Nature | 细致入微——高分辨率下观察肌动蛋白丝组装与老化

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细胞骨架是由蛋白纤维交织而成的立体网架结构，主要由微管、微丝和中间纤维组成，以保持细胞特有的形状并与细胞运动有关。其中，微丝 (microfilament, MF) 是普遍存在于真核细胞中由肌动蛋白 (actin) 多聚体组成的螺旋状纤维。当肌动蛋白单体 (G-actin) 结合ATP时，单体趋向于聚合成多聚体 (F-actin)，就是组装；当ATP水解成ADP后，多聚体趋向解聚，即去组装。

许多由肌动蛋白驱动的过程，例如细胞分裂，都依赖于其ATPase活性¹。在单体形式中，肌动蛋白表现出非常弱的ATP酶活性，但当聚合成微丝触发构象重组时，肌动蛋白则能在数秒内水解ATP。水解后产生的无机磷酸盐 (P_i) 不会立即释放，F-actin产生中间ADP-P_i状态²。P_i退出后，ADP结合的F-actin称为“老化 (aged) ”状态，然后可以解聚回G-actin。在体内，这一循环过程受到各种肌动蛋白结合蛋白 (ABPs) 的严格调控。

除了ABPs，与肌动蛋白结合的核苷酸相关的二价阳离子，Mg²⁺或Ca²⁺，也很大程度地影响了聚合速率。目前认为在活体中Mg²⁺是与肌动蛋白结合的主要阳离子³。此外，由于Ca²⁺- ATP结合G-actin表现出较慢的聚合动力学和较高的聚合临界浓度，它已被用作肌动蛋白纯化的标准物，至于是什么原因导致Ca²⁺-actin的聚合速度慢仍然是未知的。

自2015年以来，多种结合状态的F-actin结构被解析。然而，先前发表的F-actin结构分辨率不足，无法显示足够的细节来模拟溶剂分子和氨基酸侧链的精确位置。因此，F-actin老化的关键机制事件，如强烈依赖水分子的ATP水解，仍然未知。

2022年10月26日，德国马克斯普朗克分子生理学研究所Stefan Raunser实验室与Sabrina Pospich实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Structural basis of actin filament assembly and aging的论文。文章解析了兔骨骼α-actin丝在三种功能状态，分别在Mg²⁺或Ca²⁺存在下聚合的六个cryo-EM结构，分辨率约为2.2 Å。该结构以前所未有的细节展示了F-actin的结构，阐明了控制肌动蛋白丝组装和老化的溶剂驱动重排机制，为合理设计用于成像或治疗的小分子药物奠定了基础。

图 1 F-actin在2.2 Å分辨率下的冷冻电镜结构

首先，研究者基于冷冻电镜技术，解析了在Mg²⁺存在下，F-actin与三种核苷酸（ATP，ADP-P_i和ADP）结合的结构，分辨率为2.17-2.24 Å（图1a-d）。研究者使用ADP与氟化铍（BeF3⁻，也称为BeFx）络合来模拟F-actin的ATP结合状态（图1a, b）。此外，为了阐明Ca²⁺-actin较慢聚合动力学的机理，研究者进一步在2.15-2.21 Å的分辨率下解析了Ca²⁺-F-actin分别与ADP- BeF₃⁻、ADP- P_i和ADP结合的结构（图1e-g）。重构表明，尽管Ca²⁺-actin表现出缓慢聚合和快速解聚的动力学，但Ca²⁺-F-actin的结构与Mg²⁺-F-actin的结构相似，表明从Mg²⁺到Ca²⁺的变化不会导致微丝发生较大的构象重排。

图 2 G-向F -actin转化过程中的水迁移

聚合后，肌动蛋白单体的子结构域1和子结构域2 （SD1和SD2）旋转约12.4°，导致微丝中更紧凑的排列（图2a）。将ATP状态下G-actin的晶体结构⁴与F-actin结构进行比较，发现在Mg²⁺-ADP-BeF₃⁻F-actin中，存在类似于ATP-G-actin中的Mg²⁺配位（图2b, c），为Mg²⁺在G-向F-actin转变过程中保持水配位提供了实验证据。研究者进一步检查了核苷酸结合位点附近的水分子进行了重新定位。肌动蛋白聚合导致SD3/1腔变窄，一些水分子可能会与氨基酸发生冲突，因此需要通过一条涉及绑定在两个腔之间的水分子 (W_x) 移动的路径重新定位到SD1腔中。值得注意的是，水分子重新定位到SD1腔中不会影响核苷酸结合的Mg²⁺离子的配位（图2c, f）。

