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风波之下发布的顶刊文章
“课题组成员集体患癌”和“学阀”风波一直未平...，不得不说，苏士成/宋尔卫院士团队，内心强大，科研方面还真的很高产！12月5日刚发Cell，13日苏士成团队与宋尔卫院士合作再发Nature！
2023年12月13日，中山大学附属孙逸仙纪念医院宋尔卫院士、苏士成教授作为共同通讯作者，在国际顶尖学术期刊 Nature 上发表了题为：Tumour circular RNAs elicit anti-tumour immunity by encoding cryptic peptides 的研究论文。
该研究发现了一种肿瘤细胞特异性环状RNA——circFAM53B，其通过非经典翻译产生的隐性抗原肽，能够有效驱动抗肿瘤免疫，这表明利用肿瘤特异性环状RNA进行疫苗接种，可能是一种针对恶性肿瘤的免疫治疗策略。
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研究背景
在癌症免疫治疗中，特异性由肿瘤细胞表达的新抗原（TSAs）能够通过细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）诱导适应性抗肿瘤免疫。然而，传统的新抗原发现主要集中在编码蛋白质的突变中，对于低突变负荷的癌症，这一方法揭示的抗原数量有限。
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研究发现
本研究发现，肿瘤特异性循环RNA（circRNA）也可以非典型地被翻译为隐藏性抗原肽，这些肽能够与人类白细胞抗原（HLA）分子结合并激发T细胞免疫。通过组合质谱、HLA类I肽组学和核糖体测序技术分析人乳腺癌样本，科研团队鉴定出一种由肿瘤特定circRNA——circFAM53B编码的具有高免疫原性的HLA-I结合肽。
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临床意义
circFAM53B及其编码的肽在乳腺癌和黑色素瘤患者中的表达与更好的生存率和CD8+ T细胞的浸润量相关。研究揭示了circRNA作为新型抗原源在抗肿瘤免疫中的重要性，建议利用特定肿瘤circRNA作为疫苗或免疫治疗策略。
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实验策略
利用HLA-I免疫沉淀和质谱（MS）分析从人乳腺癌样本中筛选潜在的TSAs。
利用核糖体测序（Ribo-seq）识别肿瘤特定的circRNA并探讨其免疫功能。
检测circFAM53B编码的隐藏肽与HLA-I的结合亲和力以及免疫原性。
评估circFAM53B及其编码肽在乳腺癌和黑色素瘤患者中的表达与临床预后的相关性。
在小鼠模型中验证携带这些肽的疫苗可以抑制肿瘤进展。
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主要结论
circFAM53B编码的隐藏肽能在体外和体内激活CD4+和CD8+ T细胞。
circFAM53B编码肽的疫苗能显著抑制小鼠乳腺癌和黑色素瘤肿瘤生长。
circFAM53B和其编码肽的表达与乳腺癌和黑色素瘤患者的更好预后相关。
未来方向：这项研究揭示了一种新的癌症免疫治疗靶点——肿瘤特异性circRNAs，为发展新的疫苗和免疫疗法提供了可能性。未来研究需要探索更多肿瘤特异性circRNAs及其免疫原性，并开发相关的临床策略以提高癌症治疗的效果。
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数据解读
图 1: circFAM53B作为肿瘤特异性抗原（TSA）候选
a. 研究流程:
该流程图展示了科研团队如何从人类乳腺癌样本中筛选肿瘤特定抗原的方法。包括HLA-I免疫沉淀、质谱分析、核糖体测序(Ribo-seq)、RNA测序和全外显子测序。
b. circRNA鉴定:
通过Ribo-seq分析和rRNA-depleted RNA-seq鉴定表示，circFAM53B在多个乳腺癌样本中的肿瘤排他性表达，而在相邻正常样本中检测不到。
c. circFAM53B RNA与多聚体关联:
肿瘤样本中多柔体(multisome)关联的肿瘤特定circFAM53B的表达显著高于正常组织。
d. 肽段鉴定:
质谱分析显示，从HLA-I复合物中提取的肽段circFAM53B(192–200) (ALFRLTNRA) 和 circFAM53B(210–218) (RTAHYGTGR) 来自乳腺癌患者肿瘤样本。
e. circFAM53B在乳腺癌中的表达:
原位杂交(ISH)显示，癌变组织中有大量的circFAM53B表达，而在正常乳腺组织中检测不到。同时，不同的乳腺癌分子亚型被展示出来以验证表达模式。
图 2: circFAM53B诱发抗肿瘤免疫
a. 免疫点斑分析(ELISpot):
显示经过circFAM53B刺激的树突状细胞(DCs)有效诱导特异性T细胞产生干扰素-γ(IFNγ)。
>b. 细胞因子产生分析:
流式细胞仪数据显示，与刺激后的DCs共培养的特异性的CD4+和CD8+ T细胞产生增加的IFNγ，验证了特异性T细胞应答。
c. 流式细胞死亡分析:
实验证明经circFAM53B刺激的DC激活的CTL细胞对肿瘤细胞表现出杀伤活性。
d. CTL细胞特异性杀灭能力:
图中展示了敲低circFAM53B的肿瘤细胞不会被特异性CTL细胞所杀死，表明这一效果需要circFAM53B。
e. 动物肿瘤体积监测:
结果显示，与circFAM53B-转录的DCs和T细胞共同输注的小鼠在植入人乳腺癌异种移植瘤模型后，肿瘤生长明显减缓。
f, g. 肿瘤中CTL的渗透和活化:
采用IFNγ ELISpot和流式细胞仪分析，证实了经过circFAM53B治疗的肿瘤组织中CTL的浸渍和激活。
综合图1和图2的数据，研究者们发现肿瘤特异性的circRNA即circFAM53B可编码肽段，并激活特异性的CD4+和CD8+ T细胞，诱导免疫反应并对异种移植的人乳腺癌肿瘤产生杀伤作用。这项发现不仅提供了关于肿瘤免疫治疗新策略的重要线索，也为临床上利用肿瘤特异性circRNA作为免疫治疗方法提供了理论基础。
图 3: circFAM53B编码的抗原性肽
a. circFAM53B编码能力:
示意图详细展示了circFAM53B与其线性mRNA（linFAM53B）的编码差异。这个环状RNA编码的219个氨基酸肽链与其线性形式的mRNA翻译的蛋白相比，在肽链结合位点处有一个独特的39个氨基酸序列。
b. T细胞刺激:
流式细胞仪分析显示，与由circFAM53B(181–219)脉冲的DC共培养的CD8+ T细胞，与由肿瘤抗原或自身T细胞刺激时，能产生更多的炎症因子，表明其抗原性和诱导特异性T细胞应答的能力。
c. HLA稳定性:
HLA稳定性实验显示，circFAM53B(192–200)特异地稳定地结合HLA-A2。
d. 反应动力学:
使用生物层干涉测量展示了circFAM53B(192–200)与HLA-A2之间有较强的互作力。
e. 生成特异性CTL:
流式细胞仪数据揭示了通过circFAM53B(192–200)脉冲DC激活的CTLs表现出特异性膜表面肽聚合物标记，进一步证实了特异性免疫应答。
f. 免疫治疗效果:
PDX模型中，circFAM53B(181–219)脉冲的DCs转移后，导致肿瘤生长显著抑制。
g. 浸润性T细胞:
免疫荧光分析显示，接受circFAM53B(181–219)-脉冲的DCs之后，PDX肿瘤中浸润的T细胞产生更多的IFNγ、穿孔素和颗粒蛋白酶B。
图 4: circFAM53B与乳腺癌的预后关联
a. RNA和蛋白表达:
ISH和IHC结果显示，无论是在RNA还是蛋白水平上，乳腺癌组织样本中都有较高水平的circFAM53B表达，这在正常组织中不被检测到。
b. 表达水平关联:
circFAM53B RNA水平与蛋白表达水平表现出显著的正相关性，这意味着更高的circFAM53B水平与在肿瘤中更强的免疫反应相关联。
c. 肿瘤浸润的CTLs:
免疫荧光技术检测肿瘤细胞中的circFAM53B(192–200)-pentamer+ CD8+ T细胞，显示乳腺癌患者的肿瘤有更多的特异性CTL浸润。
d. circFAM53B表达与CTL浸润:
研究发现乳腺癌中circFAM53B RNA表达水平与肿瘤浸润的circFAM53B(192–200)-pentamer+ CTLs数量有显著的正相关关系。
e. 生存分析 - RNA:
根据circFAM53B RNA水平，呈现了乳腺癌患者的无病生存分析，显示高表达组与较佳的预后相关。
f. 生存分析 - 蛋白:
circFAM53B-219蛋白水平通过IHC得分（IRS）进行无病生存率分析，显示高表达组与较佳的预后相关。
综合图3和图4的信息，研究表明circFAM53B不仅编码具有抗原性的肽段，而且这些肽段的表达水平与乳腺癌患者的生存率密切相关，提示它们在肿瘤免疫预后和潜在治疗中的重要性。
图 5: circRNAs在小鼠中引发免疫反应
a. 免疫激活实验流程
描述了小鼠被用来测试circFam53b和circGigyf2编码的肽段或相应线性形式的RNA免疫原性的实验方案。
b. IFNγ释放测定
展示了图表和定量结果，证明在免疫实验中，针对circFam53b和circGigyf2免疫的小鼠的脾细胞在IFNγ的ELISpot分析中显示出显著的斑点数量增加，表明发生了免疫激活。
