲爪蟾卵母细胞中对氨基酸残基的功能进行验证，发现这些氨基酸残基的突变会导致hRFC对MTX的摄取能力下降，提示hRFC中央腔隙中的化学环境对蛋白功能有重要的影响。
图2. hRFC的中央腔隙可以分为电性相对的两个区域
MTX整体分为3部分：蝶啶环、对氨基苯甲酸酯 (p-aminobenzoate, PABA) 和L-Glu。在正电环内，L-Glu的α-carboxylate与TM4上的R133相互作用，对比无底物结合与结合MTX的结构，可发现存在以R133为中心的轻微构象变化。在负电口袋附近，PABA周围存在Y126、M130和Y286。负电口袋内的蝶啶环与TM1上的氨基酸残基存在密切的相互作用，其中E123尤其重要。在功能试验中，这些氨基酸残基的突变，在很大程度上影响了RFC对MTX的摄取 (图3)。

图3. MTX与周围氨基酸残基的相互作用以及各种叶酸拮抗剂的结构
通过对hRFC的一系列底物进行结构上的比对，研究人员发现这些底物的主要差异在它们的杂环部分。如在MTX中，杂环为蝶啶环，而在培美曲塞 (pemetrexed, PMX) 的相应位置，蝶啶环被吡咯并嘧啶环所取代 (图3)。结合结构分析，研究人员认为I48与E123可能在hRFC对还原型叶酸和叶酸拮抗剂的选择性中发挥重要的作用，在冷竞争试验中，I48F会改变hRFC对底物的选择。
在之后的全原子分子动力学模拟中，研究者发现，当MTX与hRFC以共价键结合时，MTX在中央腔隙中的维持保持恒定，而当二者之间的共价键去除后，虽然蝶啶环在负电口袋中仍保持相对固定，但L-Glu在正电环内高度动态，与3个保守的精氨酸残基 (R133、R157和R373，后称精氨酸三联体) 相互作用，R133在L-Glu的稳定中起关键作用。
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在KCl存在情况下，对不结合MTX的hRFC进行模拟，发现在R133和R373之间氯化物的概率密度最高，R157附近的密度相比之下更为分散。通过引入K411Q、R373K和K393M改变电性，可使K+结合在负电口袋中。结合结构、分子动力学模拟和功能试验数据，研究人员提出了hRFC转运阴离子和MTX的可能机制 (图4)：当细胞膜外表面带正电时，hRFC易于在向外开口的构象下结合阴离子。在蛋白从向外开口转变为向内开口时，精氨酸三联体稳定了底物的结合，而高度动态的R157可能在阴离子交换中发挥更重要的作用。
图4. hRFC阴离子交换和转运和模型
此外，通过比对本文结合MTX的hRFC结构与结合PMX的质子偶联叶酸转运体 (proton-coupled folate transporter, PCFT) 结构，作者提出了优化药物优化的方向。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05168-0
参考文献
参考文献
1.Zheng, Y. & Cantley, L. C. Toward a better understanding of folate metabolism in health and disease. J. Exp. Med. 216, 253–266 (2019).
2.Hou, Z. & Matherly, L. H. Biology of the major facilitative folate transporters SLC19A1 and SLC46A1. Curr. Top. Membr. 73, 175–204 (2014).
3.Matherly, L. H., Hou, Z. & Deng, Y. Human reduced folate carrier: translation of basic biology to cancer etiology and therapy. Cancer Metastasis Rev. 26, 111–128 (2007).
4.Hou, Z., Ye, J., Haska, C. L. & Matherly, L. H. Transmembrane domains 4, 5, 7, 8, and 10 of the human reduced folate carrier are important structural or functional components of the transmembrane channel for folate substrates. J. Biol. Chem. 281, 33588–33596 (2006).
5.Ganapathy, V., Smith, S. B. & Prasad, P. D. SLC19: the folate/thiamine transporter family. Pflugers Arch. 447, 641–646 (2004).
6.Zhao, R., Gao, F. & Goldman, I. D. Reduced folate carrier transports thiamine monophosphate: an alternative route for thiamine delivery into mammalian cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C1512–C1517 (2002).
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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