全网首发！单细胞路在何方？北大张泽民课题组万字综述给你指明方向！

万字长文细说单细胞文章思路

大家好，我是风。欢迎来到风风的从零开始单细胞测序。深度学习应该是目前人工智能最火的领域，李沐老师认为，应当把深度学习当成一门编程语言进行学习，因为本质上深度学习是一种框架，所以并不是三言两语说几句或者推荐几本书就能够帮助大家入门。如果大家真的有兴趣的话，可以在B站或者慕课看看是否能检索李沐老师的课，都是免费课程，课程需要一点点python和数学基础，真的就是一点点，不用怕。如果只是想学习一些数据挖掘相关简单模型的实现和应用的话，可以等我们更完单细胞系列后，再找时间推出数据挖掘模型系列。

好了，闲话少叙，前面我们已经一起学习了很多单细胞测序数据的分析方法，从最开始的公共数据下载到常规分析，已经上周已经浅尝辄止地学习了一下拟时序分析，今天本来应该是接着继续拟时序分析的另外几种方法，然而我偶然看到一篇关于单细胞分析的综述文献，就趁热打铁，先给大家分享一下吧。

文章简介

这是一篇由北京生命科学中心张泽民教授课题组发表在Annual Review of Immunology上的综述，最新影响因子为19.9。上过我训练营的学员应该知道，我一直认为杂志的影响因子只能作为杂志的评判标准之一，尽管Annual Review of Immunology上的IF并没有三大期刊Nature、Cell、Science那么高，甚至不如Immunity等免疫top期刊。

然而，Annual Reviews系列自1932年建刊，发布了50余种涵盖生物医学、生命科学、物理和社会科学领域的期刊，更被iNature评价为全球最好的综述期刊。而Annual Review of Immunology又是Annual Reviews系列影响力最高的期刊之一。

本篇文章综述了从scRNA-seq研究中获得的有关肿瘤免疫微环境的研究进展，重点介绍了肿瘤环境中免疫细胞的表型可塑性和谱系动力学的研究。此外，还讨论了scRNA-seq研究中出现的一些亟待解决的问题及其潜在的解决方案。

前言

癌症是一种复杂的基因改变疾病，由于失去了生长控制机制和与人体（包括免疫系统）的不适应性交叉调控而威胁到人类健康。虽然免疫系统可以通过其多维的先天性和适应性免疫效应机制成功地保护宿主免受大多数病原体的感染，但由于肿瘤新抗原的免疫编辑、免疫抑制性骨髓细胞的招募以及控制T细胞反应的T细胞检查点途径劫持，它在根除癌症方面的作用会受到很大的影响。在过去的25年里，研究人员一直专注于T细胞及其免疫检查点，从而成功地进行了癌症免疫治疗，为以前无法治愈的疾病提供了持久的临床反应。目前的癌症免疫疗法，包括癌症疫苗、过继免疫细胞转移，尤其是免疫检查点阻断，对多种癌症都有临床效果，如黑色素瘤、淋巴瘤、头颈部癌症、透明细胞肾癌、微卫星不稳定（MSI）肿瘤、胃癌、膀胱癌和非小细胞肺癌等。然而，只有一部分患者可以获得一定的临床效益。因此，了解肿瘤免疫逃逸的确切细胞和分子机制仍然是进一步改进目前的免疫疗法或开发新的治疗途径的关键任务。

CD8+T细胞作为肿瘤免疫的关键细胞，在识别新抗原时可以直接识别和杀伤癌细胞，也可以对各种信号做出反应来调节其发育谱系和状态。CD4+T细胞，包括高度抑制FOXP3+调节性的CD4 T细胞，也可以协调不同的免疫反应，以增强或抑制对癌细胞的免疫。树突状细胞(DCs)通过提呈肿瘤抗原，分泌促炎和抗炎细胞因子和趋化因子，启动和调节针对肿瘤的先天性免疫和获得性免疫反应。巨噬细胞通过刺激血管生成、促进非增生性炎症和抑制抗肿瘤免疫，加速肿瘤的发生、发展，甚至转移。

免疫细胞的发育多样性和表型可塑性使它们能够对各种免疫原做出动态和特异性反应，其中一些特性可以用流式细胞术和RNA-seq等传统的方法来探索。尽管流式细胞术和RNA-seq等研究取得了一定的进展，但技术限制阻碍了对肿瘤浸润性免疫细胞表型和功能的全景表征，从而阻碍了我们对大多数患者体内癌细胞的低效清除的理解。单细胞RNA-seq(scRNA-seq)技术的迅速发展为剖析肿瘤浸润性免疫细胞的异质性及其与肿瘤中各种正常和异常细胞类型的相互作用提供了强有力的工具。通过scRNA-seq，许多癌症的肿瘤浸润性免疫细胞的数量和质量都得到了前所未有的解决，包括黑色素瘤、淋巴瘤、胶质瘤、胆管癌、鼻咽癌、乳腺癌、头颈部肿瘤、结直肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌。这些研究要么是专门针对肿瘤浸润T淋巴细胞设计的，要么是广泛应用于整个肿瘤免疫微环境，为肿瘤微环境中免疫细胞的组成、异质性、动力性和调节性带来新的知识和深刻的见解。这些研究还提出了要寻找新的基因靶点，以及有希望的生物标志物，以便对患者进行临床分类。

