21世纪以来，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是继SARS、MERS之后，第三次引起大规模疫情的冠状病毒。截至今年5月，新冠病毒在全球范围内已感染超过5亿人，死亡病例超过626万[1]。
尽管大多数人群已接种新冠疫苗，但面对不断变异的病毒，人们有必要开发高效、便捷的抗病毒药物，从而进一步降低老年患者和有基础病患者的死亡率。
5月10日，我国科学家发现的新冠治疗新药获得国家发明专利授权[2]。专利说明书显示，低浓度的千金藤素（10μmol/L）能够显著抑制冠状病毒的感染能力。与未用药的对照组相比，病毒含量下降了15393倍。
本文将按照时间顺序，从临床用途、药物筛选、生物活性、药理机制等方面，为大家讲述千金藤素用于新冠治疗的研究历程。
千金藤素：历史悠久的天然药物
千金藤素（cepharanthine, CEP）是一种双酚类生物碱，属于双苯异喹啉环状物家族[3]。早在1934年，日本药学家藤平三郎就从防己科植物——千金藤中提取到了千金藤素（图1）。它的化学结构中含有特殊的1-苄基异喹啉，与天然多肽具有相似的结构，因此千金藤素引起了科学家的广泛关注。
图1：千金藤与千金藤素（图片来源于网络）
经过数十年的发展，千金藤素在1951年通过了日本药监部门的批准，陆续被用于治疗肿瘤放疗引起的白细胞减少症、斑秃，以及特发性血小板减少性紫癜、渗出性中耳炎、毒蛇咬伤等疾病。目前，千金藤素已经具备成熟的提取工艺，可被制作为口服片剂、粉剂、注射剂等。在使用剂量方面，每天2-60 mg的千金藤素已被安全有效地用于治疗中耳炎，其半衰期为31.3-36.9小时。这说明千金藤素具有良好的安全性和生物相容性。
多项体外和体内研究表明，千金藤素具有广泛的药理作用（图2）。一方面为抗炎作用，在乳腺炎、急性肺损伤等小鼠模型中，千金藤素能够显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的水平，抑制NF-kB、VEGF等信号通路的活性。另一方面为抗病毒作用，早在新冠发生之前，科学家就已经发现千金藤素能够抑制多种病毒的感染能力，如HIV1、乙肝病毒（HBV）、人类嗜T细胞病毒（HTLV）、非典（SARS-CoV）等。
图2：在体外细胞模型中，千金藤素对多种病毒具有抑制活性[3]
药物筛选：让老药也有新用途
COVID-19爆发之后，人们迫切需要安全、有效的抗病毒药物。为了缩短药物研发周期，科学家们根据 “老药新用”的思路，从已经通过临床审批的“老药”中，挖掘具有抗新冠活性的“新药”。
2020年5月5日，北京化工大学的童贻刚团队率先在Chinese Medical Journal上发表了一项研究成果[4]。研究者用穿山甲冠状病毒（GX-P2V）感染的细胞作为筛选药物的模型，从2406个已获批的临床药物中，发现千金藤素具有最高的抗病毒活性（图3）。显微镜观察结果显示，千金藤素能有效减少GX-P2V导致的细胞病变效应（cytopathic effect, CEP）。
图3：用穿山甲冠状病毒GX-P2V感染细胞，筛选具有潜在抗新冠能力的临床药物[4]
之所以用GX-P2V筛选药物，一方面是因为它与SARS-CoV-2均为冠状病毒，二者S蛋白的同源性为92.2%，且宿主受体均为ACE2；另一方面，GX-P2V具有更低的致病性，能在生物安全二级实验室中进行操作，而SARS-CoV-2需要更高级别的实验室。
在用GX-P2V感染Vero E6细胞后，研究者分别在三种时间段加入千金藤素，并用qRT-PCR检测病毒RNA的含量。在全时间段（共48h）、前2小时加药（随后除去药物）、2小时后加药三种实验中，GX-P2V在细胞中的病毒载量均显著下降，这说明千金藤素同时具有抑制病毒入侵和入侵后过程的能力（图4A）。进一步的实验表明，千金藤素的半数有效浓度（EC50）为0.98μmol/L，半数细胞毒浓度（CC50）为39.30μmol/L（图4B）。这说明千金藤素在抑制病毒的同时不会产生细胞毒性，具有良好的生物活性和安全性。
图4：千金藤素抗病毒的药理机制与药效评价[4]
童贻刚团队的这项工作首次证明了千金藤素潜在的抗新冠活性，相关成果已申报专利，题为“穿山甲冠状病毒xCoV及其应用和药物抗冠状病毒感染的应用”。但以上研究数据容易受到筛选模型（GX-P2V）、实验方法的影响，因此，千金藤素的抗新冠活性需要更多的数据支持。
国外多个团队证实千金藤素具有显著的抗新冠活性
2021年5月，日本国立传染病研究所的Takaji Wakita团队在iScience上发表了一项类似的研究工作[5]。研究人员同样采用“老药新用”的策略，从306个已获批的临床药物中，发现千金藤素等药物具有显著的抗新冠能力。
