30分多的单细胞分析文章是怎么做的？

花好月圆，30多分的单细胞分析文章也很圆满

大家好，我是风。欢迎来到风风的从零开始单细胞系列一。你们看到推文的时间应该是元宵节，祝大家元宵快乐。到了元宵节，估计大部分小伙伴都已经踏上工作岗位了吧。我们单细胞系列尽量不占用大家闲暇时间，只需要你们在吃饭休息的时候打开推文，阅读一下内容就行。其他的时间该看电视看电视，该写本子就写本子(●ˇ∀ˇ●) 单细胞测序跟传统的转录组RNA-Seq测序有什么差别呢？简单理解：转录组是将样品组织均质化后进行分析得到组织细胞的基因的表达情况；单细胞测序有点不同，首先研究人员需要将细胞从组织种分离出来，然后评估细胞活性（按照markers表达将细胞分类等等），然后再测单个细胞中的基因表达情况，这时候测的是单个细胞范围的转录组信息。如果再拓展到空间转录组上当然又有了不同维度的说法，具体可以到B站看往期酸菜老师和老谈老师的直播回放，有一期直播专门给大家详细介绍了单细胞和空间转录组的内容，我们这里不再重复。

今天我们继续读单细胞的文献，经过上周的Cell Reports的洗礼，相信大家对单细胞分析的文章已经有了一个整体的脉络。今天我们元宵节嘛，我们来一篇更高分的文章应应景，看看30分的单细胞分析的文章又是怎么样的呢？

先看题目

今天给大家带来一篇2019年08月发表在Nature子刊——Nature Methods上的文章，最新影响因子为30.822：

题目为：“Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade”，即：PD-1阻断后肿瘤特异性T细胞的克隆性替换。大家还记不记得之前风风小故事专栏的免疫治疗内容里面提到的目前免疫治疗的难题，忘记了的小伙伴可以戳这篇（传送门）复习一下，这篇文章的主题其实就是解决我们提到的其中一个问题，不妨把小故事的推文作为这篇文章的背景补充：

我们同样先对题目进行拆解，疾病作者没说是什么癌症，待会我们需要在摘要中进行补充，目的是阐述PD-1治疗后肿瘤的T细胞突变特征。

按照我们解读文献的惯例，同样先来猜测作者可能会做什么内容：

首先是介绍单细胞分析的数据来源，共使用了多少了细胞进行测序得到了多少结果（跟我们上一篇一样），这里组织的选取有些特别，应该同时取PD-1治疗前和治疗后的组织进行单细胞测序；
题目既然提到了T细胞，那就需要构建肿瘤免疫微环境特征了，通过构建肿瘤免疫微环境再递进到T细胞上面；
在免疫检查位点治疗中，主要起杀伤作用的免疫细胞是T细胞，题目中也提到了T细胞，因此作者可能构建了T细胞的单细胞图谱；
锚定了T细胞后（也可能是特定类型的T细胞，目前未知），那应该会对T细胞进行靶向分析（“挑”），鉴别出疾病特异的新的marker(s)；
题目提到了Clonal replacement，那自然也少不了对突变特征的刻画；

有没发现上述猜测的内容好像跟我们上一篇解读的文章猜测的内容是同个模板？没错，基本差不多！所以拿到高分文章不要怕，慢慢拆解，其实30分跟8分差别也不大嘛！（我信你个鬼┗|｀O′|┛）

补充摘要

由于题目信息较少，我们再看看摘要补充下内容：

从摘要中我们可以提取到一下信息：

作者目的是阐述T细胞对免疫检查点封锁的反应是依赖于先前存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)的恢复还是依赖于新T细胞的招募。（这个问题也是我们之前免疫治疗小故事1中“过关斩将”部分的内容）；
作者使用的是基底细胞癌(BCC)或鳞癌(SCC)患者在抗PD-1治疗前后的79,046个位点匹配的肿瘤细胞进行测序；
作者进行了成对的单细胞RNA(ScRNA)和T细胞受体(TCR)测序。

文章脉络

结合题目，我们可以大概构建这样一个故事：

使用基底细胞癌、鳞癌患者在抗PD-1治疗前后的79,046个位点匹配的肿瘤细胞进行scRNA和TCR测序；
构建基底细胞癌和鳞癌的单细胞图谱和肿瘤微环境特征；
构建PD1治疗后肿瘤的突变全景图和拷贝数特征（对应克隆转换的内容）；
识别单细胞测序中的T细胞亚型；