scRNA-seq方法还可以通过多种方法，跟踪细胞谱系以及细胞命运和分化的动态。scRNA-seq允许对单个T细胞的全长和配对TCRα和β序列进行测序和重建，从而可以进行谱系鉴定和跟踪，也可以从B细胞获得相应的抗体-BCR序列。对线粒体突变的追踪是另一种方法，可以在更广泛的细胞类型集合中识别和跟踪单个细胞系。最后，对单个细胞中核质RNA群体的研究，即RNA velocity分析，可以深入了解细胞命运的动态变化。细胞谱系和细胞命运分析方法提供了独到的生物学见解，值得进行系统的回顾和讨论。

在本篇综述中，作者集中于肿瘤浸润的T细胞、DC细胞和巨噬细胞，讨论了它们的基因表达异质性、肿瘤类型之间的组成差异、细胞动力学和细胞起源的TCR测序、线粒体突变追踪和RNA velocity分析，以及它们在肿瘤免疫和免疫治疗应答以及免疫治疗抵抗中的潜在作用。作者还简要讨论了当前肿瘤浸润性免疫细胞的scRNA-seq研究中出现的问题以及该领域未来可能的发展方向。

scRNA-seq技术在肿瘤免疫研究中的现状

随着单细胞测序技术的快速发展，研究者可以以前所未有的分辨率和成本获得多层次的信息，包括单个细胞及其组合的表观基因组、基因组、转录组和蛋白质组特征，这种多层次信息非常适合研究免疫细胞的特性。免疫细胞以其多样化的发育谱系、抗原特异性、表型可塑性和对各种微环境的适应性而闻名。本文集中总结了从scRNA-seq的广泛应用中获得的研究现状，以了解肿瘤浸润性免疫细胞在人类癌症中的作用。

目前的肿瘤浸润性免疫细胞研究经常使用两种类型的scRNA-seq技术：一种基于孔板plate (将单个细胞分选到孔板中准备RNA文库)，另一种基于液滴droplet (单个细胞被包裹在油乳剂内的水滴中)。一些平台对完整的RNA转录本进行测序，而另一些方法只对较短的、有代表性的转录本区域进行测序。目前，从单细胞中产生一个完整的、无偏倚的RNA转录文库仍然是一个难以实现的目标。

基于孔板的scRNA-seq技术包括SMART-seq2，其具有与批量RNA-seq平行的低dropout率（dropout，可以理解为稀疏矩阵中为0的部分），可以对更广泛的基因表达进行全面表征。SMART-seq2的全长mRNA覆盖还允许在转录异构体水平上定量表达和组装具有高丰度的全长mRNA序列，例如TCR。然而，与基于droplet的技术相比，基于孔板的scRNA-seq成本高，细胞捕获量低，尽管后者已经通过最近提出的组合策略得到了改进。以10x Genomics提供的解决方案为代表的基于droplet的scRNA-seq可以在一次实验中获得数千个细胞的scRNA-seq数据，而基于孔板的技术通常被限制在几十到数百个细胞。10x Genomics的较高的细胞捕获量使得能够对组织中的细胞类型进行更全面的采样，特别是对于稀有细胞类型。然而，基于droplet的scRNA-seq有其自身的技术缺陷，即使是中等表达的基因也容易丢失。基于液滴的scRNA-seq方法通常只对mRNAs的3‘或5’端进行测序，导致了同构体定量和全长mRNA组装的问题。尽管这两种技术各有优缺点，但它们都已成功地应用于肿瘤微环境的表征，并且结合互补的优势为肿瘤微环境提供了更全面的见解。

最近的肿瘤浸润性免疫细胞研究的另一个明显特点是在每项研究中收集样本和选择相关对照组织的不同策略。在不同的研究中，无论是肿瘤微环境中的所有细胞、CD45+免疫细胞，还是CD45+CD3+T细胞都被富集起来，然后进行scRNA-seq。这种不同的免疫细胞富集方法带来了研究特有的偏差，由于每个患者的细胞捕获率和最终细胞分辨率不同，这些偏差可能会干扰后续的综合分析（也就是影响我们做的生信整合分析，换句话说，单细胞分析在选择数据集的时候，一定要注意源数据集的分组问题）。由于免疫细胞的迁移性，与肿瘤相匹配的免疫相关组织，包括癌旁正常组织、淋巴结和外周血，在阐明肿瘤浸润免疫细胞的生物学方面发挥着重要作用。不同研究中肿瘤匹配组织细胞集合的这种差异将导致对scRNA-seq观察结果的不同解释。研究之间差异的第三个维度在于研究设计的纵向性质，许多研究只有一个受试者时间点，而一些研究则包括纵向变化(特别是治疗前后)。尽管存在如此众多的差异，但在肿瘤浸润性免疫细胞的不同癌症类型中已经有了许多一致的生物学观察，从而为肿瘤免疫逃逸的潜在机制提供了重要的线索。

