生物源性纳米晶体磁珠（BNCM）的制备与应用
前言
1953年，J.D.Watson和P.H.C.Crick提出著名的DNA双螺旋结构模型，开启了分子生物学的新纪元，对DNA的提取成为生物医学以及农林牧渔等领域内所有学科科学研究的基础。1958年，Meselson和Stahl开创性地应用密度梯度离心法获得DNA。1983年，Ugelstad提出将免疫磁珠（ImmunomagneticBeads，IMB）用于细胞分选。1990年，Mihenyi建立了磁性细胞分选技术（MACS）。1998年，美国第一个成功申请利用磁珠法提取DNA的商品化试剂专利。2002年，我国开始研究基于磁分离技术纯化生物分子，经过多年反复试验，现已形成稳定的磁珠法核酸提取体系。磁珠法核酸提取具有传统DNA提取方法无法比拟的优势，纳米磁珠成为免疫诊断试剂、分子诊断试剂、微生物诊断试剂等体外诊断试剂的核心材料，并在生物医学等领域具有广泛的应用前景。
01
纳米磁珠的特性与作用
Characteristics and Functions
纳米磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体，磁珠体分为三层，粒径在1至100nm之间。内层为支持结构，以聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯亚胺等高分子材料做内核；中间层为磁层，材料为Fe3O4、y-Fe2O3或二者的混合物；外层为修饰层，表面被导入羧基、羟基、氨基、巯基、醛基等官能团，可修饰、共价结合抗体、抗原、DNA、RNA、酶、细胞等免疫配基，使得磁珠表面富有多样的功能化活性基团。
免疫配基通过抗原/抗体反应，能够从血液、唾液、脑脊液、尿液、粪便、细胞、病原微生物和动植物组织等各类样本中，特异性地识别和高效结合核酸、蛋白质等生物大分子，从而实现对靶物质的分离纯化。
磁珠法核酸提取分为四步：裂解—结合—洗涤—洗脱。磁珠分散于离液盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）中，先通过裂解细胞，将游离出来的核酸分子特异地吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质、多糖等杂质则留在溶液中；在外加磁场的作用下，磁性颗粒与液体分开，弃除液体后，再经洗脱即得到纯化的核酸分子。
纳米磁珠所具有的表面效应、量子效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等特性，赋予了独特的光学、磁学、电学、热学、力学及化学活性。主要有以下特性：
（一）灵敏的磁响应性。
纳米磁珠具有超顺磁性，在磁场存在时，磁珠瞬间产生磁性，迅速团聚；当磁场消失时，磁珠又瞬间失去磁性，迅速均匀分散；将磁珠捕获的生物分子从复杂的环境中分离出来。
（二）高效的吸附性。
纳米磁珠具有较大比表面积和固载量，表面官能团丰富，可修饰多样功能化活性基团，能共价偶联不同配体分子，在一定的缓冲条件下进行可逆的结合。
（三）良好的生物相容性。
纳米磁珠安全无毒，不产生免疫抗原性，对细胞及生物分子的活性和功能不造成伤害与影响。
（四）较高的稳定性。
纳米磁珠在胶体溶液及复杂的生物环境下，悬浮稳定性和分散性好，不易发生团聚或沉淀。
纳米磁珠的特性使其能够实现核酸纯化、蛋白质纯化、细胞分选、微生物富集、免疫测定和免疫识别等多种目的，广泛应用于医疗卫生、疾病防控、检验检疫、卫生监督、司法鉴定、环境监测、生物防护和分子生物学研究等诸多领域。
02
生物源性纳米晶体磁珠的制备
Preparation
