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人工构建具有真实细胞相似功能的合成细胞或原细胞（protocell）是一项跨越合成生物学、生物工程和生命起源研究等多个领域的全球性重大挑战。截至目前，人工合成细胞体系采用的主要工程手段包括使用自组装囊泡1、半透性微胶囊2或无膜的凝聚层微液滴3等对体外获得的某些活性组分（如酶等）进行包裹，从而模拟活细胞实现酶催化1,2、基因表达4等不同的功能。然而，这些基于传统微区室化方法构建的原细胞很难实现组成多样性和化学互补性，并且功能往往比较单一，极大限制了自主性仿生系统研究的发展。因此，如何实现高度组成复杂性和功能多样化人工合成细胞自下而上的构建，仍然是生物和非生物界面之间亟待解决的问题。
2022年9月14日，英国布里斯托大学Stephen Mann教授和李梅（Mei Li）博士共同通讯在国际综合学术期刊Nature上在线发表了题为“Living material assembly of bacteriogenic protocell”的研究论文，该研究打破了传统利用非生命物质构建人工细胞的方法，开发了一种以原核细胞为原材料的活体材料组装工艺，该工艺使用聚合物聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）/三磷酸核苷凝聚层微滴来捕获和空间分离细菌菌落，进而通过原位裂解细菌菌落，构建出有膜的、分子密集且组成、结构和形态复杂的功能性原细胞。
为了实现细菌源性原细胞的内源性组装，研究者首先使用PDDA/ATP构建了直径为5-30 μm的凝聚层微滴，作为原细胞的微型装配场所。当将PDDA/ATP凝聚层微滴与大肠杆菌（E. coli）和铜绿假单胞菌（PAO1）混合孵育时，几分钟内大肠杆菌即可被捕获至凝聚层微滴内部（绿色荧光），而PAO1则在凝聚层微滴表面附着环绕形成薄的细胞壳（红色荧光）。同时，凝聚层微滴稳定性未被破坏，且互相之间不会发生融合，在溶液环境中均匀分散。
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通过定量流式细胞荧光分选（FACS）分析证实，凝聚层微滴与细菌孵育5分钟后，细菌的捕获效率均较高，其中大肠杆菌的捕获效率可达40%，而PAO1可达50%，而两种细菌的共同捕获效率也可达35%（图1a-c）。进一步对单个凝聚层微滴的时间依赖性荧光测量分析显示，当凝聚层微滴内部充满大肠杆菌且表面的PAO1细胞壳组装完成后，二者分别携带的eGFP和mCherry荧光强度值的逻辑生长率也达到阈值（图1d）。此外，在细菌被凝聚层微滴捕获后，仍可保持较好活性，其24小时的存活率仍可达73%（图1e）。
图1 凝聚层微滴自发捕获细菌菌落分析
在组装了稳定的活体凝聚层微滴后，研究者使用溶菌酶和蜂毒肽对共同捕获的细菌菌落进行逐步原位裂解，从而使细菌的细胞膜成分和细胞质成分释放至相邻的凝聚层微滴（图2a）。当裂解时间较短时，外部的PAO1细菌层被裂解并在凝聚层微滴外部形成一层300-500 nm厚的细胞膜，而内部大肠杆菌仍保持活性（图2b）。
当继续延长裂解时间，两种菌均会发生裂解，从而产生结构和组成复杂的原细胞，其主要由PAO1菌的脂质形成空间分离的细胞膜，同时该膜包裹着主要由大肠杆菌细胞质成分和PAO1膜化水泡构成的凝聚层基质（图2c）。由PAO1衍生的细胞膜可以通透小分子荧光染料以及大分子溶质，而内部的蛋白和多聚核苷酸由于与凝聚层基质的较强亲和力不会持续从原细胞内部渗出。
由此获得的原细胞继承了原始细菌的多种组分和特性，包括蛋白质、脂质、RNA和DNA等成分。其中，两种细菌蛋白组合文库中约83%共2237种蛋白质被保留下来，且大肠杆菌的留存比例高达97%，PAO1为65%。这些蛋白从分子功能方面而言，43%起催化作用，32%起结合作用，14%负责维持结构。
图2 细菌源性原细胞构建
随后，研究者通过功能性酶活性、原代谢通路（糖酵解）和信息网络（基因表达）三个方面对构建的原细胞进行了仿生特性研究。碱性磷酸酶、脂酶、蛋白酶和β半乳糖苷酶均展现出了明显的酶催化活性（图3d-f），同时原细胞可以进行糖酵解过程（图3g-h）。此外，原细胞还可以对外源deGFP质粒进行表达（图3k-m）。
图3 细菌源性原细胞的仿生特性
进一步使用DNase I和MnCl2对内部继承的细菌DNA线性化并添加组蛋白和羧甲基葡聚糖，在原细胞的细胞质样内部则会自发进行液-液相分离形成无膜类细胞核的单个细菌DNA-组蛋白凝聚物（图4a）。施加低渗条件处理时，重塑的原细胞内部会出现膜化水泡，展现出多种类型空间分隔的仿生结构（图4g）。当加入G-actin和Mg2+后，二者很容易被原细胞吸收，并且凝聚层的ATP可内源性激活原位F-actin组装（图4a）。
