最热影像组学+单细胞多组学，轻松上10分！

雪球大大说君君必须来个影像组学加单细胞多组学文章的分享，确实好久没交作业喽，赶紧看文献，嘻嘻，呜呜。
感谢雪球老师push学习，我赶紧来分享一篇关于影像组加单细胞多组学的文章，跟小伙伴一起学习。
该文献题为：利用影像基因组学平台解读透明细胞肾细胞癌的瘤内分子异质性
作者Udayakumar D.Engineering Leader |简介：美国，在linkin软件上可以找到他的简历信息：
期刊信息
这篇文章于2021年9月发表于Clinical Cancer Research，期刊信息如下：
文章思路剖析
首先我们来看文章的摘要框架：
然后我们用大白话来梳理一下文章思路：
肿瘤内的异质性是相同治疗效果不同的一个重要因素，也就是说肿瘤异质性是肾透明细胞癌耐药的一个重要因素。然而呢，大多数评估肿瘤内异质性的方法，比如病理取材切片，都是局部，不少整体，不够全面，而且病理切片也就是某个平面的分析，是一种限制，动态对比增强磁共振成像呢，就是可以无创，而且立体的评估，整个肿瘤在自然状态中的空间景观。结合实际，也就是我们做病理的时候，总是取局部的一块儿，不管是做测序，还是做病理呀，免疫组化等等，都是取一一小块儿，但是动态增强磁共振能看到整个肿瘤的立体形状，而且是无创，但是病理是金标准，所以先找无创的动态增强磁共振特征与测序及病理marker的联系。然后呢，为了评估这个动态增强磁共振的潜力呢，所以这篇文章就开发了一种就是垂直整合的影像基因组学共定位的方法。也就是这一个方法，它将确定区域的单细胞测序与影像组学特征相结合，来探测探测这个不同部位的肿瘤的分子异质性。所以呢，他就报告了一项49例，在肾切除前接受了动态增强MR检查的肾透明细胞癌的患者进行了前瞻性的研究。对手术的标本进行切片，与动态增强磁共振的采集平面相匹配。来自多个区域的肿瘤组织的测序数据。提取了80个样本匹配动态增强MR在肿瘤空间位置定位的MR增强百分比（这是动态对比增强磁共振的一个参数）。然后独立的评估，发现39例接受一线抗血管生成药或免疫检查点抑制剂治疗后的临床试用性结果显示：在就是动态增强MR识别出了与血管深层炎症相关的肿瘤特征，这些特征在肿瘤内部和肿瘤之间是存在异质性的。可能有助于抗血管生成药和免疫治疗的疗效的预判。这个垂直整合分析显示血管生成和炎症在同一肿瘤中经常是共存的，存在空间的相关性。此外，对比增强MR能预测肾透明细胞癌患者对抗血管生成治疗反应。也就是说。他能够在MR的序列上看到哪肿瘤的哪一块区域对药物更敏感。所以。文章认为这种方法对肿瘤的治疗决策有更重要的意义。简要总结如下图：
单细胞多组学和影像组联合分析的目的：在增强磁共振影像上通过无创的方法对肾细胞癌内的分子异质性进行检测，利用单细胞提取的信息做相关，再用单细胞测序及病理免疫组化marker来验证对AA（抗血管生成的药物）及免疫治疗的敏感性，就不仅获得了肿瘤内异质性，而且获得了具体的空间位置的异质性。
联合的临床作用：因为磁共振是无创的，容易获得，且容易被患者接受，如果这个预测模型成立，就可以在一定程度上对失去手术机会或不愿手术的患者，或手术复发后的患者，根据功能影像磁共振，挖掘信息，为此类患者提供更多抗血管生成和免疫等治疗指导。
联合的必要性：比如现在有了单细胞，为何还要空转呢，因为空转提供了空间位置信息，所以在这里，联合影像组学，不仅可以了解肾细胞癌的不同部位的细胞异质性对药物敏感的程度，还可以准确定位，所以，联合的必要性，就类似于从单细胞到空转的跨越哦。
文章思路剖析
好滴，了解背景后，我们来看基本概念及算法：
  • 半监督的类别识别和分配(SCINA)算法：SCINA是一种基于单细胞RNA-Seq (scRNA-seq)和Cytof/FACS（质谱流式细胞/流式细胞荧光分选技术）数据库的自动细胞类型检测和分配算法。原文链接：https://www.mdpi.com/2073-4425/10/7/531/ht
  • mSCINA能够识别细胞类型并分配到由scRNA-Seq or mCytof/FACS 数据库提前定义好的细胞池中，这些细胞具有预先的注释或特征。(https://github.com/jcao89757/SCINA；
  • 单细胞转录组测序(Single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)：是在单个细胞水平对mRNA进行高通量测序的一项新技术，原理是将分离的单个细胞中微量的mRNA通过高效扩增后再进行高通量测序。
  • 单细胞转录组测序优势：能够有效解决组织样本细胞异质性以及常规RNA-seq易被掩盖的细胞群内的转录组异质性难题，有助于发现新的稀有细胞类型，并深入了解细胞生长过程中的表达调控机制。
  • 质谱流式细胞技术（Mass Cytometry）：是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力，是流式细胞技术一个新的发展方向。