以功能障碍性T细胞核效应性T细胞混合的CD8+T细胞为特征的肿瘤浸润性T细胞

最近的肿瘤浸润性T细胞研究涵盖多种癌症，包括黑色素瘤；胶质瘤；乳腺癌、头颈部、结直肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌和肺癌。在这些研究中，确定了各种各样的T细胞亚群。

可以观察到CD8+T细胞处于不同的功能障碍状态，执行细胞毒性功能的能力降低，这一现象被称为T细胞耗竭(T cell exhaustion)。肿瘤微环境中功能失调或耗竭的T细胞的特征是抑制受体的表达增加，包括PD-1、CTLA-4、TIM3、TIGIT和LAG3。这些细胞可以表达细胞毒相关基因的子集，包括那些编码干扰素、颗粒酶和穿孔素的基因(IFNG、GZMB和PRF1)，这表明它们处于激活的效应状态。但是IL-2、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和T-box转录因子(TBX21)的表达缺失或处于较低水平。值得注意的是，在耗竭的CD8+T细胞中，有一小部分在多种癌症类型中显示出高水平的MKi67表达，MKi67是活跃增殖的标志，包括黑色素瘤和肝癌，肺癌，乳腺癌，结直肠癌和膀胱癌。增殖期CD8+T细胞的耗竭信号略低于非增殖期的CD8+T细胞，提示耗竭过程可能滞后于T细胞的增殖。肝癌、肺癌和结直肠癌的TCR追踪显示，许多增殖耗竭的CD8+T细胞与耗竭表型的细胞具有相同的TCR序列(成对的α和β链)，这表明它们具有相同的起源但不同的状态。这些肿瘤浸润的CD8+T细胞的耗竭状态的诱导可能归因于肿瘤微环境中它们各自抗原的长期暴露，或由于抑制性配体、可溶性介质、代谢环境或抑制性免疫细胞和基质细胞所致的肿瘤内免疫抑制性质的贡献，这些CD8+T细胞的耗竭状态可能归因于肿瘤微环境中它们各自的抗原的长期暴露，或者由于抑制性配体、可溶性介质、代谢环境或抑制性免疫细胞和基质细胞的作用。

scRNA-seq揭示的另一个常见的CD8+T细胞亚群在多种癌症适应症中的特征是高表达的GZMK而不是GZMB。这些GZMK+T细胞很少表达或不表达与T细胞耗竭相关的标记，已在肝脏癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、头颈部肿瘤和黑色素瘤中被发现。这种GZMK+T细胞亚群在不同类型的肿瘤中的广泛存在表明了其在肿瘤免疫中的作用。事实上，肿瘤中这种GZMK+CD8+T细胞亚群与耗竭的T细胞的比率与非小细胞肺腺癌患者较好的存活率和对黑色素瘤患者对免疫检查点抑制的较好反应呈正相关。对肝癌、肺癌和结直肠癌的TCR分析显示，GZMK+和耗竭的T细胞之间存在紧密的联系，这表明这些T细胞可能针对相同的抗原，但由于个别细胞生态位的不同而经历不同的状态转换。由于该GZMK+T细胞亚群也是CD45RO+，且高表达IFNG和PRF1，因此被认为是一组CD8+效应记忆T细胞。值得注意的是，效应性记忆T细胞和耗竭的T细胞之间的区别似乎不是二元的，而是一个连续体。

耗竭的T细胞和效应性记忆T细胞的相对比例在患者和不同的癌细胞类型中有所不同，非小细胞肺癌显示耗竭的T细胞的频率相对较低，而效应性记忆T细胞的比例相对较高。然而，肝细胞癌中耗竭的T细胞比例要高得多。肿瘤微环境中效应性记忆T细胞与耗竭的T细胞比率的相对组成可能是患者生存的一个潜在的预后标志，也是免疫治疗反应的一个预测标志，它值得在所有癌症类型中进行深入研究。

TCR介导的肿瘤浸润杀伤CD8+细胞的动态变化

TCR的多样性为鉴定T细胞克隆和追踪克隆种群的动态提供了一种天然的分子标记(101)。scRNA-seq技术，如SMART-seq2和10x Genomics 5’ +VDJ方法，允许基因表达和TCR的鉴定，它们在肿瘤浸润性T细胞中的应用使研究者对CD8+T细胞的动力学有了深刻的认识。