目前，常用的纳米磁珠制备方法，主要有物理法(高能球磨法、物理气相沉积法和真空冷冻干燥法)与化学法(共沉淀法、高温分解法、微乳液法、水热法和溶胶-凝胶法)两大类，制备的磁珠都存在着程度不同的问题，如粒径尺寸不均一、形状不规则、分散性差、杂质多、磁学性质不稳定、磁效应不一致、磁响应性弱、功能化程度低等缺陷，导致在生物学应用上效率较低，难以大规模地用于高通量筛查，难以满足更高标准的使用需求。
1975年，Richard Blakemore在一种称为折叠螺旋体（Spirochaeta plicatilis）的趋磁细菌（magnetotactic bacteria）中发现磁小体(magnetosome)的存在并命名。目前，所知的趋磁细菌主要为水生螺菌属（Aquaspirillum）和嗜胆球菌属（Bilophococcus）。每个趋磁细菌细胞内含有2-10颗磁小体，为单磁畴晶体，主要成分是Fe3O4或Fe3S4,尺寸在20-120nm之间，有正八面体、平行六面体或正六棱柱等多种晶体形态，磁小体尺寸和形态均一,颗粒间不聚集，没有细胞毒性，外有一层磷脂、蛋白或糖蛋白生物膜包被，是极其优良的生物来源磁性纳米材料，磁小体的特性使其在许多领域有着潜在的、不可估量的应用价值。
自20世纪90年代以来，美国、日本、德国与中国的科学家和工程学家投入大量研究，试图采用基因改造的合成生物学方法，从趋磁细菌胞内合成磁性纳米粒子，但仅限于实验室成果，不能解决大规模生产问题，使其商业化应用受到很大限制。
2018年，张金菊博士课题组研究的“生物源性纳米晶体磁珠工业化生产技术”项目，取得了源头创新突破，在国际上率先实现生物源性纳米晶体磁珠（BNCM）的工业化生产规模。该技术获得系列发明专利授权，具有原创性，拥有完全自主知识产权，处于国内首创、国际领先水平，形成自主的核心竞争力。
合成机理
首先，从河底淤泥中筛选分离出合适的初始菌株；然后，利用合成生物学方法对其进行基因改造，以基因工程菌种为基础，经过生物反应器发酵工艺扩大培养，在菌体内合成30-50nm的Fe3O4正八面体磁性晶体。已建立在生物反应器控制下，合成BNCM的全新方法，合成工艺成熟、稳定，对环境友好，可以大规模生产。
核心技术
BNCM工业化生产技术的关键是获取生产菌种。通过反复实验，在自然界分离驯化得到一株专利生产菌种，以此为基础构建了一系列基因工程菌株，能够精确地控制合成的菌株，建立了基因工程改造天然菌株的晶体磁珠规模化生产与纯化体系，发明了生物法制备纳米晶体磁珠的工业化生产工艺，解决了生物法制备纳米晶体磁珠从实验室成果到产业化的工程转化，使得BNCM可以进行大规模工业化生产，产量为国外文献报道的数十倍。
产品优势
天然及基因工程改造的BNCM，与物理法和化学法制备的纳米磁珠相比有许多优点：
1、有天然生物膜包被，且处于超顺磁性范围，不易聚集，具有良好的分散性；
2、天然生物膜上带有大量生物活性基团，可用于与其他分子的共价连接，且连接其他分子后，可方便地通过外加磁场分离纯化；
3、生物来源使其具有良好的生物相容性和安全性，无毒性与副作用，可作为载体直接进入人体内参与临床诊断和治疗；
4、载药晶体磁珠在体内通过降解天然生物膜的方式，即可实现药物的释放。
因此，以BNCM为原材料的核酸提取试剂盒，其试剂盒中晶体磁珠的磁力学性质，试剂盒回收率、精密度、稳定性，以及试剂盒提取所得DNA产物的浓度、纯度、得量、完整性等表征性能参数，具有十分明显的优势，检测灵敏度更高，特异性更强，适应性更广。
03
生物源性纳米晶体磁珠(BNCM)的应用前景
Application Prospect
BNCM工业化生产技术的问世，使其商业化应用成为可能，不仅是高端纳米磁珠进口替代的最佳选择，还将促进体外诊断检测技术智能化、自动化、数字化和微型化的发展进程，并在纳米医学等领域发挥其独特的作用。主要有以下应用前景：
1
固定化酶
