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中性粒细胞
近年来，研究人员对肿瘤微环境的重视程度越来越高，高分综述也是很多。咱们公号之前推送过发表在《Nature Reviews Cancer》上的《Metabolism of Immune Cells in Cancer》（超链接）和发表在《Cancer Cell》上的《Immunometabolic Interplay in the Tumor Microenvironment》（超链接）综述，前者介绍了肿瘤中免疫细胞的代谢及其影响，后者重点讨论了细胞外源性在免疫细胞代谢活动中的作用。今天我们就一起来看一下肿瘤微环境中的另外一种重要细胞——肿瘤相关中性粒细胞，以及它在肿瘤的发生发展和治疗中的潜在作用。
文章由意大利学者于2020年发表在Nature Review Cancer期刊上，截至2021年7月13日，就是在本文发表未到1年的时间里面，本人已被引用40次（数据来源：PubMed）。Nature Review Cancer期刊最新的影响因子为60.710，位列最新影响因子排行榜第9位。
摘要
中性粒细胞在预防感染、激活和调节先天免疫和适应性免疫中起着关键作用。肿瘤相关中性粒细胞（TANs）是肿瘤微环境的重要组成部分。在这里，它们可以发挥双重功能。TANs可通过促进血管生成、细胞外基质重塑、转移和免疫抑制等途径参与肿瘤炎症的发生。相反，中性粒细胞也可以通过直接杀死肿瘤细胞和参与介导抗肿瘤抵抗的细胞网络介导抗肿瘤反应。肿瘤微环境中TANs的双重潜能是中性粒细胞多样性和可塑性的基础。骨髓样检查点以及肿瘤和组织背景形成中性粒细胞功能，以响应常规治疗和免疫治疗。我们推测，中性粒细胞可以提供工具来调整当前的免疫治疗策略，为以骨髓细胞为中心的治疗策略铺平道路，这将是对目前方法的补充。
引言
长期以来，中性粒细胞一直被认为是天然免疫和极化辅助性T细胞17（TH17）细胞驱动的适应性免疫反应下游抵抗传染源的基本途径。此外，中性粒细胞不仅是急性炎症的标志，而且也是协调适应性免疫反应和慢性炎症的激活、定向和调节的重要组成部分。通过表达广泛的细胞因子、免疫抑制和刺激分子，中性粒细胞与淋巴细胞和巨噬细胞进行复杂的双向相互作用。
肿瘤微环境（TME）已成为肿瘤形成的重要组成部分。炎症细胞和先天免疫体液的成分在癌症相关炎症中起关键作用，并有助于肿瘤的进展。
尽管长期以来人们关注巨噬细胞作为癌症相关炎症的一个范例，但临床前和临床条件下的一些证据表明中性粒细胞的作用。中性粒细胞在不同程度上浸润实体肿瘤，通过中性粒细胞标记物（例如，人类CD66b和小鼠淋巴细胞抗原6G（Ly6G））的常规免疫组化染色和中性粒细胞转录标志物的表达进行评估。
在大多数（但不是所有）人类肿瘤中，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）的高浸润与不良预后相关。因此，在肿瘤细胞系移植模型和癌症基因工程小鼠模型（GEMMs）中，已报道TANs是促进肿瘤炎症的成分，中性粒细胞可通过直接杀死肿瘤细胞和/或与其他免疫成分相互作用参与抗肿瘤抵抗途径。因此，中性粒细胞在TME内具有促肿瘤和抗肿瘤的潜力，这种双重功能很可能反映了它们对环境线索的意外可塑性。
在这里，我们回顾了中性粒细胞的多样性和可塑性在肿瘤进展和转移中的作用的最新证据。以往关于中性粒细胞和TANs免疫生物学的综述为本综述提供了一个框架，其中重点是描述中性粒细胞的多样性及其预后和治疗意义。
内稳态和招募
1
发展和动员
在人类和小鼠中，中性粒细胞分别占循环白细胞的50–70%和10–25%。在外周血中，中性粒细胞是短命细胞，需要通过粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）的信号持续补充骨髓前体。事实上，编码G-CSFR的集落刺激因子3受体（CSF3R）和造血细胞特异性Lyn底物1相关蛋白X1（HAX1）的突变，其蛋白产物参与G-CSFR信号通路，与人类严重的中性粒细胞减少有关，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或G-CSFR缺乏导致小鼠严重的中性粒细胞减少。除了G-CSF发挥的重要作用外，其他介质，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和促炎细胞因子白介素-6（IL-6），会参与调节中性粒细胞的发育，特别是在炎症反应期间。
中性粒细胞从骨髓向外周血的转运受到严格调控，特别是通过趋化因子受体CXC趋化因子受体2（CXCR2）和CXCR4发出信号。骨髓基质细胞表达CXC趋化因子配体12（CXCL12）介导CXCR4+未成熟中性粒细胞（NI）的滞留；作为基于所选分子表达的操作术语，我们使用NI、NM、NA和NISG分别指未成熟中性粒细胞、成熟中性粒细胞、老化中性粒细胞和具有干扰素刺激基因特征的中性粒细胞。骨髓NM中CXCR4表达的降低与CXCR2信号的激活触发NM进入循环。衰老的中性粒细胞上调CXCR4的表达，促使其归巢回骨髓，随后被巨噬细胞清除。造血细胞组成和分子特征，包括富含CXCL12的网状间充质干细胞（CAR-MSCs）的数量，由巨噬细胞对中性粒细胞的节律性清除来调节。