一种名为STARTRAC的生物信息学方法可以定量评估四种类型的T细胞动力学数据，包括克隆扩增的程度、转录状态的倾向、在特定组织中的富集以及向其他组织迁移的倾向。在各种人类癌症中，效应性和耗竭肿瘤浸润的CD8+T细胞均可观察到克隆性增殖，后者通常有较高的扩增水平。这种区别可能源于它们的克隆组成不同，因为不同T细胞克隆的克隆性在肿瘤中是不均匀的，可能遵循幂律分布。这也可能表明表型差异，即效应性记忆T细胞与耗竭性T细胞可能依赖于TCR。尽管GZMK+效应记忆T细胞的表型和克隆性扩增水平不同，但在多种肿瘤中经常观察到来自GZMK+效应记忆T细胞和耗竭的CD8+T细胞的T细胞克隆，提示GZMK+效应记忆T细胞可能分化或将其表型转换为耗竭状态。在肿瘤中的这种观察与在病毒感染和肿瘤治疗环境中发现的一组干细胞样T细胞一致，这些干细胞的特征是CXCR5和TCF1/Tcf7的高表达，被认为是耗竭性CD8+T细胞的祖细胞和GZMK+效应记忆T细胞的一部分。

GZMK+效应记忆CD8+T细胞和耗尽的T细胞之间的一个显著区别是它们在组织中的偏好性和跨组织移动性方面的差异。在拥有多个自体对照组织的肝癌、肺癌和结直肠癌研究中，GZMK+效应记忆CD8+T细胞在肿瘤和癌旁的正常组织中都富集，而耗竭性CD8+T细胞仅在肿瘤中富集。在GZMK+CD8+T细胞中经常发现跨越癌旁组织和外周血或肿瘤的T细胞克隆，但很少发现同时跨越这三种组织的克隆。尽管自体对照组织的数量有所不同，但是这些趋势在其他类型的癌症中也可以观察到。由于系统免疫是小鼠和人类有效免疫治疗所必需的免疫过程，外周血和肿瘤中T细胞克隆之间罕见的TCR共享，而GZMK+CD8+T细胞在所有受试部位之间频繁共享TCR，可能表明这是肿瘤免疫逃逸的机制。在有腹水资料的肝癌患者中，GZMK+效应记忆CD8+T细胞更多地出现在腹水中，而不是那些耗竭性T细胞出现在腹水中。

由特定组织的局部免疫作用所决定的肿瘤微环境的形成

越来越明显的是，不同解剖来源的肿瘤表现出不同的T细胞特性。在对肝细胞癌、非小细胞肺癌或结直肠癌患者T细胞的scRNA-seq研究中，三种癌症类型的外周血液中都观察到相似的T细胞成分。相反，对具有不同组织来源的不同肿瘤进行比较时，则出现了不同的T细胞亚群。黏膜相关恒定T细胞（MAIT，一种特殊的T细胞亚型，在正常人体血液中MAIT细胞仅占所有T细胞的1-5%，但是在肝脏、黏膜中则大量存在，最多可以达到T细胞总数的一半）在肝细胞癌中显著富集，高表达穿孔素和多种颗粒酶。然而，在非小细胞肺癌的肿瘤中，MAIT细胞很少发现，但出现了以转录因子ZNF683为特征的CD8+T细胞亚群。CD8+ZNF683+T细胞高表达PRF1、GZMB和PDCD1，而IFNG和其他耗竭标志物(包括CTLA4、HAVCR2、TIGIT和LAG3)的表达水平则相对较低，与耗竭的CD8+T细胞相比，CD8+ZNF683+T细胞高表达PRF1、GZMB和PDCD1，而IFNG和其他耗竭标志物的表达水平相对较低。值得注意的是，在这个CD8+ZNF683+T细胞亚群和那些耗尽的T细胞之间可以观察到紧密的TCR联系，这表明肿瘤可能劫持并重新编程这个肺部的CD8+T细胞亚群以逃避免疫攻击。在结直肠癌中，CD6+CD8+T细胞亚群是独一无二的，其特征是高表达IFNG、GZMB和PRF1；低表达PDCD1、CTLA4和HAVCR2；相对高水平的TIGIT和LAG3；以及与耗竭的T细胞TCR。在乳腺癌中，γδT细胞在肿瘤微环境中含量丰富。其中一些肿瘤组织特异性T细胞亚型与患者预后有关。例如，CD8+ZNF683+T细胞亚群的丰度与非小细胞肺癌患者更好的生存相关，这些组织区域T细胞亚群的贡献可能与免疫治疗的疗效相关。

scRNA-seq揭示肿瘤浸润的CD8+T细胞的来源

T细胞起源于胸腺，成熟于淋巴结，通过血管和淋巴管迁移，在靶组织中发挥功能，其生命周期很难用传统方法来评估。应用scRNA-seq同时绘制单个T细胞的细胞特性和TCR图，以及各种自身免疫相关对照，首次为估计患者肿瘤浸润性T细胞的来源提供了机会。