在这项研究中，作者用临床分离的SARS-CoV-2病毒作为筛选模型，随后用氯喹（CLQ, 疟疾药物）、瑞德西韦（RDV, 新冠RNA聚合酶抑制剂）、千金藤素（CEP）、奈非那韦（NFV, HIV蛋白酶抑制剂）四种药物进行处理。结果显示，CEP具有最高的抑制活性，其半数抑制浓度IC50仅为0.35μmol/L（图5）。此外，作者在三种时段加入四种药物，发现CEP能够显著抑制病毒的入侵，并且抑制病毒的入侵后过程。而RDV和NFV仅能抑制病毒的入侵后过程（图5）。以上数据证实千金藤素对新冠病毒具有抑制活性，而不仅仅是局限在穿山甲冠状病毒。
图5：千金藤素与其它药物的抗病毒活性，以及不同时段给药的机制探究[5]
很快，2021年8月，来自美国芝加哥大学的Savaş Tay团队在Science上继续发表了一项“老药新用“的文章[6]。研究人员采用β属冠状病毒OC43作为筛选模型，理由是它与SARS-CoV-2的种系相同，并且OC43对人类的致病性低，只造成轻微的感冒症状，其筛选过程不需要生物安全三级实验室。利用OC43模型，研究者从1900种临床药物中，发现了26种具有抗病毒活性的药物，其中千金藤素的EC50为0.77μmol/L（图6）。
图6：用β属冠状病毒OC43感染细胞，筛选具有潜在抗新冠能力的临床药物[6]
随后，作者用SARS-CoV-2感染人肺细胞系A549，验证上述药物的生物活性。特别值得注意的是，千金藤素在26种药物中具有最高的抑制活性，其EC50仅为0.1μmol/L（图7）。
图7：在体外细胞模型中，千金藤素与其它药物的抗新冠能力[6]
上述两项研究都采用“老药新用”的思路，从成千上百种药物中同时发现了千金藤素，并且在SARS-CoV-2体外感染细胞的模型中，证实了千金藤的抗新冠活性。但鉴于其复杂的药理作用，科学家们接下来需要搞清楚千金藤治疗COVID-19的具体机制。
组学研究揭开千金藤的治疗机制
北京化工大学的童贻刚团队在发现千金藤素能有效抑制穿山甲冠状病毒GX-P2V之后，通过转录组学测序（RNA-seq）的方法分析了千金藤素（CEP）可能的治疗机制。该研究成果于2021年1月发表在Briefings in Bioinformatics杂志上。
研究者分别检测了正常细胞、感染GX-P2V的细胞、感染后用CEP处理的细胞的转录组。结果发现，感染病毒后下降的基因有60.4%被CEP重新上调；而感染后上升的基因有67%被CEP下调。进一步分析这些基因的功能发现，CEP主要影响了内质网应激、未折叠蛋白反应和HSF1介导的热休克反应等生物学通路（图8）。
图8：千金藤素改变GX_P2V感染Vero E6细胞的转录谱[7]
而这些生物学通路，也在COVID-19重症患者中显著上调。研究者分析了两个已发表的新冠患者的单细胞转录组数据集，发现重症患者（ARDS, 绿色）的外周血单核细胞存在显著上调的细胞应激反应，如热休克反应、内质网应激等（图9）。而这些生物学通路，在GX_P2V感染的细胞中能够被CEP有效改善，这说明CEP可能通过调节细胞应激、抑制炎症的方式治疗新冠。
图9：SARS-CoV-2患者外周血单核细胞的转录分析[7]
2022年1月，清华大学的张强锋团队与中国医学科学院的王健伟团队在Cell Research上发表了一项重要工作。该研究首次发现CEP能够以宿主热休克蛋白作为靶点，在体外细胞模型中抑制多种RNA病毒，并且在新冠病毒感染的ACE2小鼠模型中具有抑制活性。
首先，研究者采用一种新型的ChIRP-MS技术，分析了新冠病毒、寨卡病毒（ZIKV）以及埃博拉病毒（EBOV）等RNA病毒的基因组与宿主蛋白的互作网络。结果发现，热休克蛋白HSP90AB1能够与三种病毒的基因组发生相互作用，并且影响其它HSP和TNF-α基因（图10左）。随后，作者分别用表面等离子共振技术（SPR）和细胞热位移测定法（CETSA）证明了CEP能够在体外和细胞内与HSP90AB1相互结合（图10右）。
图10：HSP90AB1与多种RNA病毒的基因组相互作用，且能与千金藤素结合[8]
接着，研究者在多种人类细胞系中，发现千金藤素对多种RNA病毒具有抑制作用，包括SARS- CoV-2、SARS- CoV-2（南非B.1.351毒株）、ZIKV和EBOV（图11）。这说明千金藤素具有非特异性的抗病毒活性，而这与过去的研究结论一致（见第一部分）。
图11：千金藤素对多种RNA病毒具有抑制活性[8]
最后，研究者在感染新冠病毒的ACE2小鼠模型中，检测了千金藤素和环孢素（CsA, 一种免疫抑制剂）的生物活性。结果显示千金藤素在第5天显著降低病毒载量，并且TNF-α、IL-6等炎症因子的含量也有所下降。肺组织的HE染色表明千金藤素和CsA均能减少新冠感染后的炎症反应（图12）。这表明HEF在小鼠模型中也具有显著的生物活性，能够抑制新冠病毒载量和炎症反应。