循环中的中性粒细胞老化过程由肠道微生物群调节，并由中性粒细胞自身通过细胞自主转录程序控制。这是否适用于其他髓系细胞，如单核细胞，尚不清楚。事实上，BMAL1转录因子的昼夜节律表达以细胞固有的方式控制中性粒细胞产生CXCL2。反过来，CXCL2通过CXCR2发出信号，诱导中性粒细胞衰老。清除凋亡的中性粒细胞和形成新的细胞是相互联系的过程，作为一个稳态变阻器，对防止加剧炎症和组织损伤至关重要。
2
癌症的招募
在小鼠和人类已建立的肿瘤中，通常观察到造血发生改变，反映肿瘤细胞、肿瘤相关基质细胞和浸润白细胞（包括T细胞）、巨噬细胞和中性粒细胞产生生长因子（G-CSF和GM-CSF）和炎性细胞因子（例如IL-6、IL-1β和IL-17）。中性粒细胞和未成熟髓细胞在循环中的出现都发生在人和小鼠身上，这些细胞共同构成免疫抑制的有效介质。
中性粒细胞表达高水平的趋化因子受体CXCR1和CXCR2，它们在向TME的募集中起主要作用，其中CXC趋化因子配体（例如，CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6和CXCL8（也称为IL-8））由肿瘤细胞、肿瘤浸润性白细胞、内皮细胞和成纤维细胞表达。除趋化因子外，炎性细胞因子（如IL-17、IL-1β和肿瘤坏死因子（TNF））也参与了肿瘤中性粒细胞的动员和募集。尤其是，这些细胞因子是炎症循环的一部分，导致产生G-CSF，随后形成和动员骨髓中的中性粒细胞。此外，IL-1β和G-CSF显著延长中性粒细胞的存活时间。除了这些分子外，肿瘤衍生的氧化甾醇和补体成分过敏毒素C5a也被证明有助于小鼠肿瘤中性粒细胞的募集。
肿瘤中中性粒细胞的动力学和寿命还有待于充分阐明。在头颈癌移植小鼠模型和用3-甲基氯蒽（3-MCA）治疗诱导的小鼠原发性肉瘤发生中，在早期时间点（肿瘤发生和致癌物注射后的几小时和/或天）肿瘤部位或致癌物注射部位已经存在中性粒细胞。活体多光子成像显示，在头颈癌移植模型中，中性粒细胞在肿瘤细胞注射后3小时内浸润肿瘤，并在TME中持续3天。
有趣的是，与肿瘤周围的中性粒细胞相比，肿瘤内中性粒细胞的运动性降低，表明不同的激活或极化状态。在癌症发展早期，从荷瘤小鼠和癌症患者分离的中性粒细胞在体外表现出自发和趋化因子诱导的迁移增加，这种迁移是通过嘌呤能受体P2Y1和P2Y2的自分泌ATP信号介导的。因此，中性粒细胞在癌症发展过程中会发生动态变化。
中性粒细胞也被报道聚集在转移中，癌细胞和间质细胞表达的G-CSF、CXCL1和CXCL2促进了它们的募集。在乳腺癌原位移植模型和癌基因驱动的乳腺癌发生的GEMM中，中性粒细胞进入转移性肺的动员受非典型趋化因子受体2（ACKR2）调节，ACKR2是炎症CC趋化因子的诱饵和清道夫受体，在早期造血前体中表达。这种分子在小鼠中的遗传缺陷增加了造血祖细胞中炎性CC趋化因子受体1（CCR1）、CCR2和CCR5的表达，从而加速了中性粒细胞的成熟率、动员和活化，从而抑制了转移。在乳腺癌患者中，ACKR2的表达与疾病的分期呈负相关。然而，ACKR2也在非肿瘤性和肿瘤性乳腺上皮细胞中表达，造血细胞与肿瘤细胞表达的相对重要性仍有待评估。
因此，在临床前小鼠模型和人类中获得的结果表明，肿瘤组织中中性粒细胞的募集和存活涉及骨髓生成的上游调节以及趋化因子、细胞因子、G-CSF和补体成分的复杂网络。
中性粒细胞多样性
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健康中性粒细胞多样性
在稳态条件下，循环和组织中性粒细胞表现出相当的多样性，其表型和功能异质性由成熟和老化以及来自组织微环境的线索所驱动。昼夜节律振荡和衰老影响中性粒细胞蛋白质组，包括趋化因子受体、模式识别受体和参与粘附的分子、炎症体和囊泡转运以及中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的产生和迁移能力。
在循环中，骨髓新释放的NM具有CD62L和CXCR2的高表达和CXCR4表达低的特点。NM在夜间和清晨释放，在环境时间（ZT）13（即在12h光-12h暗循环开始后13h）占主导地位。中性粒细胞老化过程是一个真实的昼夜节律过程。在6-8h内，CD62L的表达显著降低，NA的特征是CXCR4和CD11b的高表达和高调控的细胞核，在ZT5（即在12h光-12h暗循环开始后5h）占优势。这些表型变化有利于中性粒细胞的清除，并提示中性粒细胞依赖性免疫和炎症反应不稳定，并且可能在昼夜周期内波动。与此假设一致，与NM相比，NA显示减少了向炎症组织的迁移。
关于老化中性粒细胞产生NETs的能力，已有不同的结果报道。这些明显相互矛盾的结果可能反映了用于富集NA的不同方法（即，通过注射阻断P-选择素和E-选择素的抗体或在未治疗小鼠的ZT5处分离中性粒细胞预防中性粒细胞外渗）。
此外，在稳态条件下，循环中的中性粒细胞会经历稳态脱颗粒，并在穿透组织之前失去形成NETs的能力，从而限制了其组织损伤的可能性。正如在中性粒细胞老化中观察到的那样，这一过程是由控制由BMAL1诱导的CXCL2昼夜节律表达的细胞内在机制驱动的。因此，中性粒细胞中和中性粒细胞老化共享分子机制，并整合到一个昼夜节律程序中，保护宿主免受过度的炎症反应。