耗竭性CD8+T细胞和GZMK+效应记忆CD8+T细胞在多种肿瘤类型中高度克隆性增殖，这表明，局部扩张是肿瘤浸润性CD8+T细胞的主要来源。一小部分增殖的T细胞和耗竭性T细胞与GZMK+T细胞有紧密的TCR联系，这表明正在进行局部扩增，但仍然不清楚CD8+T细胞在肿瘤中的局部扩增是如何调节的。癌旁组织中GZMK+效应记忆CD8+T细胞与耗竭性CD8+T细胞共享的TCR提示，肿瘤浸润的CD8+T细胞也可能起源于GZMK+效应记忆T细胞的迁移，随后表型转变为耗竭状态。由于GZMK+效应记忆T细胞在肿瘤及其邻近组织中的富集可见于多种癌症类型，包括黑色素瘤和肝癌、肺癌、结直肠癌、乳腺癌和胃癌等，这些细胞向肿瘤中的浸润可能是肿瘤中CD8+T细胞的外部来源的普遍机制。

GZMK+效应记忆CD8+T细胞的一个亚群也与CD8+CX3CR1+T细胞共享TCR，在多种癌症类型中显示出效应或效应记忆表型。特别是在这些癌症类型中观察到了跨越这三个亚群的T细胞克隆，尽管频率很低。这些克隆可能提示肿瘤浸润性效应记忆T细胞或耗竭性T细胞的某些起源，低频率可能提示全身免疫应答对肿瘤新抗原的失控，从而导致肿瘤免疫逃逸。最近的研究表明，外周T细胞的增殖可以预测肾癌和肺癌患者的肿瘤浸润和抗PD-L1免疫治疗的临床反应，强调了这种外周来源的T细胞的重要性。跨越这三种状态的T细胞克隆频率如此之低，也可能解释了多种肿瘤类型中GZMK+T细胞与血源性CD8+CX3CR1+T细胞和耗竭T细胞共享TCR的互斥现象。

scRNA-seq的研究还表明，组织驻留的T细胞是肿瘤浸润性T细胞的重要来源。在肺中，以ZNF683、ITGAE和CD69高表达为特征的T细胞与耗竭的T细胞共享TCR的比例高于GZMK+效应记忆T细胞。最近对新冠肺炎患者进行的scRNA-seq研究证实，肺中存在ZNF683+T细胞，它们可能在消除SARS-CoV-2感染中发挥作用，证实了这种T细胞亚群驻留在肺中的性质及其在维持肺内稳态中的作用。ZNF683+T细胞与耗尽T细胞之间共有的TCR，以及ZNF683+T细胞高浸润的肺癌患者较好的生存优势，突显了组织驻留T细胞作为抗肿瘤药物的重要性。然而，组织驻留T细胞的抗肿瘤作用因组织和T细胞亚型的不同而不同。在肝脏中，MAIT细胞驻留在组织中，但它们往往在肝细胞癌的肿瘤微环境中被耗竭。在结直肠癌中，发现两组组织驻留T细胞，即CD160+CD8+T细胞(类似上皮内淋巴细胞)和CD6+CD8+T细胞。但CD160+CD8+T细胞在结直肠癌的肿瘤微环境中被耗竭，与被竭性T细胞共享的TCR很少。相反，CD6+CD8+T细胞在肿瘤组织和癌旁粘膜组织中均较丰富，与耗竭T细胞和GZMK+效应记忆CD8+T细胞均有较高的TCR共享率。在乳腺癌中，γδT细胞是驻留在组织中的，并且通过scRNA-seq研究经常在肿瘤中被发现。虽然GZMK+效应记忆T细胞与组织中残留的T细胞(如肺中的ZNF683+T细胞和结肠中的CD6+T细胞)之间也经常观察到共享的TCR，但组织驻留的T细胞和效应记忆T细胞之间的这种转换在清除肿瘤细胞方面的作用尚不清楚。

简而言之，对各种肿瘤的scRNA-seq研究为肿瘤浸润性T细胞的起源提供了重要的见解。CD8+T细胞具有跨越多种癌症类型的一致结果：(A)自我扩张是主要来源；(B)GZMK+效应记忆T细胞从邻近组织的迁移是主要外部来源；(C)组织驻留T细胞形成第三来源，但在不同肿瘤类型之间有所不同。这三种机制的相对贡献可能与肿瘤微环境的免疫状态有关。

调节性T细胞特性与肿瘤浸润CD8+T细胞特性的比较

虽然在不同的癌症类型中观察到肿瘤浸润的CD8+T细胞模式一致，但CD4+T细胞的情况更为复杂。总体而言，CD8+T细胞比CD4+T细胞有更高的克隆性增殖，在相同的测序深度下，CD8+T细胞克隆性比CD4+T细胞高。一个例外是CD4+FOXP3+调节性T细胞(Tregs)，它表现出克隆性增殖模式和其他类似于肿瘤浸润性CD8+T细胞的生物学行为。

与肿瘤浸润性CD4+T细胞的克隆性扩增程度较低相比，肿瘤驻留的Tregs在多种癌症类型中表现出较高的克隆性扩增水平，并且这一人群显示出与高度增殖一致的标记。与肿瘤浸润性CD8+T细胞相似，局部增殖可能是肿瘤浸润性T细胞的主要来源。肿瘤浸润性T细胞(Tregs)与常规CD4+T细胞(1型辅助性T细胞(Th1)和Th17)之间也观察到共享的TCR，并且在肿瘤邻近正常组织中与Tregs的频率很低，提示自然性和诱导性Tregs可能是提供肿瘤浸润性Tregs的外部来源。