c. 肿瘤细胞杀伤能力分析
流式细胞仪的数据显示，经过免疫的小鼠脾细胞能够诱导目标肿瘤细胞凋亡（PI染色阳性细胞的百分比增加）。
d. 流式细胞分析
展示了对用circFam53b和circGigyf2免疫的小鼠的脾细胞进行IFNγ、IL-2和TNF染色之后的流式细胞结果，显示出一定程度的细胞因子产生增加。
e. circFam53b特异性CTL检测
通过流式细胞仪绘制的图和定量结果显示，用circFam53b免疫的小鼠脾细胞在circFam53b(187–196)-pentamer平面图上显示出显著的CD8+ T细胞阳性染色，表明肽段特异性CTL已被激活和扩增。
f. 刺激性pentamer阳性CD8+ T细胞检测
使用flow cytometry技术，确认在用circFam53b RNA免疫的小鼠中，能够检测到针对circFam53b(187–196)片段的肽多聚体阳性CD8+ T细胞。
g. circGigyf2特异性CTL检测
同样，使用flow cytometry技术展示了用circGigyf2 RNA免疫的小鼠中，特异性对circGigyf2(95–103)片段的肽多聚体阳性CD8+ T细胞的存在。
图 6: 疫苗抑制肿瘤进展
a. 肿瘤抑制实验流程
描述了小鼠肿瘤模型中验证circRNA 编码肽段疫苗疗效的实验设计。
b. 载体成像（BLI）检测肿瘤生长和肺转移
提供了BLI图像和BLI信号定量分析，表明经过circRNA编码肽段疫苗免疫的肿瘤小鼠显示肿瘤生长减缓和肺转移数量减少。
c. 组织病理学分析
展示了经过circRNA编码肽段疫苗免疫的肿瘤小鼠肺组织病理切片，通过染色显示转移结节减少。
d. circFam53b特异性CTL在肿瘤和脾脏中的浸润
通过flow cytometry技术，显示用circFam53b免疫的小鼠在肿瘤组织和脾脏中有增加的特异性CTL浸润。
e. circRNAs免疫实验流程
显示了在小鼠肿瘤模型中测试circRNAs和相应线性形式的RNA的疫苗疗效实验设计。
f. 载体成像（BLI）检测肿瘤生长和肺转移
图片和信号定量分析显示，经过circRNA RNA免疫的肿瘤小鼠出现肿瘤生长减缓和肺转移数量减少。
g. 特异性T细胞在脾脏、肿瘤和肺转移中的存在
flow cytometry技术显示，用circRNA RNA免疫的小鼠在肿瘤组织和脾脏中，以及已转移至肺部的位置，都有增加的特异性CTL浸润。
这两图展示了使用编码肽段的疫苗和循环RNA RNA免疫策略在小鼠肿瘤模型中有效激活特异性免疫反应并抑制肿瘤增长的成效。这些发现支持了将这些circRNAs作为新型抗肿瘤免疫治疗的潜力。
此文献归纳了circFAM53B不仅在肿瘤细胞中非典型翻译形成抗原肽，而且这些抗原肽的表达与乳腺癌患者更好的免疫浸润和预后密切相关，这为癌症研究和治疗提供了全新的视角。
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讨论部分总结
在讨论部分，研究者们总结了他们的主要发现并对其意义进行了深入探讨，同时也指出了研究的一些局限性和未来研究的方向。
主要发现的意义:
本研究提供了证据表明，自然形成的circRNAs能通过非标准翻译机制生成隐藏的抗原性肽段（cryptic antigenic peptides），从而产生高度免疫原性。
肿瘤特异性circRNAs与恶性肿瘤中的免疫反应密切相关，这些circRNA经过非标准翻译而形成的肽段可以从肿瘤细胞中产生并进一步激活T细胞。
抗原呈递过程中的肽段有强烈的亲和力与HLA-I和HLA-II分子结合，暗示着它们可以在临床上作为疫苗的组成部分，增强抗肿瘤免疫反应。
肿瘤免疫环境中免疫反应的阻碍:
讨论了肿瘤微环境中的免疫抑制因素，这些因素可能阻碍树突形成细胞对免疫原的捕获、成熟、抗原交叉呈递和迁至淋巴结的过程。
提出利用肿瘤特异性circRNAs或其编码的肽段作为疫苗策略可能有助于克服这些免疫抑制因素。
未来的研究方向:
研究者们强调了进一步评估以肿瘤特异性circRNAs作为单独或与其他抗癌免疫治疗相结合的疗法，并找出最优化临床疗效的策略。
指出需要更全面的研究来理解circRNAs在人与不同物种中免疫反应中的共有性和特异性，这可能会导致发现新的肽段作为抗原的种类和提高治疗效果。
综上，讨论部分概括了通过肿瘤特异性circRNA作为疫苗的新策略在癌症治疗中的巨大潜力，并为肿瘤免疫治疗的未来发展方向提供了重要见解。
—END—
撰文丨解螺旋
排版丨豨莶、吱吱
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关键词
T细胞
蛋白
肿瘤细胞
疫苗
激活