除了NM和NA外，循环中性粒细胞的单细胞RNA测序（scRNA seq）分析还鉴定出NISG，其特征是表达一组干扰素刺激基因。这种中性粒细胞亚群存在于小鼠和人类身上，可以代表一个准备抵抗感染的中性粒细胞群。有趣的是，肿瘤中也发现了类似的亚群。
在组织内，如淋巴结和脾脏，中性粒细胞可以承担重要的稳态功能，并获得特定的免疫调节特性。特别是在稳态条件下，表达主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ类分子的中性粒细胞存在于靠近T细胞的淋巴结中，提示其作为抗原呈递细胞（APC）的作用。存在于脾脏边缘区的中性粒细胞通过表达B细胞激活因子（BAFF）、增殖诱导配体（APRIL）和IL-21来激活B细胞，从而促进免疫球蛋白类的转换和抗体的产生。
因此，在体内平衡中，中性粒细胞表现出一种先前未预料到的异质性，并被整合到免疫调节回路中。在单核吞噬细胞中，来源于胚胎前体的细胞主要执行稳态功能，而来源于出生后循环单核细胞的巨噬细胞的主要功能是对损伤和炎症作出反应，这些细胞的可塑性是多样性的主要驱动力。然而，没有证据表明个体发育不同的中性粒细胞或这种严格定义的亚群。因此可以推测，中性粒细胞的多样性是对分化和环境信号的可塑性反应的结果。
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癌症中性粒细胞多样性
癌症已经成为中性粒细胞可塑性和多样性的范例，中性粒细胞成熟阶段产生，对组织线索的反应和癌症进展。荷瘤小鼠的中性粒细胞分化和成熟轨迹发生深刻变化。在晚期肿瘤形成的小鼠中，具有免疫抑制特性的未成熟髓样细胞出现在循环、原发性肿瘤和转移瘤中。同样，在黑色素瘤移植小鼠模型中，发现早期的单能中性粒细胞祖细胞（NePs）在骨髓和外周都有聚集，黑色素瘤患者的血液中也发现了类似的细胞亚群（CD66b+ ;CD117+ ;CD34+/–）。
在健康人和非荷瘤小鼠中，NePs分别约占所有循环CD45+细胞的1%和0.02%，在黑色素瘤患者和荷瘤小鼠中，NePs分别增加到3-9%和0.2%。尽管这些祖细胞并不对应于NM的一个子集，但它们确实有助于肿瘤患者和荷瘤小鼠中中性粒细胞的多样性。
对乳腺癌小鼠和无瘤小鼠脾脏和血液中的中性粒细胞进行转录组学分析，发现荷瘤小鼠中性粒细胞的转录程序发生了明显的改变，导致免疫抑制表型，其特征是产生活性氧（ROS），一氧化氮（NO）和精氨酸酶2（ARG2）在体外抑制T细胞增殖。
在人类和小鼠肺癌中，肿瘤浸润髓样细胞的scRNA-seq分析显示TANs形成了一个连续的表型状态，在人类和小鼠中可分别分解为5个和6个细胞亚群。这些细胞亚群中的三个基因表达模块在人类和小鼠之间是保守的，包括表达典型中性粒细胞标记物的模块（例如，基质金属蛋白酶9（MMP9）、S100A8和S100A9）、表达参与肿瘤炎症和生长的分子的模块（例如，CC趋化因子配体3（CCL3）和巨噬细胞集落刺激因子1（CSF1））以及具有有限数量的细胞的模块，显示I型干扰素应答基因的强表达（例如，干扰素调节因子7（IRF7）和具有四肽重复序列1的干扰素诱导蛋白（IFIT1）。
对TANs的分析揭示了TME中的信号是如何形成它们的功能的。在肺癌和间皮瘤的癌基因Kras诱导的GEMM和转植模型中，转化生长因子β（TGFβ）在肿瘤前向极化，其特征是TANs具有高表达ARG1、CCL17和CXCL14和低表达的CXCL10、CXCL13、CCL6、TNF和细胞间粘附分子1（ICAM1）的特点。与用于极化巨噬细胞的M1–M2命名法相似，N1和N2分别被用来指抗肿瘤和促肿瘤中性粒细胞。然而，在3-MCA诱导的原发性肉瘤中，TANs表现为N1和N2之间的杂交表型。
与TGFβ相比，干扰素β（IFNβ）或IFNγ与GM-CSF的联合作用使中性粒细胞趋向于抗肿瘤状态。在非小细胞肺癌（NSCLC）早期，IFNγ和GM-CSF可促进表达共刺激分子OX40配体（OX40L）、CD86和4-1BB配体（4-1BBL，也叫TNFSF9）的APC样MHCII+中性粒细胞的分化；也称为TNFSF9）的APC样MHCII+中性粒细胞的分化。在人类头颈部肿瘤中观察到类似的人类白细胞抗原DR（HLA-DR）+中性粒细胞群，在空间上与活化的T细胞相关。
总的来说，证据表明，在癌变的早期，TANs是介导抗肿瘤抵抗的细胞网络的一部分，而肿瘤的进展与功能开关有关，使这些细胞处于免疫抑制、促肿瘤状态。
肿瘤炎症中的中性粒细胞
来自小鼠模型和患者的证据（后者将在下面详细讨论）强烈表明中性粒细胞是许多类型癌症中促进肿瘤炎症的重要组成部分。支持这一观点的是，抗体介导的中性粒细胞耗竭可防止GEMMs的原发性癌变和转移，并抑制移植小鼠模型的肿瘤生长。
在TME中，TANs已被证明影响上皮遗传不稳定性、肿瘤细胞增殖、血管生成、组织重塑以及先天性和获得性淋巴细胞介导免疫的抑制。大量ROS的产生是中性粒细胞的基本特性。在癌症中，中性粒细胞衍生的ROS与上皮细胞的DNA损伤和遗传不稳定性有关。然而，ROS诱导DNA损伤的非依赖性机制也存在，包括中性粒细胞衍生的微粒子，这些微粒子传递特定的促炎性小RNA（即，miR-23A和miR-155）进入肠上皮细胞，通过下调核膜蛋白lamin B1和同源重组途径的调节因子RAD51促进DNA双链断裂的积累。