除了克隆性扩增，肿瘤驻留T细胞的表型也与肿瘤中耗竭性CD8+T细胞部分相似，后者表达高水平的抑制性受体，包括CTLA4、TIGIT、PDCD1、HAVCR2、LAG3。同样，这些细胞往往局限于肿瘤，表现出较低的迁移分数。肿瘤驻留T细胞可分为两个亚群，其中一个亚群表达较少的抑制性受体，类似于GZMK+效应记忆CD8+T细胞与肿瘤中耗竭性T细胞之间的关系。然而，这种相似性在血液富集的Tregs中是不存在的，这表明与Tregs激活相关的基因表达水平较低，包括FOXP3，CCR8，IL2RA。肿瘤Tregs细胞的富集，特别是4-1BB+亚群，与非小细胞肺癌患者的不良预后有关，强调了它们的免疫抑制作用。此外，在肝细胞癌和其他癌症中发现了一组CD8+FOXP3+T细胞，进一步突出了肿瘤CD8+T细胞与Tregs之间的潜在联系。

肿瘤微环境中常见T细胞的新模式

与Tregs和CD8+T细胞相比，在对不同癌症类型患者进行的scRNA-seq研究中，T细胞在基因表达和TCR谱系方面表现出更大的异质性。在MSI患者的肿瘤微环境中，Th1型 CD4+T细胞的一个特定亚群显著富集，但在微卫星稳定(MSS)的结直肠癌患者却没有富集。这个CD4+T细胞亚群的特征是CXCL13和BHLHE40阳性，以及IFNG和GZMB的高表达，这表明它们具有效应功能和调节作用。这种Th1细胞在MSI患者中的富集可能解释了他们对免疫疗法的有利反应，类似于特定的细胞毒性CD4+T细胞亚群与黑色素瘤和膀胱癌的有效反应的相关性。目前还不清楚这些CD4+T细胞亚群在功能上是否相同。与MSI患者相比，MSS患者Th17细胞丰富，TCR克隆性与Tregs重叠，提示在肿瘤免疫抑制和MSS患者免疫治疗无效反应中起作用。如前所述，Th1和Th17细胞都有与Tregs相同的TCR，可能是肿瘤Tregs的外部来源。正如前列腺癌伴骨转移的小鼠模型所证明的那样，Th1和Th17反应之间的平衡及其与Tregs的转换可能形成决定肿瘤微环境免疫状态和多种癌症免疫治疗反应的重要开关。

LAMP3+树突状细胞在肿瘤微环境中的免疫调节作用

scRNA-seq不仅提供了对肿瘤浸润性T细胞生物学的重要见解，而且还揭示髓系微环境及其与肿瘤浸润性T细胞的相互作用。作为抗原提呈细胞，DC细胞是诱导和维持抗肿瘤免疫的重要组成部分。传统上，DC细胞可分为单核细胞样DC细胞(cDCs)和浆细胞样DC细胞(pDCs)，根据细胞表面标志和CD8+、CD4+T细胞活化能力的不同又可分为CD141+cDC1和CD1C+cDC2。研究表明，cDC1细胞经历了T细胞样受体(TLR)诱导的免疫原性成熟过程，CCR7和CD40表达上调。为了阐明成熟树突状细胞在癌症中的发育和功能作用，一些scRNA-seq研究已经被应用于绘制肿瘤浸润性树突状细胞的图景，并且在人类和小鼠的多种肿瘤中描述了一个成熟模式。

一项对人和小鼠非小细胞肺癌的研究显示，CCR7+DC亚群表现为活化的DCs表型，但缺乏关键的cDCs或pDCs基因的表达。与其他树突状细胞不同，成熟的、迁移性的树突状细胞亚群具有FSCN1、CCR7、CCL19、CCL22和CD274作为人类患者和小鼠模型共有的保守标记基因。这个成熟的DC亚群也富集在肝癌的肿瘤微环境和淋巴结中，可以从肿瘤迁移到邻近的淋巴结，可能是沿着CCL19的梯度迁移。值得注意的是，LAMP3，一个被报道与CD40L刺激下的DCs成熟相关的基因，将这个DCs亚群与幼稚的原代cDCs和pDCs区分开来。类似地，这种成熟的LAMP3+CCR7+DCs也在乳腺癌、结直肠癌以及携带Renca和MC38的小鼠中被发现，而另一项关于肺癌的研究确定了一组成熟的DCs富含免疫调节分子(mregDCs)，这与肝细胞癌中的LAMP3+DCs非常相似，具有相似的基因特征。

