今年1月，英国和美国研究人员首次利用OxfordNanopore的纳米孔测序仪，对人类基因组进行了组装。这项成果发表在《Nature Biotechnology》上，代表纳米孔测序技术的一个里程碑事件，也标志着基因测序迈出了一大步。
谈起基因测序，相信大家脑海里都会浮现一些画面，或是精密的仪器，又或是微观的DNA/RNA序列。近年来，基因测序的发展可谓炙手可热，无论是在研究还是应用方面都有长足的发展。今天我们将为大家简单介绍近年来发展迅速的纳米孔（Nanopore）测序技术，其便携的测序设备或许正推动着我们步入人人都可以测序的时代。
文/廖翼飞
编/HLR，Stephen 王，田雨
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基因测序技术简介
如今，在生命科学研究和疾病治疗等众多领域，DNA 测序技术都扮演着不可忽略的角色。
一般，我们将至今为止的基因测序技术划分为四代：
第一代Sanger测序，测序精度高；第二代以Illumina的HiSeq/MiSeq/Genome Analyser 系统为代表，测序通量明显提高；第三代以Pacific Biosciences 公司的 RS 系统为代表，以单分子实时测序为主要特点；第四代则是纳米孔测序技术，通过物理方法直接对 DNA 序列进行读取，并且具备高读长、低成本和设备轻便等特点[1]。
▲ 图一：四代测序技术的比较
（图片来源：前瞻产业研究院[2]）
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纳米孔测序技术的研发历史及基本原理
相较于其他的测序技术，纳米孔测序的发展可谓长路漫漫。早在上世纪末，美国哈佛大学的Daniel Branton和加州大学的David Deamer等研究人员，在美国国家科学院院刊（PNAS）杂志上首次发表文章指出，可以用膜通道检测多核苷酸序列。然而其后续的发展却遇到了各种各样的问题，也渐渐消失在人们的视野。
随着二十一世纪的到来，越来越多的研究者致力于解决这些问题，让纳米孔测序逐渐成为现实。而且，大家也更致力于开发更轻便的测序仪器和降低测序成本，各大测序行业巨头纷纷投资测序新技术。
2012年，Roche公司先后投资了纳米孔测序公司Genia Technologies公司和Stratos Genomics公司。而illumina公司也早就盯上了纳米孔测序技术，于2009年投资牛津纳米孔（Oxford Nanopore）公司。
Oxford Nanopore的发展历程
  • 2005年，Bayley、Gordon Sanghera和Spike Wilcocks创立Oxford Nanopore公司，并从2007年开始研发以蛋白为基础的纳米孔测序系统。
  • 2009年Oxford Nanopore收到illumina公司注资，助其实现商业化。
  • 2012年，Oxford Nanopore在AGBT(Advances in Genome Biology and Technology ，基因组生物学技术进展年会)上发布了自己的纳米孔系统，轰动一时。
  • 2013年10月，Oxford Nanopore回购了illumina公司持有的13.5%股份，从而能够更加独立运营。
  • 2016年12月，Oxford Nanopore的MinION平台首次完成了人类基因组测序。
  • 2017年7月，Oxford Nanopore上榜了2017年全球50大最聪明公司；下半年，公司正式进入中国市场[3]。
  • 今年5月，Oxford Nanopore宣布在最新一轮融资中获得了1亿英镑（约1.39亿美元）的投资，并表示此次募得资金将用于新生产基地建设、市场拓展、以及新产品研发[4]。
纳米孔测序技术的基本原理
▲ 图二：纳米孔测序基本原理
（图片来源：牛津纳米孔公司）
纳米孔测序技术的原理非常直接明了，在A，T，G，C四种不同的脱氧核苷酸通过纳米孔进入的时候，其所引起的电流变化也是不一样的，随即可通过电流的变化来检测DNA序列（图二）。首先双链DNA解开成单链，然后DNA单链分子通过一个纳米孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子。当DNA单链分子通过纳米孔时，不同的碱基带来不同的电流变化，进而根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到DNA碱基序列。

