Cell Res║姜世勃/陆路/夏帅的EK1系列多肽能有效地抑制奥秘克戎真假病毒的感染

2022年1月27日，复旦大学姜世勃/陆路/夏帅团队与香港大学袁国勇/陈福和团队联合在亚洲影响因子最高的学术期刊 ─ Cell Research（2020年的IF=25.617，iNature预测的2021年的IF=40.63）（https://mp.weixin.qq.com/s/q9-v1pBCXkiNr0Z1aenihQ）发文证明EK1系列多肽（EKI、EKIC4、EKLIC）能有效地抑制对大多数抗体药物耐受的新冠变异株─ 奥秘克戎（B.1.1.529）真病毒和假病毒的感染（https://doi.org/10.1038/s41422-022-00617-x）。

上个世纪九十年代初，姜世勃（网名：姜肽公）在纽约血液中心（NYBC）工作时发现衍生于HIV-1 gp41 HR2区的一个C多肽（SJ-2176）可高效地抑制HIV-1与宿主细胞的融合并阻止病毒进入细胞内进行复制，论文发表在《自然》（Jiang S et al, Nature 365:113, 1993），其专利（USP 5,444,044）转让给美国Trimeris药物公司，该公司与罗氏制药公司联合开发出世界上第一个基于HIV融合/进入抑制剂的抗艾滋病多肽药物 ─恩夫韦肽（俗称T20）。

自2000年始，先后有近四十位来自中国的科研人员加入了姜世勃在NYBC的团队，包括：刘叔文、何玉先、杜兰英、陆路、徐志凯、赵倩、林康、陆红、潘春根、蔡利锋、于飞、王丽丽、太万波、苏珊、蒲静、余晓文、陈曦、水源、奇志、李静静、张秀娟、刘中华、李琳、谭穗懿、杨洁、马翠卿、张娜茹、李叶、夏承来、向橦、朱东、高雅宁、王宁、唐健、张力、金卫国、卢晓志、严旭霞等。有人把姜世勃领导的NYBC病毒免疫学研究室称之为培养病毒融合/进入抑制剂科研人员的 “黄埔军校”。

他们回国以后在这个领域也获得了一系列重要的研究成果，将中国在这个领域的研究地位推向国际前沿。如中国医学科学院病原生物学研究所/北京协和医学院何玉先教授的团队近年来设计和研发了一系列的类似于恩夫韦肽的脂多肽，其中一个脂多肽─ LP-98比T20的抗HIV活性高出几万倍（Xue J, et al, Cell 185: 131-144.e18, 2022）。该类多肽已进入临床试验，如能成功上市，将是一个重磅级的抗艾滋病新药。

SJ-2176、T20和其它HR2多肽的作用机制如下图所示。艾滋病病毒（HIV）表面有gp120表面糖蛋白和gp41转膜糖蛋白。gp120和CD4受体及共受体结合之后，gp41就像弹簧刀一样弹开，它的融合多肽（FP）扎入靶细胞膜内，其HR1和HR2相互作用，形成一个发夹样结构，三个发夹样结构形成一个六聚体（6-HB），把病毒膜和细胞膜拉在一起发生融合，病毒的基因物质通过融合孔进入靶细胞内进行复制。SJ-2176和T20多肽衍生于病毒gp41的HR2区域，它也可以与病毒gp41的HR1作用形成异源6-HB，这样导致病毒的HR2不能与其HR1作用形成同源6-HB，HIV就不能和宿主细胞进行融合，也就不能进入细胞内进行复制。所以，该类多肽被称之为“病毒融合/进入抑制剂”。

抗HIV多肽的发现开辟了多肽类病毒融合/进入抑制剂的新领域。除了HIV以外，还有呼吸道合胞病毒（RSV）、尼帕病毒（NiV）、埃博拉病毒（EBOV）、流感病毒和冠状病毒（CoV），都属于I型包膜病毒，都采用了HIV类似的融合机制进入宿主细胞内。许多这些病毒都可以引起高致病传染病，比如埃博拉、SARS、MERS、新冠肺炎等。所以，姜世勃的团队将使用同样的策略来研究抗这些传染病的多肽类药物。

2003年当SARS-CoV向全世界蔓延之际，姜世勃立即组织了一个课题组专攻抗SARS多肽的研究。课题组的关键成员 ─ 刘叔文（现为南方医科大学副校长）很快地设计和合成了4条HR1多肽和2条HR2多肽，结果发现HR2P-1多肽能与HR1P-1多肽结合，形成稳定6-HB。何玉先带着这些多肽，专程回国，赶到武汉大学，请田波院士/肖庚富老师的团队检测了这些多肽抗SARS-CoV的活性。结果发现HR2P-1多肽能有效地抑制SARS-CoV活病毒感染宿主细胞，论文于2004年发表在国际顶尖医学杂志《柳叶刀》（Liu S et al.  Lancet.363: 938,2004）。

2012年，在中东地区出现了MERS-CoV，至今已传到全世界27个国家，近2600个确诊病例，病死率高达34%。复旦大学姜世勃/陆路团队很快地找到HR1和HR2区域的氨基酸序列，表达了HR1和HR2蛋白，发现它们可以相互作用形成6-HB。由中科院生物物理研究所的朱赟使用X光衍射技术分析了该6-HB的三维结构。在此基础上，陆路和刘奇设计了多条HR1和HR2多肽。他们发现MERS-CoV的HR2P多肽能够非常有效地抑制MERS-CoV与靶细胞融合，也可以抑制MERS-CoV活病毒感染，而且它的抑制活性比抗SARS多肽抑制SARS-CoV感染的活性高几十倍，表明了MERS-CoV可能主要通过表面膜融合进入细胞内。该论文于2014年发表在《自然通讯》（Lu L et al. Nat Commun 5:3067, 2014）