联系TCR测序和scRNA测序；
肿瘤浸润性T细胞（TIL）的分子特征；
PD-1治疗后肿瘤浸润性T细胞（TIL）的克隆性替换分析

好啦，片头预告到此结束，接下来，就让我们带着预告的内容，进入到内容拆解部分吧！

内容拆解

图片拆解

Figure 1：单细胞RNAseq对PD-1阻断前后BCC TME的表征

圈和联

作者将肿瘤组织的一部分用于整个外显子组测序和整体TCR测序，然后对剩余的组织进行单细胞RNA测序。从11例晚期基底细胞癌患者中建立了5‘scRNA和TCR-seq文库，组织源于这些患者在PD-1治疗前后的24个匹配位点（Figure 1a）。CD3免疫组化(IHC)和整个外显子组测序(WES)支持对检查点治疗的免疫学反应，包括CD3+T细胞浸润增加（Figure 1b）。Figure 1c为基于外显子组测序的治疗前后新表位负荷的条形图，表示PD1治疗后T细胞新表位出现了改变，提示了肿瘤免疫编辑。最后总共获得了53,030个具有配对T细胞的恶性肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞的scRNA-seq图（Figure 1d），Figure 1d和1e都是UMAP图（跟上一篇的PCA方法不同），展现了不同的细胞类型。主要差别在于Figure 1e是根据患者来源不同而分别构建的UMAP图，分别为：根据患者身份(左上)、FACS细胞分选标记(右上)、抗PD1治疗状态(左下)和TCR检测(右下)着色的肿瘤浸润细胞的UMAP。对别Figure 1d和1e发现来自不同患者的免疫细胞聚集在一起，表明不同患者的TME免疫细胞类型一致。Figure 1f是基于scRNA-seq数据推断的CNV图谱。以成纤维细胞和内皮细胞作为正常对照，进行恶性细胞CNV推断，发现单细胞拷贝数变异(CNV)估计仅在恶性肿瘤细胞中显示患者特异性CNV。对3,548个恶性肿瘤细胞的再聚集显示为按患者和基底细胞癌亚型聚集，这表明与其他癌症一样，BCC也存在显著的肿瘤间异质性。Figure 1g为不同基底细胞癌亚型的HE染色。Figure 1h为按患者(左)和临床亚型(右)着色的恶性细胞UMAP。作者发现了577个在肿瘤之间差异表达的基因，其中包括RAS基因，这表明在BCC中存在异常的鳞状细胞通路激活，这和之前报道的恶性细胞富集了BCC和SCC的表达特征一致，显示了结节状BCC中具有显著的基质通路富集，而在浸润型和化生型BCC中有显著的鳞状特征富集。

Figure 2：耗竭性CD8+T细胞克隆扩增并表达肿瘤特异性标志物

前面说了，作者主要想探讨T细胞对免疫检查点封锁的反应是依赖于先前存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)的恢复还是依赖于新T细胞的招募，所以接下来作者将分析的重点放在了TIL上，以了解T细胞克隆对免疫检查位点治疗的反应。

挑

Figure 2a依然是用了一个UMAP图，PD-1阻断前后基底细胞癌标本中肿瘤浸润性T细胞，左边是用推断的细胞类型对T细胞簇进行标记，右边是按患者和是否进行PD1治疗进行分类。Figure 2b为不同T细胞亚群的细胞之间差异表达基因(行)的热图，右侧显示了不同T细胞亚群相关的markers基因，根据热图结果，作者发现治疗后Tfh细胞和激活的、耗竭的和耗竭的/激活的CD8+T细胞的频率增加，支持PD-1阻断主要影响CD8+T细胞的结论。接着作者使用扩散图拟时序可视化CD8+T细胞簇和有序细胞之间的关系，发现第一个扩散成分分离了活化和耗竭细胞，并与T细胞耗竭基因高度相关，包括PDCD1和HAVCR2；而第二个扩散成分将幼稚和记忆细胞与活化和耗竭细胞分离，并与T细胞活化基因高度相关，包括IFNG和TNF（Figure 2c）。