▲ 纳米孔DNA测序原理简介
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纳米孔测序技术的优劣势
Oxford Nanopore这两年发展可谓突飞猛进，其产品也在不断更新和升级。主要产品涵盖了便携的MinION和SmidgION，以及高通量的GridION和PromethION（图三）。
▲ 图三：牛津纳米孔公司的主要产品
（图片来源：牛津纳米孔公司）
相较于其他的测序技术，纳米孔测序最突出的优势在于其便携性和读长。除此之外，其测序文库的制备更加快速、简捷，而其公司研发的配套软件MinKNOW能够实现实时数据读取和数据分析。
虽然纳米孔测序技术优势明显，也有“致命”缺陷。目前MinION测序仪的测序准确率仅在92%左右，这样的准确率对于初步的筛查或许足够，但是对于临床检查却远远不够，这也将是此技术在未来需要攻克的难题。

▲ 纳米孔测序 - MinION简介
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纳米孔测序技术的应用及其发展
如图四所示，纳米孔测序技术在多个方面都有应用前景。除了在传统的研究和检测中的应用，纳米孔测序技术最吸引人的应用莫过于即时病原检测以及太空应用。
▲ 图四：纳米孔测序的应用
（图片来源：牛津纳米孔公司）
一般的测序方法可以在稳定环境下进行病原的检测，而MinION凭借其方便、简单、快速等特定为实时检测病原提供了可能性。2015年西非爆发埃博拉病毒时，MinION测序方法在病毒检测过程中起到的重要作用。省去大量样品搜集和寄送的时间，MinION能够在实地进行测序并且反馈，从而大大节省了时间。随着实地使用MinION检测的经验积累，相信未来MinION在疾病防控中能够发挥更大的威力。
长久以来，科学家们一直致力于在太空中寻找细菌和病毒的踪迹，而大部分研究都是将样品带回地球进行测序鉴定。2016年，美国国家航空和宇宙航行局（NASA）与Oxford Nanopore展开合作，NASA宇航员Kate Rubins带着MinION进入了国际空间站，对带到国际空间站的DNA样本在太空中进行检测，同时地面团队与之同步测序，试验结果表明二者测序结果相同。这也意味着，未来宇航员可以直接使用MinION在太空开展实验，或许将大大推动科学家对太空生物体的探索。

▲ 纳米孔测序 - GridION X5简介
自2017年下半年，Oxford Nanopore正式进入中国市场后，目前中国市场中已有几家公司购买其GridIONX5测序仪，包括药明明码（WuXi NextCODE）公司，先声药业旗下的先声诊断(Simcere Diagnostics)，永诺生物(Forevergen)旗下的CookGene[3]。而武汉未来组生物科技有限公司（NextOmics）更于2018年1月17日通过Oxford Nanopore的官方认证，获得Nanopore DNA测序认证服务供应商资质，这也是首家获得官方认证的中国公司[5]。相信纳米孔测序技术的中国市场仍有巨大发展潜力。
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结语
近年来，纳米孔测序技术凭借超长读长、便携快速等特点，逐步赢得大家的关注和市场地位。随着高通量的GridION和PromethION的推出，也能够满足大规模的研究和应用需求。如果能够进一步提高测序的准确性，相信其研究和应用价值会更上一层楼。除了便携的MinION之外，Oxford Nanopore正在研发更加小巧的SmidgION，可以连接到智能手机上或者其他低功率仪器上，用于检测DNA、RNA或蛋白质，或许人人都可以测序的时代已经离我们不远。
参考文献：
1.第四代测序：固态纳米孔技术的现状与挑战. Available from: http://news.bioon.com/article/6655902.html.
2.基因测序仪企业向中下游拓展三代四代测序仪是投资热点. Available from: https://www.qianzhan.com/analyst/detail/220/170522-c12695a2.html.
3.Illumina, PacBio，Nanopore，三个关键词带你看清高通量测序行业发展. Available from: https://www.360zhyx.com/home-research-index-rid-69109.shtml.
4.牛津纳米孔科技有限公司宣布获得来自全球知名投资机构1亿英镑（约1.39亿美元）的投资. Available from: https://nanoporetech.com/cn/news/oxford-nanopore-announces-ps100-million-140m-fundraising-global-investors-cn.
5.中国首家！未来组通过Nanopore官方测序服务认证.Available from: https://weibo.com/ttarticle/p/show?id=2309404197594510297574.
本期作者：廖翼飞
本科毕业于中国农业大学动物医学专业，现在美国德州农工大学兽医病理系攻读博士学位，任美柏医健研究员。
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