图4 细菌源性原细胞增强与重塑
由于高浓度的ATP导致形成的F-actin纤维丝较短，研究者又重新使用PDDA/UTP构建了原细胞，并在内部包裹了PK/PEP/ADP 级联以产生ATP促进F-actin组装（图4i）。在约20分钟时间内，此类原细胞产生的ATP即可实现原细胞内部的重组，并且荧光显微图像也显示原细胞内部存在局部低密度F-actin网络，分散于原细胞胞质样区域内，而不存在于DNA-组蛋白凝聚物中（图4j-m）。
然而，PK/PEP/ADP 级联并不能实现原细胞供能的自给自足。为了完成原细胞内部属性的偶联及其自主性能，研究者将活的大肠杆菌植入原细胞作为替代线粒体实现内源性ATP生成（图5a）。荧光显微图像表明，活的大肠杆菌被原细胞特异性隔离于胞质样区域中，且被包裹3h后依然保持存活（图5b-c）。时间依赖性FACS分析显示，大肠杆菌在48h内增加约10倍，但活细胞比例从1h时的99%下降至60%，然而原细胞内部的蛋白质浓度则增加了3倍（图5d-e）。
当在培养基中加入葡萄糖时，内源性ATP开始生成，且持续时长可达36h，ATP最高浓度达1.65 mM；持续补充葡萄糖，可持续诱导ATP生成（图5f）。同时，ATP生成还促进了酶活性增强和基因表达延长，以及原细胞内F-actin聚合水平增加，从而产生类细胞骨架的自支撑系统（图5j）。由此构成的完整原细胞在水和盐溶液中可保持结构完整至少7天，而无F-actin网络则只能保持3天。
图5 细菌源性原细胞的活细胞供能
最后，研究者试图利用构建的细菌源性原细胞内代谢产物的连续生成和积累实现原细胞膜界面张力的改变，进而生成非球形形态的活细胞/合成细胞杂合体。结果表明，内部含有活性大肠杆菌和F-actin网络支撑系统的细菌源性原细胞形态发生了进行性变化（图6a）。在48h内，大部分球形原细胞变为不规则的变形虫似形状，但仍保持着复杂的内部组成和外膜结构（图6b）。整个过程中，每个原细胞内部的平均大肠杆菌数在前24h内增加约8倍，此后至48h，活菌数量减少约35%（图6c）。同时，细菌生长与原细胞体积增加两倍相关联（图6d）。
图6 活细胞介导的细菌源性原细胞形态发生
综上所述，该研究证明了一种自下而上构建功能性原细胞的细菌源性策略（图7），为制造新的合成细胞模块和增强活体/合成细胞构造体提供了机会，在工程合成生物学和生物技术中具有潜在的应用。未来，通过不同的工程菌做基础材料，可以构建更强大复杂的代谢网络和基因回路，从而实现更高水平的人工合成细胞可编程性，进而应用于医疗及生物制造等多领域。
图7 细菌源性原细胞构建流程图5
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-022-05223-w
参考文献
参考文献
1.Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., & Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature chemistry, 9(5), 431-439 (2017).
2.Huang, X., Li, M., Green, D. C., Williams, D. S., Patil, A. J., & Mann, S. Interfacial assembly of protein–polymer nano-conjugates into stimulus-responsive biomimetic protocells. Nature communications, 4(1), 1-9 (2013).
3.Martin, N. Dynamic synthetic cells based on liquid–liquid phase separation. ChemBioChem, 20(20), 2553-2568 (2019).
4.Küchler, A., Yoshimoto, M., Luginbühl, S., Mavelli, F., & Walde, P. Enzymatic reactions in confined environments. Nature nanotechnology, 11(5), 409-420 (2016).
5.Yewdall, N. A. Life brought to artificial cells. Nature, (2022).
供稿 | 丛野
审稿 | 王彤彤
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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