生物酶是机体内常用的催化剂，在使用酶进行催化反应时，往往需要固定化酶，酶具有很多官能团，能够通过共价耦合、交联 、物理吸附等方式，固定在BNCM的表面；即可以快速分离酶与产物及底物，实现酶的重复利用，提高酶的利用率；又能保持酶在不同介质中的催化活性，增加酶的稳定性。
2
细胞分离
BNCM作为不溶性载体，在BNCM表面上接有生物活性的吸附剂或其它配体等活性物，利用它们与靶细胞的特性结合，在外加磁场作用下将细胞分离，捕获到的靶细胞可以实现完全富集，所获靶细胞直接用于后续的功能检测和培养。
3
磁共振造影剂
BNCM经特定生物物质表面或化合物修饰后，作为磁共振成像（MRI）造影剂，具有不透过性、特异性分布高、靶向性好、血循环半衰期长、体内组织特异性高、毒副作用小等特性，能够改善胶体的稳定性，延长循环动力学，限制负载药物量和药物分散的快速性，容易被肿瘤等生物组织吸附，形成BNCM在正常组织和异常组织内的分布差别，显著增强对比成像效果，在磁场帮助下可定位进行精确观测。
4
肿瘤热疗载体
BNCM与亲和剂充分混合后进入血循环内，在体外恒定磁场的引导下定位于肿瘤组织，均匀分布在病变部位，在交变磁场的作用下，由于磁滞后效应而产生热量，将富有BNCM的肿瘤部位加热到治疗温度，选择性杀死肿瘤细胞，同时又不损伤正常细胞。
5
靶向药物载体
BNCM表面修饰特异性的配体能成为很好的靶向性载体，又被称为“磁控导弹”，能逃逸网状内皮细胞系统的吞噬，即可结合药物分子，又可保护药物分子，并具有优良的导向性和方向性；载药BNCM注入肿瘤供养动脉后，通过外磁场导航准确靶向病灶部位，持续缓慢释放药物，在提高靶区药物浓度的同时，可减轻对正常组织的损伤，从而降低其生理毒性，有选择性地抑制或杀灭肿瘤细胞。
6
基因治疗
BNCM作为非病毒载体，无免疫原性；因为其拥有较大的比表面积，表面所带的电荷使其能装载大量的大片段DNA；并且BNCM的靶向性，也为人为操纵提供了可能；在其表面包覆一些生物材料，还能使其具有良好的生物相容性；以BNCM为载体将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到基因治疗目的。
04
战略愿景
Strategic Vision
纳米技术与精准医学的深度融合，形成纳米精准医学，是一个新兴的交叉学科，处于当代科技发展的前沿领域。纳米精准医学充分利用纳米材料的独特优势，解决疾病的精准诊断、精准治疗、精准监测和精准预防问题，实现精准医学为人类健康长寿服务的目的。BNCM作为新一代纳米材料，以其优良的品质，在纳米精准医学研究领域极具潜能，大有作为，蓄势待发。具体研究课题有以下展望：
（一）基于纳米技术的核酸及蛋白质提取、分离、纯化技术。
（二）基于纳米技术的PCR检测技术。
（三）纳米效应基础上的超敏感传感检测技术。
（四）纳米粒子标记的层析芯片技术。
（五）二维纳米材料在肿瘤标志物检测中的应用。
（六）基于纳米技术的循环肿瘤细胞检测。
（七）基于纳米技术的循环肿瘤分离捕获与定量检测技术。
（八）活体原位生物合成纳米簇探针多模态精准成像。
（九）纳米孔测序技术。
（十）干细胞纳米技术。
（十一）中药纳米化处理技术。
（十二）基于纳米探针的诊疗一体化技术。
（十三）纳米诊疗技术的临床转化。
实现纳米精准医学研发的战略目标会面临诸多挑战，体外纳米诊断技术，需要解决纳米材料与纳米器件的精准制备与加工问题；体内纳米诊疗技术，需要解决纳米探针及纳米机器的遥控、体内代谢、安全性与进出问题。随着化学、物理学、生物学、材料学等领域的不断进步，研发中所遇到的技术攻关难点，将会被一个一个突破。世上无难事，只要肯登攀，展现在我们面前的将是一个美好的未来。
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