中性粒细胞可以表达一系列与肿瘤生长和发展相关的细胞因子和生长因子，包括表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）和血小板源性生长因子（PDGF）。在由致癌Kras诱导的肺腺癌GEMM中，由于中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的遗传缺陷，肿瘤负担显著降低，这与肿瘤细胞增殖减少有关。
在体外，NE通过进入内质体并降解胰岛素受体底物1（IRS1）激活人和小鼠肺癌细胞的增殖，IRS1促进PI3K和PDGF受体（PDGFR）之间的相互作用。NE的这种体外促有丝分裂活性也在不同来源的上皮细胞和肿瘤细胞中观察到，包括人食管细胞系和乳腺上皮细胞通过EGF受体（EGFR）和Toll样受体4（TLR4）的反式激活，以及人前列腺癌细胞通过MAPK信号通路的激活。
中性粒细胞通过产生促血管生成因子BV8、MMP9和血管内皮生长因子A（VEGFA）在促进肿瘤血管生成中发挥重要作用。在细胞外基质中，TAN衍生的MMP9诱导VEGFA的释放和激活以及随后的血管生成，而BV8诱导髓细胞动员并作为内皮细胞的有丝分裂原。中性粒细胞衍生的BV8与抗VEGF治疗的耐药性有关，抑制G-CSF或IL-17可提高抗VEGF的疗效。总之，这些研究支持中性粒细胞在肿瘤发生过程中的初始血管生成开关中的作用。
在不同肿瘤类型（即肝、乳腺、肠、胃癌）中观察到NETs，其产生主要受缺氧、补体或脂肪酸的驱动。NET相关的分子，如高迁移率基团蛋白B1（HMGB1）、NE和MMP9等，可诱导癌细胞增殖。在小鼠肺转移模型中，持续性肺炎症促进了NETs的形成，进而诱导休眠癌细胞的增殖。事实上，由NE和MMP9对细胞外基质组分层粘连蛋白111进行蛋白质分解改造，诱导产生一个新的表位，通过α3β1整合素激活，触发休眠癌细胞增殖。
此外，NETs内循环肿瘤细胞（CTCs）的包封促进了转移瘤的形成，体内注射DNase来消除NETs可以降低这种效应。在小鼠脾内注射肺癌和结肠癌细胞诱导肝转移模型中，经体腔镜检显示，DNase治疗小鼠肝窦CTCs的粘附性降低。体外研究表明，NETs的HMGB1诱导TLR9依赖性激活癌细胞，促进癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。此外，NETs的髓过氧化物酶（MPO）促进内皮细胞中由过氧化氢（H2O2）诱导的TLR4依赖性促血管生成反应，其特征是增殖和运动。因此，NETs通过促进血管生成、细胞外基质重塑和肿瘤细胞增殖等途径参与肿瘤促炎症。
中性粒细胞的促瘤功能贯穿于远处解剖部位播散和接种的多步骤过程。据报道，中性粒细胞可在肺和肝等多种器官中形成转移位。此外，中性粒细胞与血液中的CTCs结合，有利于渗出和随后的转移生长。
多种肿瘤模型对中性粒细胞介导的促进转移的分子机制提供了见解。在KEP小鼠中，具有免疫抑制活性的中性粒细胞的全身聚集与自发性肺转移的形成增加有关。在机制上，癌细胞中p53的缺失促进WNT配体的分泌，从而刺激巨噬细胞产生IL-1β。反过来，IL-1β通过γδT细胞激活IL-17的产生，γδT细胞驱动中性粒细胞在循环和肺中积聚并促进转移瘤的形成。
由于IL-17在信号通路中位于G-CSF的上游，它增加了中性粒细胞的形成，并使其极性化为具有免疫抑制活性的细胞。事实上，G-CSF可以促进免疫抑制性中性粒细胞的产生，并且在KEP小鼠体内中和G-CSF可以逆转中性粒细胞的免疫抑制表型。因此，来源于TH17细胞或γδT细胞的IL-17参与荷瘤个体中观察到的中性粒细胞，并驱动中性粒细胞来源的肿瘤前活性。
在肺转移前中，神经营养因子产生促进转移起始细胞外渗和生长的因子，包括促血管生成分子BV8和MMP9（在MMTV-PyMT小鼠中观察到）、化学引诱剂S100A8和S100A9（在KEP小鼠中观察到）、介导凝血酶bospondin 1（TSP1）裂解的蛋白酶NE和组织蛋白酶G；其结果是细胞外基质降解和TSP1介导的肿瘤细胞生长抑制（在MMTV-PyMT小鼠中观察到）以及促炎细胞因子IL-1β和中性粒细胞趋化剂白三烯B4（LTB4）（在MMTV-PyMT小鼠中观察到）减弱。
免疫抑制
NI和NM可以表达一系列能够抑制固有和适应性淋巴细胞功能的介质。这些包括ROS、活性氮中间产物（RNI）、ARG1、前列腺素和免疫检查点的配体。
长期以来，中性粒细胞衍生的ROS一直与肿瘤，尤其是晚期肿瘤中T细胞活化的抑制有关。在乳腺癌移植小鼠模型中，TME中的葡萄糖剥夺触发了中性粒细胞的代谢开关，从而导致线粒体脂肪酸氧化增强、ROS生成增加和随后的T细胞抑制。除ROS外，中性粒细胞还可以通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）依赖的NO生成抑制T细胞的活化，正如在荷瘤KEP小鼠的中性粒细胞中观察到的那样。
TANs产生的ARG1降低了TME中l-精氨酸的可用性，后者控制T细胞代谢并促进T细胞存活。进而导致T细胞功能障碍和T细胞介导的抗肿瘤免疫功能的改变。TGFβ可促进TANs表达ARG1。重要的是，中性粒细胞产生ARG1已被证明会阻碍人类癌症，包括肾细胞癌和晚期非小细胞肺癌的T细胞反应。
