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全领域通吃的机制
自噬一直以来都是各个研究领域中备受关注的机制，虽然最近几年并没有lncRNA、m6A等等这些新机制火，但毕竟是拿过诺贝尔奖的机制，说它是常青树一点也不为过。关于自噬过程本身也有一些新的机制在过去几年得到了阐述和发现。学习这些机制，有助于拓宽我们的思路和视野。2021年4月26日，加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系James H. Hurley教授在著名期刊Nature Cell Biology（IF=28.824分）上发表了一篇题为《Autophagosome biogenesis comes out of the black box》的综述，系统性地介绍了关于自噬机制本身在过去几年中所取得的发现和进展。
关于自噬在肿瘤中的分子机制，本工在53分Nature神子刊重磅综述阐述这两个研究热点，快收藏的推送中对发表在Nature Reviews Cancer上题为《Autophagy in tumour immunity and therapy》综述进行了解读和翻译，大家也可以阅读那篇推文进行学习。
为了帮助大家更好的吸收综述的内容，榨干其每一滴精华，本工在阅读综述的时候，也给大家翻译了遍，希望能给大家带来有真正价值的“学术营养”。
摘要
细胞膜物质的大自噬（Macroautophagic）清除需要自噬体的启动、生长和闭合（closure）。内容物（Cargo）可触发内容物受体和核心机制网的组装。自噬相关蛋白9（ATG9）囊泡可为生长中的自噬体膜提供种子，该膜由从头磷脂合成、通过ATG2蛋白的磷脂转运和ATG9的脂质翻转所提供。最后，自噬体通过ESCRT复合体闭合。在本文中，我们回顾了最近的研究发现，阐明了自噬体形成的分子机制，并讨论了这一快速发展领域中的新问题。
主要内容（Main）
大自噬（以下简称自噬）是真核细胞降解和回收大型物品（如分子团块、细胞器和细胞内病原体）的重要办法。自噬功能障碍也是许多疾病的核心，包括病毒和细菌感染、癌症和神经退行性疾病。自噬由双膜吞噬泡（phagophore）的启动和生长组成，围绕在要降解的对象周围，随后吞噬泡被封入称为自噬体的双膜囊泡中，并与溶酶体融合（图1）。
导致自噬的蛋白质和蛋白质复合物的部分清单已经基本确定，这一成果也得到了诺贝尔生理学或医学奖得主Yoshinori Ohsumi的认可。然而，这些复合体和蛋白质是如何通过吞噬泡的启动、生长和闭合来协调膜脂质的则一直是一个谜，一直被认为其“起源不明，生物生成复杂”。在过去的两年中，越来越多的光逐渐照进了黑盒子里的黑暗角落，逐步明确了吞噬泡形成过程中每个主要步骤的性质（图1）。
本体（bulk）自噬是指饥饿触发的非特异性吞噬和降解胞质的物质以补充生物合成前体。选择性自噬是指针对特定底物的相同过程。虽然自噬的基本机制最初是在酵母中发现的，但本综述将主要关注哺乳动物细胞的选择性自噬。我们将在某些情况下参考那些来自酵母的本体自噬数据，主要是基于在酵母和哺乳动物之间存在的同源性，以解决哺乳动物系统中的知识空白。本综述从机制角度介绍最新的研究进展，重点是在重组实验中的发现。
哺乳动物细胞中自噬启动的级联始于unc-51样激酶1（ULK1）复合物，该复合物由其同名的ULK1（或ULK2）蛋白激酶、200kD的非催化性粘着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200）以及自噬相关蛋白13（ATG13）和ATG101亚单位所组成，其在酵母中的对应物是Atg1复合物。
由VPS34、VPS15、Beclin 1（BECN1）和ATG14组成的PI3KC3复合物1（PI3KC3-C1）会在自噬启动早期被激活，生成磷脂酰肌醇3-磷酸(PI(3)P)。富含PI(3)P的膜可招募下游效应因子WIPIs（与磷脂酰肌醇有相互作用的WD重复蛋白），这反过来又会招募并激活ATG8/微管相关蛋白1轻链-3（LC3）的结合机制。LC3和GABARAP亚家族的ATG8蛋白可附着在膜脂磷脂酰乙醇胺上，称为LC3脂化，这是自噬体生物发生的一个标志。
LC3脂化是通过泛素样的偶联级联进行的。泛素E1类ATG7和E2类ATG3可在LC3通路中进行同源反应。ATG12-ATG5-ATG16L1复合物可为LC3从ATG3到磷脂酰乙醇胺的转移提供支架。ATG12-ATG5-ATG16L1的作用类似于RING域泛素E3连接酶的作用，尽管其任何一个亚单位与泛素E3连接酶之间均没有序列上的同源性。ATG2可将磷脂从内质网转移到正在生长的吞噬泡，而ATG9则可将磷脂从细胞质小叶转移到管腔小叶，从而使吞噬泡扩张。上述这些蛋白有时被称为自噬核心复合体。
