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Bestrophins (BESTs) 是一类广泛分布于上皮细胞和神经细胞的Ca2+激活阴离子通道1。其中，BEST2是在睫状体非色素上皮中高表达的一种亚型2，与房水稳态以及眼内压 (intra-ocular pressure, IOP) 密切相关，靶向BEST2及其调节蛋白或许对开角型青光眼的治疗具有一定的作用3。
图1. Bestrophin作为阴离子通道发挥作用4
Neck和aperture作为BEST通道中最狭窄的区域 (图1)，直径在BEST2中要显著大于BEST15。BEST1能够介导星状细胞中谷氨酸盐、γ-氨基丁酸等神经递质的传递6，但目前尚不清楚BEST2是否同样具备对这些神经递质的通透性。值得一提的是，作为中枢神经系统最丰富的神经递质，谷氨酸在生理情况下绝大部分以谷氨酸盐的形式存在，并能直接被谷氨酰胺合酶 (glutamine synthase, GS) 转化为谷氨酰胺，如果BEST2具备对谷氨酸盐的通透性，是否有可能与GS存在一定的相关性？
2022年10月26日，来自哥伦比亚大学的杨婷婷在Nature上在线发表题为Bestrophin-2 and glutamine synthetase form a complex for glutamate release的科研论文，分离并解析了牛睫状体中BEST2与GS形成的复合物。结合结构信息和生化实验，研究者发现二者的生理功能存在密切的相关性：1）BEST2能将GS招募到细胞膜上，从而降低GS整体的催化活性；2）在胞内谷氨酸盐浓度较低的情况下，GS抑制了BEST2的通道活性；3）GS增加了BEST2对胞内谷氨酸盐的敏感性，使谷氨酸盐更容易促进通道的开放。
为了鉴定BEST2的互作蛋白，研究者首先纯化了牛的BEST2 (bovine BEST2, bBEST2) 并与牛睫状体的溶胞产物共孵育，结合质谱确定与BEST2相互作用的蛋白，最终鉴定得到了GS这一靶标。在后续的验证实验中，研究者利用HEK293细胞对人或牛的GS和BEST2进行共表达以及免疫共沉淀，进一步确定了二者之间的相互作用 (图1, a)。
图1. bBEST2-bGS复合物整体结构
为了解析复合物结构，研究者分别纯化了bBEST2和bGS，将2种蛋白在冰上孵育后进行冷冻样品制备和数据采集。bBEST2以五聚体的形式存在，两个bGS五聚体背靠背形成十聚体，与bBEST结合，复合物整体为C5对称，结构中的bBEST2处于通道关闭状态，bGS处于无底物结合状态 (图1)。bBEST2的离子传递通道延伸至bGS的中央腔隙中，bGS中央的亲水性腔隙在结构上与bBEST的通道相延续，在后续的实验中，通过将腔隙中的G12突变未Ile、Met、Trp或Asp，研究者发现GS的中央腔隙在功能上也成为了BEST2通道的一部分。
在本文结构的基础上，研究者通过检测细胞Ca2+依赖的Cl-电流进一步探究了BEST2与GS在功能上的联系。在细胞过表达人BEST2 (human BEST2, hBEST2) 的基础上，是否共表达人GS (human GS, hGS) 并不影响hBEST2对Ca2+的敏感性，但当细胞共表达hBEST2和hGS时，电流的幅度明显下降 (图2)，提示hGS对hBEST2的功能存在一定的抑制作用。
图2. GS导致BEST2电流幅度降低
在只转染hGS、不转染hBEST2的情况下，hGS无法在细胞的膜组分中被检测到。而当二者共转染时，在膜组分和胞质组分中均能检测到一定水平的hGS，于此同时，hGS的整体催化效率明显降低 (图3)。由于结构中底物进入bGS活性中心的路径并未被bBEST2占据，研究者推测BEST2可能通过募集GS，将其锚定在细胞膜上，从而使GS的整体催化活性降低。
图3.与BEST2共表达后，GS活性显著下降
鉴于BEST2与GS之间的相互作用，研究者进一步探究了GS的底物——谷氨酸盐是否具备通过BEST2的潜能。在膜片钳内外液主要阴离子均为谷氨酸盐的情况下，研究者记录到了显著的电流，证实瞬时HEK293细胞瞬时表达的hBEST2对谷氨酸盐的通透性。后续进一步分析证实hBEST2对谷氨酸盐的通透具有方向性——对胞内侧谷氨酸盐的敏感性要显著高于胞外侧，且谷氨酸盐需要从胞内侧促进hBEST2的开放 (图4)。
图4. hBEST2对谷氨酸盐通透的方向性
基于以上的发现，BEST2或许存在某种针对谷氨酸盐的门控机制，而neck与aperture这两个通道中缩窄的部位更可能是发挥这种门控机制的关键。结合电生理分析，研究者发现neck和aperture在谷氨酸盐透过的方向性中发挥重要的作用，而GS对BEST2的抑制作用主要与aperture相关。
综上，研究者提出了BEST2转运谷氨酸盐的模型 (图4)：胞内谷氨酸盐结合BEST2后导致通道开放，随后谷氨酸盐通过BEST，谷氨酸盐诱导的BEST2通道开放也揭示了BEST2对谷氨酸盐的选择性。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586
-022-05373-x
参考文献
参考文献
1. Owji AP, Kittredge A, Zhang Y, Yang T. Structure and Function of the Bestrophin family of calcium-activated chloride channels. Channels (Austin). 2021;15(1):604-623.
2. Zhang, Y., Patil, R. V. & Marmorstein, A. D. Bestrophin 2 is expressed in human non-pigmented ciliary epithelium but not retinal pigment epithelium. Mol. Vis. 2010;16, 200–206.
3. Heijl, A., Leske, M. C., Bengtsson, B., Hyman, L. & Hussein, M. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 2002;120, 1268–1279.
4. Kunzelmann K. TMEM16, LRRC8A, bestrophin: chloride channels controlled by Ca(2+) and cell volume. Trends Biochem Sci. 2015;40(9):535-543.
5. Heijl, A., Leske, M. C., Bengtsson, B., Hyman, L. & Hussein, M. Reduction of intraocular pressure and glaucoma progression: results from the Early Manifest Glaucoma Trial. Arch. Ophthalmol. 2002;120, 1268–1279.
6. Lee, S. et al. Channel-mediated tonic GABA release from glia. Science. 2010;330, 790–796.
供稿 | 王彤彤
审稿 | 丛野
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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