图 3 ATP水解和P_i释放的结构基础

此外，从G-到F-actin的构象变化后，SD3/1空腔中只剩下3个没有Mg²⁺配位的水分子。其中一个与Q137的侧链氢键相连（图3a）。由于核苷酸前面没有其他有序的水分子排列，与Q137氢键连接的水分子很可能代表F-actin中水解ATP的亲核试剂 (W_nuc)。并且对比后发现，W_nuc的位置不是固定的，研究者猜测W_nuc可能在水解能力强和水解能力较差的构象之间交换。W_nuc与邻近水分子 (W_bridge) 距离约4.2 Å，当W_nuc移动到水解能力强的位置会使W_nuc与W_bridge形成氢键距离。综上，研究者认为Q137是W_nuc的协调分子，而由W_bridge、D154和H161组成的氢键网络负责W_nuc的激活和质子转移。

研究者接下来检查了Ca²⁺-actin结构中的G-到F-actin的转变。G-actin中的Ca²⁺由ATP的P_β和P_γ和5个水分子配位（图2d）。相比之下，在Ca²⁺-ADP-BeF3−F-actin中，Ca²⁺失去了一个配位水（图2e）。那么，G-到F-actin的转变如何导致Ca²⁺配位改变的呢？研究者发现，在Ca²⁺-G-actin中，一个重新定位的水分子 (W_x) 驻留在Ca²⁺的配位球内，表明Ca²⁺的水化壳需要改变，以发生G-到F-actin的转变（图2d, e, g）。Ca²⁺配位球的重排可能会对G-到F-actin的转变形成动力学障碍，这为Ca²⁺-actin的聚合动力学比Mg²⁺-actin慢提供了结构基础。研究者进一步评估了Ca²⁺-actin的ATP水解机制，其ATP水解速率比Mg²⁺-actin慢5倍。Ca²⁺-ATP-G-actin和Ca²⁺-ADP-BeF₃−F-actin之间的结构比较表明，W_nuc的位置相似，但不利于亲核攻击，可能解释了Ca²⁺-F-actin水解速度较慢。

研究者还分析了ATP水解如何影响F-actin核苷酸排列。在Mg²⁺-ADP-Pi状态下，分裂的Pi部分与ADP分离了至少2.9 Å（图1c, 3b），说明ADP和P_i不形成共价键。Pi释放后，Pi结合位点被水分子所占据。有趣的是，在Pi释放之后，Ca²⁺-ADP-F-actin结构表明Ca²⁺改变了位置，因此它直接与ADP的P_α和P_β配位（图1g）和四个水分子以八面体排列，这一现象表明Ca²⁺-F-actin更快的解聚速率可能是由于长距离微丝的机械稳定性或微丝末端构象的差异造成的。

图 4 核苷酸结合位点与微丝表面的结构耦合

最后，研究者分析了核苷酸结合口袋中的构象变化是如何传递到微丝表面的。令人惊讶的是，研究者无法识别D-loop（残基39-51）和核苷酸结合位点之间的直接通信路径。因此，这些结构并不能解释为什么Mg²⁺-actin的ATP状态下，链内界面可以采用两种构象。然而，研究者能够识别出C端核苷酸依赖构象的结构基础。ATP水解后，核苷酸结合袋中的Q137在ADP-P_i状态下向上移动约0.4 Å，从而位于Pi的3.1 Å内（图3b，图4）。数据表明，Q137及其周围残基代表了一个能够感知核苷酸状态并将其传递到外周的主要区域。

总的来说，本文以超高分辨率解析了不同核苷酸结合状态下F-actin的结构，这些结构在所有解出的核苷酸状态中都非常相似，表明ADP-F-actin不应被视为不稳定的，而是一种“始发态”(‘primed state’)，它在丝端表现出更快的解聚速度，并由于缺少γ-磷酸盐部分而导致的cofilin结合和分离非常敏感。研究者还进一步展示了ATP在F-actin中的水解机制和Ca²⁺-actin的缓慢聚合速率如何取决于水分子的位置。增强了对细胞骨架重构的理解，并为开发肌动蛋白结合小分子提供了细致的结构基础。

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41586

-022-05241-8

参考文献

参考文献

[1] Pollard, T. D. & Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science 326, 1208–1212 (2009).

[2] Carlier, M. F. & Pantaloni, D. Direct evidence for ADP-P¡-F-actin as the major intermediate in ATP-actin polymerization. Rate of dissociation of P¡ from actin filaments. Biochemistry 25, 7789–7792 (1986).

[3] Kitazawa, T., Shuman, H. & Somlyo, A. P. Calcium and magnesium binding to thin and thick filaments in skinned muscle fibres: electron probe analysis. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 437–454 (1982).

供稿 | 肖媛

审稿 | 谭佳鑫

责编 | 囡囡

排版 | 可洲

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