文中应用的MR的序列及方法
从DCE-MRI（动态对比增强MR）数据集中，在4个阶段提取ROI即：感兴趣区域(regionof interest, ROI，就是fig1中用不同颜色圈出来的区域哦)肿瘤增强%：
小tips上线：
影像组学研究为何大部分在肿瘤开展呢？因为肿瘤有明确的瘤体，我们可以在影像上把肿瘤或者部分肿瘤当做我们感兴趣的区域，给勾画出来，在本文中是把一个大的肿瘤分割成小的肿瘤ROI，也叫tROIka。
(i) 注射造影剂前（造影剂：GBCA；序列简称：PRE）；
(ii)在造影剂（造影剂（又称对比剂，contrast media）是为增强影像观察效果而注入（或服用）到人体组织或器官的化学制品。这些制品的密度高于或低于周围组织，形成的对比用某些器械显示图像，就类似于让我们观察的目标器官更明显的一种化合物，影像科日常使用的材料哦）位于皮层肾毛细血管网络内大约30秒（皮质髓系期、简称CM）；
(iii)早期肾造影剂通过后大约15秒(简称：eNG) ；
(iv)CM约55秒后， 成为增强中期(简称：NG)，造影剂在肾实质中达到平衡。
增强%（%）：定义为100%x（SIpost-SIpre)/SIpre，其中SIpost是每个对比后阶段(CM、eNG和NG)的ROI内的平均信号强度，SIpre是ROI内的平均对比前信号强度。
因为Ktrans、Kep和Haralick纹理特征没有提供额外的价值，其余的分析集中在增强%上。
全文精析
Fig1：基于DCE-MRI的组织采购和转录组分析的影像转录组学平台示意图。文章共纳入79例患者，取144例tROI。
患者接受MRI及DCE-MRI检查，进行血管分布测定。黄色圈整个肿瘤。其他彩色圈代表DCE-MRI上高和低增强区域对应的tROI。手术切除后，对每个肿瘤进行解剖共定位并切片以匹配成像平面。
收集来自肿瘤标本中相同位置和与tROI近似大小的组织样本作为目标样本。这些样本被快速冷冻，并进一步处理RNA提取、分析。然后将分析的结果与MRI的影像组学结果相关联。IHC从每个目标组织样本中切片，用于评估血管和免疫特征。
小结：将ROI与RNA测序的样本共定位，提高相关性准确度！
Fig 2：剖析 透明细胞性肾细胞癌 肿瘤样本中DCE-MRI与血管生成/免疫反应之间的关系。
A，采用无监督多变量方法分析27,051个基因，生成的主成分分析(PCA)图。橙色点代表透明细胞性肾细胞癌样本，蓝色点代表肾样本
B，所有分析基因与增强%之间的Spearman排序的相关系数(ρ)的瀑布图。ρ值是通过肿瘤区域MRI的增强%与肿瘤样本RNA测序检测到的27051个基因的表达水平相关性计算出来的 。
C，通过过表达基因本体分析获得的前5个阳性和前5个阴性富集基因过程的半监督层次聚类热图。关键基因的正相关（珊瑚红竖条)和负相关 (蓝色竖条）的标准化RNA表达值显示。
每个样品的 eNG增强% 在顶部用一个绿色的水平条表示。绿色的比例条表示%增强值，蓝色到红色的比例条表示按比例的基因表达值。
小结：做出了关键基因表达及与DCE-MRI特征相关的热图。
Fig3:DCE-MRI特征（增强%）作为一种预测标记物，用于检测不同的治疗反应的肿瘤区域的的分子特征
A、显示在SCINA算法的聚类组中识别的单细胞转录组特征表达水平的热图。使用每个基因的样本平均值对样本进行聚类，并计算每个特征的平均z分数，得到每个SCINA聚类每个类别一个z分数。所有肿瘤样本的血管生成密度(B)和t效应/增殖(C)Z分数的直方图。
D、Box图，比较血管生成和非血管生成样本组在DCE-MRI的eNG期序列和NG期序列增强%。
E、比较t效应/增殖组和其他基因组之间eNG期和NG期增强%的Box图。
F、Box图比较仅有血管生成或t细胞效应/增殖特征富集的样本组之间的eNG（顶部）和NG（底部）阶段的增强%。
总结：找到了用于检测不同的治疗反应的肿瘤区域的的分子特征的影像组学序列。
背景知识补充：
低氧诱导因子(HIF) ：缺氧诱导因子HIF-1和HIF-2是介导细胞缺氧反应的异二聚体转录因子。HIF调节的靶基因
促红细胞生成素(EPO)编码基因：血管内皮生长因子(VEGF)编码基因 、内皮素一1(ET一1) 、血小板源性生长因子(PDGF）等。HIF的生物学效应
这些基因表达后参与，如红细胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代谢，细胞存活、凋亡和活动以及药物抵抗等生物学效应，以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定，以适应缺氧。
Fig4：MRI对比增强%可预测HIF靶基因的表达。