内质网应激与肿瘤中的脂质代谢、病理激活和免疫抑制活性有关，包括非小细胞肺癌和头颈癌患者中性粒细胞。在非小细胞肺癌中，癌基因Kras诱发的胰腺癌GEMM与Trp53突变和淋巴瘤小鼠可移植模型相结合，免疫抑制中性粒细胞的特征是其低密度和与内质网应激反应相关的基因表达增加（例如C/EBP同源蛋白（CHOP，又称DDIT3）、X盒结合蛋白1（XBP1）、结合免疫球蛋白（BIP，也称HSP5））和AMP依赖转录因子（ATF4））。
中性粒细胞内质网应激的诱导可上调与脂质代谢相关的清道夫受体凝集素样氧化LDL受体1（LOX1）的表达，并可启动强免疫抑制活性。在非小细胞肺癌和头颈癌患者中，LOX1+中性粒细胞与LOX1-中性粒细胞相比，ROS和ARG1表达较高，并将中性粒细胞群体定义为具有免疫抑制活性。除LOX1外，肿瘤小鼠和头颈、乳腺和肺肿瘤患者中存在免疫抑制中性粒细胞，还显示出与脂质贩运有关的其他蛋白（如CD36和脂肪酸转运蛋白2（FATP2））的增加。
虽然LOX1在中性粒细胞免疫抑制活性中的作用尚不明确，但表达FATP2的中性粒细胞对花生四烯酸的摄取增加，可促进前列腺素E2（PGE2）的生物合成和随后的免疫抑制。因此，在荷瘤小鼠体内应用FATP2抑制剂可降低中性粒细胞的免疫抑制活性和肿瘤生长。这些结果为中性粒细胞脂质代谢的新策略提供了依据。
中性粒细胞可以表达配体，激活T细胞上的免疫检查点。程序性细胞死亡1配体1（PDL1）在小鼠中由缺氧诱导因子1α（HIF1α）通路诱导，在人类中由炎性细胞因子（如IL-6、IFNγ和GM-CSF）诱导。在人肝细胞癌和胃癌中发现了表达PDL1的中性粒细胞，并显示其具有预后意义。因此，中性粒细胞是骨髓和间质细胞网络的一部分，表达PDL1，驱动免疫检查点参与和T细胞衰竭。然而，PDL1在不同肿瘤类型中性粒细胞中的表达和功能尚需进一步研究。
除PDL1外，V域免疫球蛋白抑制T细胞活化（VISTA）在肿瘤相关的髓细胞上表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。在黑色素瘤移植小鼠模型中，阻断VISTA产生髓系分化初级反应88（MYD88）介导的促炎反应，导致抗肿瘤免疫的发展。VISTA抑制增强肿瘤相关树突状细胞和单核细胞产生IL-12，并逆转其对T细胞的免疫抑制活性。
相比之下，抑制VISTA后中性粒细胞的免疫抑制活性没有改变，这表明需要进一步研究来确定VISTA在中性粒细胞中的作用及其对肿瘤免疫的影响。此外，这些数据表明，免疫抑制性TANs水平升高的肿瘤可能对以VISTA为靶点的抗体治疗产生耐药性，结合VISTA抑制剂和中性粒细胞耗竭或重编程的方法应在临床前模型中进行评估。
尽管在炎症环境中，中性粒细胞和固有淋巴细胞（ILC），特别是自然杀伤细胞（NK）之间存在重要的交互，但是关于TME中这两种固有细胞之间的双向相互作用的报道有限。中性粒细胞通过阻止NK细胞介导的肿瘤细胞从最初的播散部位清除而促进转移播散。
肿瘤细胞系的体外实验和体内移植模型的证据表明，肿瘤细胞产生的CXCR1和CXCR2的配体可以诱导TME中的NETs的形成，而NETs又通过损害NK细胞和T细胞与肿瘤细胞的接触来保护肿瘤细胞，使其免受NK细胞和T细胞的细胞毒性作用。在人体中，G-CSF动员的中性粒细胞抑制NK细胞的活化。
相反，NK细胞可以通过抑制VEGFA的表达，以IFNγ依赖的方式控制中性粒细胞的促肿瘤和血管生成功能。然而，在造血干细胞移植受体小鼠移植同基因结肠癌细胞系后，NK细胞与中性粒细胞相互作用后，NK细胞介导的显著抗肿瘤活性可归因于NK细胞活化和存活的增强。因此，TME中中性粒细胞与NK细胞的相互作用可能是依赖性的。
中性粒细胞在抗癌中的作用
上述结果和临床相关证据表明，中性粒细胞是许多小鼠和人类肿瘤中促肿瘤炎症和免疫抑制的重要组成部分。与这些观察结果形成明显对比的是，中性粒细胞在体外和体内也被证明介导抗肿瘤抵抗，这表明这些细胞具有双重潜能。
中性粒细胞的大量募集和活化可导致抗肿瘤活性。中性粒细胞可以通过直接接触和产生ROS杀死肿瘤细胞。ROS介导的杀伤涉及TRPM2，一种H2O2依赖性通道，诱导致命的钙（Ca2+）流入靶细胞。TRPM2在经历上皮-间充质转化（EMT）的癌细胞中表达上调，这也与CXCL2分泌增加有关，表明TRPM2除了触发凋亡级联反应外，还维持中性粒细胞的募集。
中性粒细胞杀伤装置包括NO、TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）和TNF的表达。后者诱导肝细胞生长因子受体（HGFR，也称为MET）的表达。在不同肿瘤细胞系移植小鼠模型（如Lewis肺癌和纤维肉瘤）中进行的研究表明，HGF存在于TME中诱导中性粒细胞募集和NO的产生，从而导致肿瘤细胞的杀伤。
然而，在黑色素瘤的移植小鼠模型中，中性粒细胞中的HGF-MET信号导致免疫抑制表型与抗肿瘤T细胞的有限扩增相关，并且对过继T细胞转移和免疫检查点阻断疗法的反应降低。因此，在不同的肿瘤背景和治疗条件下，MET对中性粒细胞表达的影响仍有待于充分阐明。
中性粒细胞在转移灶中的聚集和活化可以通过清除癌细胞减少转移灶的形成。在乳腺癌原位移植小鼠模型中，原发性肿瘤表达的G-CSF和CCL2诱导转移前肺中性粒细胞的动员和活化，从而导致ROS依赖性杀伤肿瘤细胞。抗体介导的中性粒细胞缺失不影响原发肿瘤的生长速度或CTCs的数量，但增加了肺转移负担，提示中性粒细胞在转移中起作用。这一结果表明原发性肿瘤和中性粒细胞之间相互作用，激活其抗肿瘤活性并控制转移进展。