LAMP3+DC似乎是异质性来源。肝细胞癌的RNA velocity分析和线粒体突变追踪表明，肿瘤中的cDC1s和cDC2s均可分化为LAMP3+DCs，这与CITE-seq在RNA和蛋白质水平上观察到的肺癌这一亚群上的cDC1s和cDC2s标志物一致。据报道，cDC1s来源的mregDCs的诱导与肿瘤相关抗原相关。与正常肺中的迁移性DCs相比，肿瘤浸润性DCs通常表达更高水平的PD-L1和PD-L2，它们能与各种肿瘤浸润性T细胞表达的PD-1结合。事实上，与其他肿瘤髓样细胞相比，LAMP3+DCs倾向于表达更多类型的趋化因子、细胞因子和共刺激/抑制配体，它们调节肿瘤浸润性T细胞的功能，而肿瘤浸润性T细胞表达高水平的相应受体。从表型上看，来源于cDC1s的LAMP3+DCs信号可以驱动初始T细胞进入Tregs和CD8+活化状态，在肝癌中LAMP3+DCs的浸润水平与耗竭的CD8+T细胞和Tregs的浸润呈正相关。综上所述，通过scRNA-seq在多种癌症类型中鉴定LAMP3+DCs可能揭示了一种可以调节特定T细胞亚群的功能和浸润的机制。

肿瘤相关巨噬细胞表型可塑性及其免疫学意义

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤免疫微环境的另一个主要组成部分。这些细胞的功能表型通常与M1/M2巨噬细胞极化联系在一起。经典激活的M1巨噬细胞具有促炎的特征，而交替激活的M2巨噬细胞则被认为通过其抗炎功能促进肿瘤生长。尽管M1和M2二分法适用于体外小鼠模型，但该模型可能过于简单，无法解释癌症患者TAMs的特性。单细胞研究已经开始揭示癌症患者TAMs的异质性。例如，最近一项对人类肺癌间质细胞的scRNA-seq研究显示，TAMs呈M2样极化，显示出小鼠肿瘤模型中描述的M2巨噬细胞的特征，包括炎症反应和肿瘤坏死因子-α诱导的增殖途径的减少。人和小鼠肺癌髓系细胞的scRNA-seq分析证实了TAMs的这种M2样极化。然而，这样的TAMs表型模型并没有推广到更广泛的癌症类型中。在乳腺癌患者中，通过scRNA-seq表达标记物研究与M1和M2表型相关的TAMs，提示了M1/M2极化模型的局限性。在单细胞研究中，在结直肠癌、肝癌、肾癌和胶质瘤患者的TAMs中也观察到M1和M2标记的混合表达，进一步提示肿瘤微环境中巨噬细胞的表型更为复杂。

通过scRNAseq对癌症免疫疗法的研究发现

目前正在利用scRNA-seq方法来识别与癌症免疫治疗反应或抵抗相关的单个标记或特定细胞类型亚群。这些方法已经应用于黑色素瘤、胶质母细胞瘤、肺癌、肾癌和尿路上皮癌等。scRNA-seq可以用来解决癌症患者对抗PD-1治疗反应中事先存在的T细胞活化和新的T细胞招募之间的相对贡献。基底细胞癌和鳞癌中T细胞对抗PD-1治疗的反应过程中的克隆替代机制表明在这些肿瘤类型中，新的T细胞招募可能比事先存在的耗竭性T细胞的恢复更重要。越来越多的证据表明，来自邻近甚至周围组织的T细胞对于癌症免疫疗法的有效反应非常重要。

不同的研究表明，CXCR5/TCF1+CD8+T细胞亚群对于对免疫检查点抑制的持久反应非常重要。这种T细胞被认为具有祖细胞或干细胞样表型，低水平表达PD-1和TIM-3抑制性受体，并能自我更新和分化为终末耗竭性T细胞，以TCF1⁻和高表达抑制性受体为特征。表型上，CD8+T细胞群类似于肿瘤及邻近组织中CD8+GZMK+效应记忆T细胞的亚群，或肿瘤中MKi67+增殖的CD8+T细胞，提示效应记忆起源。在小鼠模型中，当TCF1+T细胞被耗尽时，免疫检查点抑制仍然可以控制肿瘤的生长，这一观察结果表明，在这些模型中，CXCR5/TCF1+CD8+T细胞并不是免疫治疗反应的唯一介质。除了效应记忆T细胞，组织驻留记忆和外周T细胞也可以是支持肿瘤浸润性T细胞恢复活力和补充的重要来源，最近的研究证实了肺驻留记忆T细胞和外周免疫反应对癌症免疫治疗的重要性。

新的证据表明，除了细胞毒性CD8+T细胞外，CD4+T细胞对有效的抗肿瘤免疫和免疫治疗反应也很重要。如上所述，Th1样细胞在免疫治疗敏感的MSI CRC患者中显著富集，而Th17细胞在免疫治疗抵抗的MSS患者中显著富集。肿瘤微环境中Th1细胞和Th17细胞之间的平衡也与前列腺癌对免疫检查点抑制剂的反应性有关，其中Th1细胞与较好的免疫治疗反应相关，而Th17细胞与耐药性相关。