联和圈

使用共表达分析来识别免疫检查点阻断下的T细胞耗竭特征，其中包括已知的耗竭标记(HAVCR2，TIGIT)，组织驻留记忆T细胞(TRM)标记(ITGAE，CXCR6，以及肿瘤反应性CD8+TIL的标记 (Figure 2d)。这些结果表明，PD-1阻断治疗后，耗竭的CD8+TIL增加，并表达慢性激活、T细胞功能障碍和肿瘤反应性的基因特征。由于肿瘤抗原特异性CD8+T细胞在产生免疫应答时会产生克隆性扩张，所以作者又分析了单细胞TCR序列，以确定克隆扩增的细胞是肿瘤特异性的指标（联系TCR和scRNA）。根据TCRα（TRA）和TCRβ（TRB）序列对细胞进行分组，作者注意到耗竭性T细胞与其他CD8+簇相比克隆体积较大，然后使用基尼指数测量克隆性，观察到耗竭性T细胞的克隆率明显高于所有其他CD8+T细胞（Figure 2e）。为了检验克隆性增殖和耗竭之间的联系，作者分别根据与IFNG和HAVCR2表达相关的前50个基因，对所有CD8+细胞的激活和耗竭信号进行了评分(Figure 2f)。结果发现，具有高耗竭特征的T细胞表现出与肿瘤反应性相关的基因表达模式，包括CD39(ENTPD1)和CD103(ITGAE)的表达，而KLRG1的表达缺失。为了确定单个克隆的特征，我们将克隆中所有细胞的耗竭和激活分数取平均值，并用颜色将T细胞进行分类，同时在最大的克隆中观察到高耗竭基因特征，而衰竭克隆也表现出高度增殖的特征（Figure 2g）。

Figure 3：肿瘤浸润性T细胞的克隆动力学和表型转变

圈和联

接下来，作者分析了T细胞表型和克隆型之间的谱系关系。Figure 3a依旧是使用UMAP图，展示了不同T细胞对应的克隆表型，左图为经选择的TCR克隆染色的肿瘤浸润性T细胞的UMAP，右图为属于同一TCR克隆或TCR特异性组的TRB克隆的T细胞的UMAP。Figure 3b为属于同一TCR克隆或TCR特异性组的单个细胞的表型。底部的图显示了TCR特异性组内不同TCR克隆的表型。这两种分析都显示属于一个克隆或群体的单个细胞在表型上具有相似性。与从同一样本中随机选择和大小匹配的T细胞组相比，每个克隆或TCR特异性组(≥3个细胞)中具有共同群集同一性的细胞比例的分布（Figure 3c左图）。与从同一样本中随机选择和大小匹配的T细胞组相比，属于同一TCR克隆的细胞或同一TCR特异性组中不同克隆类型的细胞之间的细胞-细胞相关性的分布（Figure 3c右图）。

作者分析克隆内的不同表型是否可以影响T细胞表型之间的谱系转换。将所有克隆类型聚集在一个给定的集群(“基本表型”)中，并测量与另一个集群(“次级表型”)共享的比例，Figure 3d显示属于一个初级表型群(行)的与其他次级表型群(列)共享的克隆型的比例的热图。根据热图，作者发现CD8+T细胞表型之间的显著重叠，包括记忆和激活的T细胞，这表明激活状态之间有某种转换。而衰竭细胞和效应细胞之间具有共同的最小克隆类型，说明这些表型之间有严格区分。CD4+T细胞克隆在很大程度上局限于单一表型，这表明CD4+细胞状态之间的可塑性有限。为了追踪PD-1阻断后克隆细胞的命运，根据TCRβ序列匹配了治疗时间点之间的克隆类型，并比较了所有匹配克隆在每个时间点的主要表型（Figure 3e），发现CD4+群之间的稳定性和CD8+群之间的频繁转换，类似于单个时间点的克隆型共享。虽然我们观察到记忆和效应器之间的频繁转换到激活状态，但治疗前耗竭克隆在治疗后没有转换到非耗竭表型，这表明耗竭TIL在PD-1阻断后的表型转换能力有限（论证了主要问题中的前半部分，即T细胞对免疫检查点封锁的反应不依赖于先前存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)的恢复）。

Figure 4：PD-1阻断后耗竭的CD8+T细胞的克隆性替换

既然前面已经证明了T细胞对免疫检查点封锁的反应不依赖于先前存在的肿瘤浸润T细胞(TIL)的恢复，那这些T细胞到底是哪里来的呢？

挑和靠

由于治疗后有先前存在的耗竭性T细胞很少出现扩张，作者通过比较治疗前和治疗后每个克隆的频率，探讨了治疗后克隆丰度的变化情况(Figure 4a)。作者发现在治疗后显著扩增的克隆，其中有许多在治疗前没有被检测到的新克隆。整合scRNA-seq数据显示，每种表型的持续模式明显不同。也就是说，治疗后耗竭的克隆显著丰富了新的克隆类型；平均每个患者84%的耗尽的克隆来自新的克隆类型，而幼稚的、激活的、记忆的或效应型的记忆克隆只有40%( Figure 4b)。在所有患者中，包含至少5个细胞的治疗后耗竭克隆的55%来自新的克隆型，而记忆克隆的这一比例为20%(Figure 4c)。