世界卫生组织（WHO）从2015年12月开始发布可导致大规模暴发严重传染病的清单，用于确定公共卫生紧急情况下应优先研究和解决的传染病和病原体。这个名单在2017年首次审视，2018年2月第二次审视并于同月底发布《预测流行病行动的研发蓝图》，包括“有大暴发危机并难以防范的八大疾病，即埃博拉、寨卡、SARS、MERS、拉萨热、克里米亚刚果出血热、裂谷热、以及第一次出现的“X疾病” （由一个不明病原体所引发的全球性传染病的大流行）。这个通告发出以后，姜世勃团队马上预测第一个 “X疾病” 很可能是由源于蝙蝠的冠状病毒所引起，因为中国的病毒学专家在云南等地找到几个源于蝙蝠的SARS-CoV相关毒株。因此，姜世勃决定要尽快地研发基于多肽的通用冠状病毒 (Pan-CoV)融合/进入抑制剂。

姜世勃团队把当时已有的5种人冠状病毒（HCoV）设计和合成了5条HR1多肽和5条HR2多肽，然后检测这10条多肽对这5个不同HCoV感染的抑制活性。结果发现，衍生于不同HCoV的HR2P多肽都能有效地抑制同源冠状病毒的感染，而衍生于人冠状病毒OC43（HCoV-OC43）的HR2P多肽可以抑制所有的5种HCoV的感染，表明HCoV-OC43的HR2P多肽可以作为一个Pan-CoV融合抑制剂的原型多肽。他们把HCoV-OC43的HR2P多肽进行了修饰，引入了带有正电荷和负电荷的氨基酸，让它们形成多个分子内盐桥，使其α螺旋结构更稳定、水溶性更好、抗HCoV活性更高，这就是EK1多肽。研究发现EK1比HCoV-OC43的HR2P多肽具有更高的水溶性和稳定性，对被检测的5种HCoV和3种来自蝙蝠的SARS相关冠状病毒（SARSr-CoV）的感染都有更好的抑制效果。同时他们也做了动物实验，发现EK1多肽能有效地治疗和预防HCoV-OC43和MERS-CoV对小鼠的感染。通过对这几个病毒的HR1和HR2序列进行分析，发现这些关键的作用位点非常保守，这就是为什么设计一个多肽，能够和所有HCoV的S蛋白HR1区结合形成6-HB，发挥广谱抗冠状病毒的作用。该论文于2019年发表在《科学进展》（Xia S, et al. Sci Adv  5: eaav4580, 2019）。

他们对EK1多肽进行了优化，在其C端连接胆固醇或棕榈酸等脂肪酸分子，后来发现其中的EK1C4和EKLIC脂多肽具有比EK1多肽更高的抑制活性，能够有效地抑制6种HCoV和3种蝙蝠的SARSr-CoV的膜融合及假病毒感染，也能有效地抑制5种活的HCoV（包括MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63）感染。有关EK1C4脂多肽的研究论文于2020年发表在《细胞研究》（Xia S, et al. Cell Res  30:343-355, 2020），而有关EKLIC脂多肽的研究论文于2021年发表在《药学学报》英文版（ZhouJ，et al. Acta Pharm Sin B. https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.07.026,2021）。

他们的研究结果证明，这些高效广谱的EK1系列多肽有望能以鼻腔喷剂和雾化吸入剂型用来预防和治疗现在正在流行的新冠病毒及其变异株、MERS-CoV的感染，也可预防和治疗未来新发与再现的SARS-CoV和SARSr-CoV的感染。目前，他们团队正与山西锦波生物医药股份有限公司合作，已经获得EK1雾化剂的《药物临床试验批准通知书》，即将把EK1多肽尽快地推向临床。

因此，广谱冠状病毒（Pan-CoV）融合抑制多肽是防控现在和未来新冠疫情的最佳武器之一。刺突（S）蛋白HR1区是研发Pan-CoV多肽药物的最佳靶点。因为它是S蛋白中最为保守的区域，特别适合于研发多肽药物。冠状病毒的HR1三聚体在病毒和受体结合后瞬时暴露，并形成空间位阻，使得大于40Kd的蛋白（如抗体分子）不能与其作用，因此作用于HR1的多肽药物不易诱导药物耐受突变。所以，该保守靶点不太适合抗体药物（分子太大，不易进入HR1三聚体所在的狭小空间）和小分子化合物药物（分子太小，不易阻止HR1和HR2强劲的相互作用）。容易规模化生产，可在常温下储存和运输，因此其生产和运输成本远低于抗体。

综上，姜世勃和他的团队在他于上世纪九十年代开创的基于病毒融合/进入抑制剂的多肽类抗病毒药物研究领域内一直保持着国际领跑的地位。由姜世勃和陆路主编的新书《病毒进入抑制剂》（Virus Entry Inhibitors）将于今年3月在施普林格（Springer）出版社正式出版。他们所研发的EK1系列多肽是目前最高效而广谱的HCoV融合/进入抑制剂。迄今为止，他们还没有发现一个对这些多肽不敏感的HCoV。但若有人发现这样一个冠状病毒，请及时与姜世勃联系，他们可以利用该病毒来进一步的研究EK1系列多肽的作用机制，进而设计和研发更高效、更广谱的多肽类抗病毒药物。