最近在膀胱癌中的scRNA-seq研究表明，细胞毒性CD4+T细胞以MHC II类依赖的方式在介导抗PD-L1治疗的抗肿瘤效应中起着关键作用。在人类结肠癌和携带MC38肿瘤的小鼠模型中的研究表明，Th1型CD4+T细胞亚群在介导抗CD40治疗的反应中起着关键作用(48)。这些细胞毒性和Th1型CD4+T细胞亚群具有相似的表型，但有一些显着的差异。Th1型细胞比细胞毒性CD4+T细胞有更高的CXCL13表达，在肿瘤中表现出更明显的富集。除了肿瘤CD4+T细胞，来自小鼠模型和黑色素瘤患者使用抗CTLA4抗体治疗的证据表明，外周CD4+T细胞也参与介导抗肿瘤免疫。外周CD4+T细胞与癌症免疫治疗的相关性得到了肺癌研究的支持，在这些研究中，外周循环中CD4+T细胞的特定亚群预测了非小细胞肺癌患者的良好预后。在小鼠模型中，以T-bet、IFN-γ、Gzm B和TNF-α高表达为特征的具有细胞毒活性的多功能辅助性T细胞受到转录因子Blimp-1和T-bet的调节，它们的信号是最大的抗肿瘤免疫反应所必需的。值得注意的是，BLIMP1+CD4+T辅助细胞在人类癌症中表现出更多的抑制特性。因此，这些Th1型细胞可能不同于传统的Th1细胞，因为它们具有细胞毒性和抑制活性的特性。

空间逆转录提供的空间维度进一步加强了scRNA-seq在肿瘤免疫细胞研究中的作用

虽然scRNA-seq为多种癌症类型的细胞和分子景观带来了重要的洞察力，但细胞空间关系在组织解离过程中丢失了。空间转录学的出现，以及探索细胞-细胞相互作用的技术，为在解剖肿瘤微环境的组成和结构方面补充提供了一种有效的技术。scRNA-seq和空间转录学的结合已经应用于胰腺癌和人类鳞状细胞癌，并对肿瘤和免疫细胞之间的相互作用产生了新的见解。这两项研究都显示，癌细胞倾向于定位在纤维血管基质内，而免疫细胞在空间上受限于不同的间隔，这表明了癌细胞可能用来逃避免疫监视的一种空间机制。三级淋巴结构和CD8+T细胞与肿瘤细胞的空间接近程度可能是患者对免疫治疗反应的重要预测因子。空间转录学还表明，肿瘤浸润的CD8+T细胞倾向于与Tregs共定位，这为它们的表型相似性提供了空间解释，并暗示了彼此之间潜在的调控关系。CSOmap是一种生物信息学工具，可以通过配体-受体相互作用从scRNA-seq数据中重新构建细胞空间组织，它的计算模型揭示了CD8+T细胞可能通过CCL4-CCR8轴招募肿瘤相关Tregs细胞，这与scRNA-seq和空间转录结合在人类鳞癌中的观察结果一致。通过CSOmap从耗竭性CD8+T细胞的微环境中去除Tregs，结果表明， CD8+效应T细胞和CXCR6+组织驻留的CD4+T辅助细胞的浸润可以通过CCL5-CXCR3轴得到增强，这一结果也得到了最近一项黑色素瘤研究的支持。

结论

阐明肿瘤浸润性免疫细胞的生物学对于理解肿瘤免疫和改进癌症免疫治疗至关重要。scRNA-seq在多种癌症类型的肿瘤微环境中的应用揭示了肿瘤浸润的T细胞、DCs细胞和巨噬细胞的表型异质性，包括常见的模式和跨癌症的组织特异性改变。越来越明显的是，多种细胞类型的详细组成和功能状态影响了肿瘤免疫治疗的不同结局，通过scRNA-seq进一步了解复杂的肿瘤微环境，不仅有可能确定可靠的预测生物标记物，而且还有可能发现新的治疗策略，以补充现有的治疗药物。

后叙

好啦，我们今天的单细胞综述就此结束，这应该是咱们本系列的第一篇单细胞综述，希望能让你对单细胞测序的应用和研究现状有一定的了解。本文发表在免疫学年报上，意义重大，详尽地说明了目前单细胞测序技术在肿瘤免疫微环境和免疫治疗方面的研究进展，以及存在的问题和可能的解决思路。这些存在的问题就是我们做分析选题时可以思考的方向，这些方向的可行性如何又需要这些研究现状的支持，而解决思路又可以为我们的分析方法和结果进一步确定方向。

其实读综述就是这样，最忌讳“流水账式”地读，应该每读一个内容都要思考是否可以与自己的研究方向结合？是否为自己的课题提供了新的思路？

关于这篇综述中提到的分析方法，包括RNA velocity和空间转录组的分析方法，我们可以在后续推文或者10月份的单细胞讲席营中一起学习。这是我在“挑圈联靠”的第50篇推文了，以一篇综述来达到这一成果，还是挺开心的！

那就后台回复“feng 50”获取原文吧，我们下期见！

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