在免疫缺陷小鼠中，将具有低自发无定向潜能的人乳腺癌细胞移植到乳腺脂肪垫中，导致转移前肺中的中性粒细胞重新编程，表现为与跨膜蛋白173 (TMEM173，也称STING)表达相关的高细胞毒活性。在这种情况下，与具有高转移潜能的乳腺癌细胞相比，自发转移效率低的乳腺癌细胞显示CCL2表达增加。肿瘤源性CCL2诱导产生IFNγ的CCR2+单核细胞的募集。反过来，IFNγ上调TMEM173并增强中性粒细胞的细胞毒活性。这些观察结果强调了中性粒细胞作为效应细胞的能力。
除了介导直接杀伤外，中性粒细胞还参与T细胞依赖性抗肿瘤免疫网络。TANs可产生趋化因子，包括CXCL10、CCL2、CCL3、CXCL1和CXCL2，这些趋化因子可招募T细胞和其他白细胞。中性粒细胞可获得APC表型，在早期人类肺癌中，一群不成熟的CD11b+CD15hiCD10–CD16int/低嗜中性粒细胞刺激了CD4+和CD8+T细胞的增殖。体外实验表明，对于TME中存在的GM-CSF和IFNγ，这些NI获得了APC特征，具有HLA-DR和CD86的表达及增强抗肿瘤T细胞反应的能力。此外，从人结直肠癌活检标本中分离的中性粒细胞在体外对T细胞受体（TCR）触发的反应中放大了CD8+T细胞的激活。
肠道微生物群在炎症和结直肠癌发生中起作用。据报道，中性粒细胞通过单核细胞和肿瘤细胞对TME中产生的IL-1的反应而在大肠癌中具有肿瘤抑制作用，从而增强中性粒细胞抗菌肽的表达及其随后的抗菌活性。除大肠癌外，Kras突变和Trp53缺失诱导的GEMM肺癌发生也与气道微生物群失调有关，后者刺激γδT细胞产生IL-17，导致中性粒细胞和肿瘤生长。因此，中性粒细胞可以在控制微生物群诱导的促肿瘤炎症中发挥作用。
在3-MCA诱导的原发性肉瘤发生中，中性粒细胞、巨噬细胞和非常规T细胞亚群（UTCs），即CD4–CD8–TCRαβ+双阴性UTCs（UTCαβ），之间的三部分相互作用，被发现是建立有效的抗肿瘤免疫所必需的。在肉瘤发展的早期阶段，中性粒细胞通过巨噬细胞放大IL-12的产生，进而促进UTCαβ向1型免疫应答和IFNγ产生的极化。然而，UTCαβ作为T细胞的一个亚群，其作为抗肿瘤效应细胞的作用机制及其在人类肿瘤中的存在、意义和作用尚需进一步研究。有趣的是，在生信分析表明，这种中性粒细胞依赖性抗肿瘤轴与选择人类肿瘤是相关的。
因此，中性粒细胞可以在肿瘤免疫中发挥双重的，看似相反的作用。疾病阶段以及肿瘤类型和组织背景是这些细胞在促进或抑制癌症中的特殊作用的关键决定因素。在不同肿瘤类型和不同肿瘤阶段发现的炎症介质的水平和性质可能决定中性粒细胞的表型。同样的生长因子G-CSF可以通过刺激抗肿瘤和促肿瘤中性粒细胞的细胞毒性活性或获得免疫抑制活性（视情况而定）来驱动它们的分化和活化，这一事实强调了所涉及的调控途径的复杂性。为了综合有关中性粒细胞在肿瘤中的双重作用的可用数据，我们推测在肿瘤发展的早期阶段，骨髓细胞处于抗肿瘤状态，而侵袭和转移的进展与肿瘤前免疫抑制表型的获得相关并受其驱动。
人类癌症中的中性粒细胞
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发生和意义
如上所述，骨髓生成增加是晚期肿瘤的一个共同特征，并且在癌症患者中也观察到中性粒细胞多样性，包括肺癌、头颈部癌症和黑色素瘤。通过对血液样本进行飞行时间（CyTOF）质谱分析，一项研究确定了黑色素瘤进展不同阶段CD66b+中性粒细胞的不同表型。值得注意的是，在肿瘤进展过程中，以表达CD66b+、CD10+、CD101+和CD16+为特征的终末分化NM亚群的丰度逐渐减少，而以表达CD66b+、CD117+、CD49d+和CD79b+为特征的NI则增加。然而，中性粒细胞不成熟与免疫抑制活性之间的关系仍然存在争议。事实上，不成熟的人类CD10–CD66b+中性粒细胞被描述为促进T细胞活化，而CD10+NM的作用则相反。
在外周血中，高中性粒细胞计数和高中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）与广泛的实体瘤（例如大肠癌、黑色素瘤和乳腺癌、前列腺癌和肺癌）患者的不良预后相关。NLR的预后意义在一项荟萃分析中得到验证，这项荟萃分析涉及100项研究，涉及40559例患者和22例实体瘤。然而，NLR在临床上的相关性仍有待进一步研究。例如，在转移性乳腺癌患者中，NLR被发现与疾病分期、中枢神经系统受累和内脏转移有关，但其预后意义在多变量分析中丢失。
中性粒细胞在人类实体瘤中的数量是可变的，这是通过常规免疫组织化学（例如，通过CD66b染色）和中性粒细胞转录特征来评估的。总的来说，高TAN浸润与较差的预后相关。
例如，在一项大型研究中，使用CIBERSORT（通过估计已知RNA转录物的相对亚群来确定细胞类型）方法对大约18000名患者中的22个白细胞群进行量化，这些患者有39种不同的肿瘤类型，中性粒细胞标志物是最重要的负预后因素。在早期NSCLC中，TANs是最具代表性的白细胞群，与T细胞浸润呈负相关。因此，抑制T细胞介导的免疫可能是其不良临床意义的机制之一。此外，对肝细胞癌活检标本的相关分析显示中性粒细胞的出现与血管生成有关。
与上述结果形成明显对比的是，在选定的人类肿瘤中，通过免疫组织化学或中性粒细胞转录特征评估的高水平TANs与更好的预后相关。其中包括大肠癌、子宫内膜癌、浸润性导管乳腺癌、低度胶质瘤和未分化多形性肉瘤（UPS）。