那么新克隆的扩张(作者称之为“克隆替换”)是如何导致每个患者的耗竭性T细胞频率的呢？

作者发现有7名患者在治疗后CD8+T细胞耗竭频率增加，而在这7名患者中的6名来自新的克隆型。为了提高检测罕见克隆型的敏感性，作者对11名患者中的8名的剩余活检材料进行了批量TCR-seq(Figure 4e)（土豪，有钱真好）。与所有其他CD8+表型相比，耗竭性T细胞在治疗后有更高比例的显著扩增克隆，并且大多数扩增克隆来自新的克隆型(Figure 4f)。

其实文章到这里应该就结束了，接下来这部分不知道是作者遇到审稿人提问补的还是有钱任性，作者又再做了外周血TCR-seq和SCC患者的scRNA+TCRseq：为了确定是否可以在外周血中检测到新的克隆性扩增的TIL，作者对5名患者的10份血液样本进行了批量TCR-seq。总体而言，也可以在血液中检测到41%的TIL TCR克隆型，但它们仅代表6%的血液克隆型多样性（Figure 4g）。通过比较每个部位的克隆型频率，比较了肿瘤中的克隆型比外周血中的克隆型丰富程度。与其他表型相比，治疗后的耗竭克隆和特异性组的富集显著增加，这表明肿瘤优先扩张和保留，支持它们的肿瘤特异性。最后，作者想是否可以在不同的癌症类型中观察到耗竭性T细胞的克隆性替换。他们生成了26,016个TIL的scRNA+TCR-seq图谱，这些TIL来自4名接受抗PD-1治疗的SCC患者的系列肿瘤活检组织(Figure 4i)。SCC样本是在治疗后平均31天获得的，这使得在治疗后相对较早地进行TIL动态分析成为可能。作者发现处理后检测到的耗竭细胞中有相当一部分来自新的克隆型(Figure 4J)。scRNA-seq数据与批量TCR-seq数据的整合证实，与其他表型相比，耗竭T细胞中的克隆替换更优先，50%的扩增耗竭克隆来自新的克隆型，而其他扩增CD8+克隆只有29%(Figure 4k)。

通过上述内容，作者论证了科学问题的后半部分，即：T细胞对免疫检查点封锁的反应是依赖于新T细胞的招募。

文末总结

好了，文章到此结束，让我们重新理一下作者到底有多土豪：

（土豪到底有多土豪？）

作者首先做了11位BCC基底细胞癌患者的24个位点的scRNA+TCR测序；
接着为了提高检测稀有克隆型的灵敏度，又再将11位中的8位患者的剩余活检材料做了TCR-seq；
为了说明采样偏差的问题，作者针对一名患者对应部位的治疗前和治疗后各2个时间点再做了批量TCR测序；
为了确定是否可以在外周血中检测到新的克隆扩增TIL，对5名患者的10份血液样本进行了TCR-seq；
为了观察到不同癌症类型中是否同样存在耗竭性T细胞的克隆替代，再对4例SCC样本做了scRNA+TCR测序

而且还不算中间一些由于细胞活性不合格等等原因造成的沉默成本，总结起来就是一个字：“真！有！钱！”。

不过也不是有钱就能发到这么高分，我们可以看到这篇文章逻辑清新严谨，基本围绕着科学问题进行阐述，主线清晰，只能感叹一句，这是“有钱”又“有颜”，妥妥高富帅咯！对了，通过这两篇文章的学习，大家应该也发现了，单细胞分析的“靠”——临床意义，跟常规转录组不太一样，没有所谓的生存分析Cox回归等等，它更像是从临床问题出发，比如上一篇的“杯状细胞”，或者像本文一样结合PD1免疫治疗，更贴近临床实践，也更考验生物背景知识，这其实也是我们临床医生的一大优势，毕竟临床问题还是从临床实践中来嘛！

好啦，我们的第二篇文章就到这里，我们在前面风风小故事中说了非常多肿瘤免疫治疗的难题，虽然我们没有这么豪，但是不妨碍我们遐想对吧？不妨换位思考一下，如果不考虑经费的情况下，让你选取一个问题来解决，你会怎么做呢？能做到作者这样吗？

后台回复“feng39”可以获取文献原文。我们下期再见吧~

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