eNG期序列增强%与HIF2(A)和HIF1(C)靶基因表达水平之间的排序相关系数值和相应的错误发现率(FDR)的火山图。
把HIF2和HIF1的靶基因FDR<0.05标洋红色、FDR<0.1标棕色
HIF2(B)和HIF1(D)对FDR<0.05的靶基因的±调节，及与eNG的关系。
总结：探索预测药物敏感性相关机制
Fig5：DCE-MRI增强%预测eTME基因标记的富集
A，相应ssGSEA富集评分的eTME基因簇的Box图， 免疫细胞类型在组织标本中有统计学意义的富集(P < 0.05) 对应的低强化肿瘤区域用蓝色表示，在DCE高强化区域获得的组织样本中富集的为用红色表示 高强化区和低强化区对应的肿瘤标本富集细胞类型的P值有显著差异，MRI结果如下:(i)巨噬细胞(p¼0.003); (ii)周期细胞(P = 0.003); (iii)内皮细胞(p¼0.02); (iv)嗜酸性粒细胞(P = 0.02); (v)肥大细胞(p¼0.02); 和(vi) B细胞(P < 0.01)。
B，根据eNG增强%的中位值，将样本高低分组，可以看出不同分组的肿瘤内皮细胞的量，P <0.05。
C，同样，对顶部四分位数增强(n¼19个样本)和底部四分位数增强(n¼20个样本)值的样本进行IHC评估eTME细胞类型标记物的蛋白表达水平差异，如图所示。
D，Top，病理医生对5张具有代表性的高增强和低增强肿瘤样本的IHC切片中CD31和CD163表达水平的评估。由一阶统计数据得到的患者数量和相应的eNG增强值如图所示。下图为每组一个样本中CD31和CD163表达的代表性IHC图像所示。高增强肿瘤样本为黄色，低增强肿瘤样本为蓝色。
总结：临床病理组织样本验证不同影像组学特征下蛋白marker的差异
Fig6：MRI增强识别转移性透明细胞性肾细胞癌患者对抗血管生成(AA)治疗反应更好的表型。
A，不同亚组Kaplan（Meier图(HE)和低增强(LE)）；HEAA代表AA治疗的高%面积增强病变（蓝色）；LEAA代表AA治疗的低%面积增强病变（绿色）；HEIO代表IO治疗的高%面积增强病变（红色）；LEIO代表IO治疗的低%面积增强病变（棕色）。各亚组病变总数中进展的病变数量（定义为>比基线增加20%）为：(i)LEIO：1/8（13%）；(ii)HEIO：5/9（55%）；(iii)LETKI：2/12（15%）；(iv)HETKI：0/10（0%）。
B，部分反应概率的二次分析的Kaplan-Meier图。在每个亚组的总病变数中，部分反应的病变数量（定义为较基线至少减少10%）为(i)LEIO：2/8（25%）；(ii)HEIO：2/9（2/9（22%）；(iii)LETKI：5/12；(iv)HETKI：6/10（60%）。C，3例转移性透明细胞性肾细胞癌患者的代表性图像。转移性病变用彩色的感兴趣区域(ROI)来描述。顶部，患者M008在基线时在腹膜后有3个转移性沉积物。病变1和病变3被分类为LE，而病变2在基线时被分类为HE。患者接受pazopanibAA治疗，治疗开始3个月后，增强CT显示1和3号病变的大小（疾病进展）明显增加，但病变2的大小轻微减少，代表部分缓解。左图，患者M009在胰腺有3个转移灶，其中2例作为靶病灶(红色、黄色ROI)。在基线时，最大的肿块(黄色ROI)为LE，而较小的胰腺转移灶(红色ROI)为HE。患者接受了pazopanib的AA治疗，治疗开始3个月后，非对比MRI显示最大肿块大小不变(黄色ROI，病情稳定)，较小病变大小减小(红色ROI，部分缓解)。第三个病变在基线时表现出强烈的增强(白色ROI)，在3个月时也表现出部分反应。右，患者M001在基线时有两个腹膜后淋巴结被归类为LE。患者接受伊匹单抗/尼鲁单抗IO治疗，随访2个月的随访增强CT显示两个淋巴结大小缩小（部分反应），仍为低增强。
总结：MR影像组学特征可预测转移性透明细胞性肾细胞癌患者对抗血管生成(AA)治疗反应
全文总结
这篇文章利用影像基因组学将增强MR的特征与测序数据匹配融合，探索肿瘤内异质性及对抗血管药物的反应，所用的技术和思路都比较新，但是算法不难，值得借鉴。
这个文献中基于单细胞的注释包如下：https://github.com/jcao89757/SCINA；
install.packages(‘SCINA’)；library(‘SCINA‘)；Installfrom GitHub；library('devtools')install_github('jcao89757/SCINA)；library('SCINA’)
绘制简单的思路图，大家如果有相关数据可以模仿思路发文哦
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撰文丨君   君
排版丨四金兄
主编丨小雪球
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