转肽酶SortaseA（SrtA）介导的蛋白片段的连接反应（SortaseA-mediated ligation, SML）是一种有效的蛋白质半合成方法，能够实现在大尺寸蛋白中引入特定的修饰基团，广泛应用于制备携带翻译后修饰以及功能性分子（如荧光基团、活性探针等）标记的蛋白样品。传统的SML方法以含有LPxTG motif的多肽或蛋白为底物，SrtA切割掉LPxTG motif末端的Glycine，进而与N末端为Glycine的多肽或蛋白片段连接（Scheme 1a）。该方法存在反应可逆和严格依赖LPxTG序列等局限，严重限制了底物转化率及应用的灵活性。前人发展了诸如引入depsipeptide的方法来提高连接效率；也通过定向进化策略，获得了若干可以识别LPxTG之外序列的SrtA突变体。然而目前还没有一种简便的策略能够达到“一石二鸟”的效果，即既不受限于连接位点的氨基酸序列，又能实现不可逆的高效连接。
近日，中国科学技术大学孙德猛副研究员等，报道了一种基于硫酯底物的高效SortaseA酶促蛋白质半合成新方法。该研究发现SrtA能够催化C末端含有硫酯结构的多肽，与另一段N端含有Glycine的多肽进行不可逆的连接反应。而且，C端含有硫酯结构的多肽片段末端可以是多种LPxT的衍生序列。在此基础上发展了硫酯协助的SrtA酶促连接策略（Scheme 1b），实现了高效的、不受限于LPxTG motif的蛋白连接。
研究中，作者首先在模型肽层面证明了多肽硫酯作为底物，与传统的含有LPxTG的多肽底物相比，具有两方面的明显优势：1）克服SrtA连接反应可逆性，连接速率和转化率高；2）扩展了SrtA识别序列多样性。末端为MTG结构的硫酯底物转化率接近100%；硫酯结构使得SrtA能够耐受LPxT序列中单位点甚至多位点氨基酸突变，连接产率可达70%甚至90%。
基于这一发现，作者建立了硫酯协助的SrtA连接新策略。通过化学合成方法或者蛋白质重组技术在连接底物中引入硫酯结构，进而对荧光蛋白EGFP和泛素Ubiquitin进行N端或C端标记。数据表明硫酯底物能够促进蛋白的高效标记，产率可达到70%以上。进一步地，作者利用该策略首次实现了精准磷酸化修饰的、具有天然序列的组蛋白H2AX的半合成。作者还合成了与转录调控密切相关的甲基化修饰的组蛋白H3，并通过生物化学手段，揭示了H3不同甲基化修饰能够影响H3的泛素化水平，从而参与调控基因转录。
该工作发展了一种硫酯底物协助的SrtA介导的连接策略，不仅能够突破SrtA对识别序列的依赖，耐受大量LPxT的衍生序列，还能够实现蛋白片段不可逆的高效连接。该策略表明了对底物进行化学结构的改造能够赋予生物酶更强大的合成能力，为进一步开发其他类型工具酶在蛋白质合成中的应用潜力提供了一个范例。
论文信息
Thioester-Assisted Sortase-A-Mediated Ligation
Chong Zuo,Ruichao Ding,Xiangwei Wu,Yuanxia Wang,Guo-Chao Chu,Lu-Jun Liang,Huasong Ai,Ze-Bin Tong,Junxiong Mao,Qingyun Zheng,Tian Wang,Zichen Li,Prof. Lei Liu,Prof. Demeng Sun
Angewandte Chemie International Edition
DOI: 10.1002/anie.202201887
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