在大肠癌中，TANs与CD8+T细胞共定位，TANs与CD8+T细胞联合浸润与CD8+T细胞单独浸润相比具有更好的预后价值。在UPS中，但在其他肉瘤中，神经营养因子信号与I型免疫反应和更好的临床结果相关。由于UPS可能是3-MCA诱导小鼠原发性肉瘤发生的人类对应物，中性粒细胞可能参与UTCαβ介导的抗肿瘤抵抗。因此，在选定的人类肿瘤中，TANs似乎可以通过直接杀死肿瘤细胞或通过参与与固有和适应性淋巴细胞的合作网络来介导抗肿瘤抵抗。目前的数据表明，中性粒细胞及其功能的显着性，在循环和肿瘤环境中，可能受到组织和肿瘤环境的强烈影响。
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对化疗、放疗和免疫治疗有反应
TAN浸润影响对不同抗癌治疗方式的反应。中性粒细胞浸润率高通常与化疗和放射治疗的不良反应有关。值得注意的例外是大肠癌、胃癌和高级别卵巢癌，在这些癌症中，高水平的TANs与更好的化疗反应相关。这些关于TANs对细胞减少疗法的预测价值的不一致的观察结果很可能反映了这些癌症免疫生物学的重要差异。
外周血中性粒细胞和高NLR与免疫检查点抑制剂（ICIs）的不良反应有关。如上所述，中性粒细胞表达免疫检查点的配体，包括PDL1和VISTA。在肝细胞癌和胃癌患者中，TME中高水平表达PDL1的中性粒细胞与低存活率相关。因此，中性粒细胞是ICIs耐药的靶点和机制。
总之，中性粒细胞是已建立的治疗方法抗肿瘤疗效的重要决定因素，包括化疗、ICIs和介导抗体依赖性细胞毒性（ADCC）的单克隆抗体（mAbs）。此外，包括髓系检查点靶向策略、新的免疫检查点阻断免疫疗法和TGFβ抑制剂在内的实验性治疗都将中性粒细胞作为其治疗靶点之一。
中性粒细胞靶向和重编程
更好地理解中性粒细胞在肿瘤进展中的复杂作用，将为设计治疗方法提供基础。尤其是，解剖不同癌症类型和部位（即外周血或TME）中性粒细胞的多样性和可塑性，对于特异性靶向这些细胞并使其处于抗肿瘤状态是一个重大挑战。如上所述，中性粒细胞表达的趋化因子受体CXCR2和CXCR1对它们向TME的募集、激活状态的调节和循环振荡都很重要。
根据临床前模型的结果，通过阻断CXCL8、CXCR1和/或CXCR2抑制中性粒细胞的募集现已进入临床评估阶段。最近的研究表明，晚期实体癌患者（1344例黑色素瘤、NSCLC和肾细胞癌169，1445例尿路上皮癌和肾细胞癌170）的血清和肿瘤中CXCL8水平升高与中性粒细胞浸润增加有关，对ICIs的生存期缩短和临床反应降低。
全人类CXCL8单克隆抗体（BMS-986253）在晚期实体瘤患者中的临床益处正在评估中。BMS-986253在15例转移性或不能切除的晚期实体瘤患者中的第一阶段临床试验表明，该治疗是安全的，耐受性良好。CXCR2抑制剂（AZD5069、reparixin174、SX-682和navarixin）正在接受耐去势前列腺癌患者的临床评估，也有诸多其他类似的临床试验正在开展。鉴于迄今为止在炎症条件下使用趋化因子抑制剂获得的令人失望的结果，评估这些药物是否确实影响TAN浸润和/或激活状态将是重要的。
TME中中性粒细胞功能的重编程是一个挑战，已经提出了不同的方法，包括阻断TGFβ。类似地，在小鼠模型中靶向血管紧张素转换酶（ACE）和血管紧张素II 1型受体（AGTR1）、烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）或CXCR4可使中性粒细胞转变为抗肿瘤状态。与HIF1α在使中性粒细胞处于促肿瘤状态中的作用一致，高氧和缺氧逆转激活Pten诱导的子宫癌GEMM中中性粒细胞的抗肿瘤潜能。下面，我们重点讨论另外两种方法，即ADCC和髓系检查点，因为它们对中性粒细胞多样性和重编程有重要意义。
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抗体依赖性细胞毒性
中性粒细胞与单核细胞、巨噬细胞和NK细胞共享Fcγ受体（FcγRs）的表达，并通过ADCC183介导肿瘤细胞的清除。强调了在这个过程中对中性粒细胞的需求，中性粒细胞的耗尽降低了针对CD52（阿来单抗）和CD20（利妥昔单抗）的单克隆抗体治疗小鼠淋巴瘤的疗效。
人中性粒细胞也表达免疫球蛋白A（IgA）的高亲和力受体FcαRI（也称为CD89），它是ADCC的有效诱导物；与中性粒细胞诱导的FcγR介导的IgG调理靶细胞的ADCC相比，这种受体的表达导致IgA调理癌细胞的杀伤作用增强，在表达功能性人类FcαRI的转基因小鼠中，发现含有人类恒定区结构域的嵌合IgA抗CD20单抗比嵌合IgG抗CD20单抗更有效，并对淋巴瘤的发生具有保护作用。
有趣的是，IgA诱导的中性粒细胞介导的ADCC可以通过同时阻断CD47-信号调节蛋白-α（SIRPα）髓系检查点而增强。在人乳腺癌细胞、内皮细胞和中性粒细胞的三维胶原培养模型中，通过用FcαRI抗体治疗触发中性粒细胞FcαRI，促进LTB4的释放，LTB4是一种对中性粒细胞、IL-1β和TNF有效的化学引诱剂，进而通过内皮细胞产生CXCL8来增强中性粒细胞的募集。实际上，抗肿瘤IgA治疗维持了中性粒细胞的活化，并为中性粒细胞的招募创造了一个扩增环。因此，FcαRI介导的ADCC可能是一种有价值的以中性粒细胞为中心的治疗策略。