图12：在体外细胞模型中，千金藤素对多种病毒具有抑制活性[8]
上述两项研究均采用组学的方式，研究了千金藤素可能的治疗机制和靶点。与传统的单一靶点的直接抗病毒药物（direct-acting antiviral agents, DAA）不同，千金藤素能影响病毒感染的多个过程，并且具有抗炎和抗多种RNA病毒的活性。这说明千金藤素的靶点可能不只是病毒蛋白，而是包括了宿主蛋白，如HSP90AB1。
总结
本文从科学研究的角度出发，讲述了千金藤素作为新冠药物的探索过程。要点如下：
  • 千金藤素自1951年就进入临床使用，具有良好的安全性
  • 基于“老药新用“的思路，童贻刚团队在国际上首次证明千金藤素具有潜在的抗新冠活性
  • 其它国外团队证实了千金藤素对新冠病毒的抑制能力，且活性优于其它药物
  • 千金藤素具有抗炎和抗病毒作用，可能作用于多个靶点，包括病毒和宿主的蛋白
著名历史学家伊恩·莫里斯在《战争》一书中写道：战争推动了人类历史的进步。诚如此言，每一次人类与病毒的“战争”，都推进了人类整个生物医学事业的发展。
2020年的诺贝尔医学奖，被授予了丙型肝炎的研究。科学家从1989年发现丙肝病原体，到治疗药物的不断研发，最终实现丙肝95%的治愈率，仅仅用了30年的时间，这无疑是人类医学史上的一次奇迹。
病毒在进化，但人类也在进化。
随着更多药物的研发，小编相信未来有一天，人类能够完全攻克新冠病毒，就像天花和丙肝一样。
参考文献
[1] https://covid19.who.int/
[2]张佳星. 我科学家发现新冠治疗新药并获发明专利授权[N]. 科技日报,2022-05-13(001).
[3] Rogosnitzky M, Okediji P, Koman I. Cepharanthine: a review of the antiviral potential of a Japanese-approved alopecia drug in COVID-19. Pharmacol Rep. 2020;72(6):1509-1516. doi:10.1007/s43440-020-00132-z
[4] Fan HH, Wang LQ, Liu WL, et al. Repurposing of clinically approved drugs for treatment of coronavirus disease 2019 in a 2019-novel coronavirus-related coronavirus model. Chin Med J (Engl). 2020;133(9):1051-1056. doi:10.1097/CM9.0000000000000797
[5] Ohashi H, Watashi K, Saso W, et al. Potential anti-COVID-19 agents, cepharanthine and nelfinavir, and their usage for combination treatment. iScience. 2021;24(4):102367. doi:10.1016/j.isci.2021.102367
[6] Drayman N, DeMarco JK, Jones KA, et al. Masitinib is a broad coronavirus 3CL inhibitor that blocks replication of SARS-CoV-2. Science. 2021;373(6557):931-936. doi:10.1126/science.abg5827
[7] Li S, Liu W, Chen Y, et al. Transcriptome analysis of cepharanthine against a SARS-CoV-2-related coronavirus. Brief Bioinform. 2021;22(2):1378-1386. doi:10.1093/bib/bbaa387
[8] Zhang S, Huang W, Ren L, et al. Comparison of viral RNA-host protein interactomes across pathogenic RNA viruses informs rapid antiviral drug discovery for SARS-CoV-2. Cell Res. 2022;32(1):9-23. doi:10.1038/s41422-021-00581-y
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