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骨髓检查点
髓系细胞的功能受许多负性调节因子（称为检查点）的控制，这些负性调节因子由中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表达。这些包括SIRPα、CD200受体（CD200R）、白细胞免疫球蛋白样受体B2（LILRB2）、成对免疫球蛋白样2型受体α（PILRα）和在中性粒细胞前体上表达的PD1和ACKR2。临床前证据表明，中性粒细胞有助于阻断CD47–SIRPα信号轴和LILRB2的药物的抗肿瘤活性。
SIRPα由中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞高度表达，并通过与靶细胞上呈现的“不要吃我”信号CD47的相互作用作为吞噬检查点。CD47在癌细胞上过度表达，使其对髓细胞产生耐药性。有趣的是，CD47–SIRPα检查点阻断增加了对癌细胞的清除，包括非霍奇金淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞和乳腺癌细胞，在以抗体为基础的治疗过程中，通过滑车下垂的过程增强了中性粒细胞在体外对曲妥珠单抗（抗人表皮受体2（HER2）单抗）调理的乳腺癌细胞的细胞毒活性。
此外，在表达人SIRPα的转基因小鼠中，当SIRPα单抗与抗肿瘤单抗（例如，抗CD20、抗HER2或抗EGFR单抗）结合时，SIRPα单抗的施用增加了巨噬细胞和中性粒细胞对肿瘤细胞的清除。重要的是，在这种情况下，完全的抗肿瘤活性是中性粒细胞依赖性的。在非霍奇金淋巴瘤患者中，抗CD47与抗CD20联合具有显著的抗肿瘤活性。然而，中性粒细胞在这种情况下以及更普遍地在阻断CD47–SIRPα下游适应性免疫的激活和定向中的意义仍有待确定。
LILRB2由髓细胞（包括中性粒细胞）表达，并作为细胞激活的负调节因子。LILRB2与经典和非经典HLA I类分子结合，并在其细胞质尾部含有免疫受体酪氨酸基抑制性受体基序（ITIMs）。其中一种配体HLA-G激活中性粒细胞上的LILRB2，抑制其吞噬活性和ROS的产生。在小鼠肺癌模型中，LILRB2阻断剂抑制免疫抑制中性粒细胞的浸润，并与抗PDL1联合使用显著促进抗肿瘤免疫。
ACKR2在造血前体细胞上表达，在NM上几乎不存在。ACKR2基因缺失导致具有抗肿瘤特性的中性粒细胞动员增加，其特征是ROS介导的对癌细胞的细胞毒活性。因此，尽管靶向ACKR2可能释放外周CC-趋化因子介导的淋巴细胞和单核细胞动员，但也可能释放中性粒细胞效应器功能。
从CD47–SIRPα信号轴功能的解剖中获得的证据表明，阻断髓系检查点释放适应性免疫反应，通过诱导包括CD8+细胞毒性T细胞在内的T细胞依赖性免疫。这表明靶向中性粒细胞检查点可能是癌症免疫治疗的一个新的前沿。然而，并非所有的髓系检查点都由中性粒细胞表达，事实上，一些负性调节因子（例如，共同淋巴管内皮细胞和血管内皮细胞受体1（CLEVER1））仅存在于巨噬细胞上。因此，当这些分子作为治疗靶点进入临床领域时，仔细评估中性粒细胞的数量、多样性以及作为抗肿瘤活性候选相关物的功能是很重要的。
展望
中性粒细胞在癌症中的存在及其意义一直被忽视。更严格的方法来量化它们在TME中的浸润，分析它们的多样性和可塑性，揭示了TAN免疫生物学的新见解。因此，TANs已经成为许多小鼠和人类肿瘤生态位的重要组成部分。目前关于中性粒细胞在癌症中的相反作用的观点是基于在小鼠中使用抗体的中性粒细胞耗竭研究或在TME或外周血中发现的中性粒细胞数量与癌症患者生存之间的相关分析。
然而，要真正确定中性粒细胞在不同肿瘤形成中的特殊作用，还需要更系统地利用基因靶向方法来抑制和消除致癌物诱导的肿瘤和GEMMs中选择的中性粒细胞功能，而不是在肿瘤细胞系移植小鼠模型中。在单细胞水平上反褶积TANs的多样性并将这种复杂的信息与中性粒细胞功能以及患者预后和治疗反应联系起来是该领域的重要挑战。
目前对神经营养细胞和相关骨髓源性抑制细胞（MDSC）群体多样性的命名方法可能会使该领域内外的研究人员感到困惑。然而，即使是不完善的术语也可以作为通信工具，因此是一个启发式的过程。因此，我们呼吁大家共同努力，按照先前针对ILCs、巨噬细胞、IL-1和其他细胞类型和分子进行的研究，为中性粒细胞的可塑性和多样性制定一个临时命名法。
处于不同分化和活化阶段的髓样细胞在全身水平和局部TME水平上都是免疫抑制的主要途径。剖析单核细胞与中性粒细胞分化途径在不同肿瘤背景下的相对重要性和多样性，并将其与一般免疫学相结合，可能为个性化治疗方法铺平道路。
TANs可能是抗肿瘤途径的一部分。中性粒细胞表达髓系检查点，目前已证明靶向负性调节因子CD47并释放髓系细胞功能可产生临床治疗益处。我们推测，利用中性粒细胞在有证据表明其保护作用的肿瘤类型（例如肉瘤和结直肠癌）和目前对免疫疗法有抵抗力的患者中的抗肿瘤潜能，可能是一种值得寻求的策略以补充已建立的以T细胞为中心的治疗设备。
—END—
撰文丨阿波没有罗
排版丨豨莶
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关键词
中性粒细胞
作用
因子
T细胞
激活