在本综述中，我们将重点讨论选择性自噬途径的一个子集，包括聚集体自噬（aggrephagy）、线粒体自噬（mitophagy）和异体自噬（xenophagy），它们可由内容物的泛素化启动。这些泛素化的底物被一组内容物受体识别，包括p62、NBR1、OPTN、NDP52，也被称为钙结合和卷曲螺旋结构域2（CALCOCO2）和TAX1BP1（Tax1结合蛋白1）。所有这些受体都包含一个LC3相互作用区（LIR）、一个泛素结合域和一个二聚体/寡聚化域。这些内容物受体通过与簇状泛素链和膜结合的LC3发生相互作用而将内容物连接到吞噬泡上。
启动
1
选择性自噬体的按需生成
到2019年初为止，该领域的主要模型表明，当自噬受体将内容物桥接到预先就存在的ATG8阳性的膜上时，哺乳动物的选择性自噬就开始了。然而，ATG8s本身已被证明在至少一种选择性自噬途径--即线粒体自噬中对吞噬泡的形成是非必要的。ATG8s在有丝分裂中确实有助于控制自噬体的形成速度和自噬体大小，而在本体自噬中，它们则会促进溶酶体中自噬体内膜的降解速度。这表明自噬受体必须能够直接招募和激活核心自噬启动机制，绕过对ATG8蛋白的需求。
事实上，这样的机制早在近二十年前就已经在酿酒酵母的自噬样细胞质到空泡靶向途径中被发现了。在酵母中，氨肽酶前体prApe1可被内容物受体Atg19分拣到空泡中，Atg19与Atg11结合，并反过来与Atg1核心复合物结合。
Atg1复合体在哺乳动物中的对应物是ULK1复合体，而酵母中Atg11支架亚单位的哺乳动物对应物是FIP200。Atg11的羧基（C）端结构域可在酵母中与Atg19受体结合，这表明FIP200的相应C端爪状结构域可能会与哺乳动物的自噬受体相结合。研究发现受体p62含有一个FIP200相互作用区（FIR），与Atg19的Atg11结合区有着较弱的同源性，并且与p62的LIR存在重叠。当FIR被磷酸化时，p62 FIR对FIP200爪状结构的亲和力会增加。p62磷酸化-FIR-FIP200的相互作用足以将ULK1复合物招募到凝聚内容物的部位，从而启动自噬体的生物生成（图2a）。
FIR基序的相互作用并不是内容物受体招募ULK1核心复合物的唯一机制。正如酵母双杂交筛选实验所显示那样，FIP200也可与另一个自噬受体NDP52相结合。NDP52的SKICH结构域可与FIP200的卷曲螺旋结构域相互作用，这与上文所描述的p62的FIR-Claw相互作用不同。FIP200-NDP52的相互作用能够驱动异体自噬和线粒体自噬。NDP52也可参与诱导FIP200的构象变化，从而促进ULK1复合物的膜结合。
在异体自噬中，TBK1和TBK1衔接蛋白SINTBAD/NAP1也是必需的。在线粒体自噬中，TBK1可促进NDP52对FIP200的招募，但FIP200的化学定向招募可以绕过对内容物-NDP52参与的需要，表明ULK1复合物的招募就足以触发自噬体生物生成。基于这些发现，加上上面所描述的p62的结果，表明至少有两种受体可通过招募ULK1复合物到其作用部位来触发自噬的启动。这个模型并不限于ULK1复合物。
第三种自噬受体OPTN被发现可直接与ATG9A发生相互作用以启动线粒体自噬，并有可能绕过FIP200。不同内容物受体对ATG9A和ULK1复合物的靶向作用则可以解释长期以来的研究结果，即这些成分可以相互独立，ATG8s可以靶向线粒体自噬的起始位置。除了ULK1复合物和ATG9，其他核心成分，如PI3KC3-C1、ATG16L1复合物或WIPIs，是否能被自噬受体直接招募还尚不清楚。因此，目前的新模型是当内容物通过内容物受体招募核心自噬成分来激活上游核心复合物时，自噬膜是按需生成的（图2b）。
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本体自噬中的吞噬泡支架
在选择性自噬中，内容物本身为吞噬泡的形状提供了模板。在本体自噬中，支架的机制还不太清楚。膜弹性的第一原理决定了在自由溶液中，膨胀的膜片会折叠成杯子的形状，而新月体自噬蛋白会降低自由能屏障以促进这一过程。单纯的膜弹性是否能在没有模板的情况下在细胞质中驱动吞噬泡的成型还不确定。
p62最初被确定为聚集体自噬的受体；然而，最近的研究表明，p62能与多聚泛素形成相分离的凝聚物。在体外，纯化的p62可形成宽度为15纳米的丝状物，在模型泛素化内容物存在的情况下，凝结成0.5-2.0微米的团块（clusters）。这些团块具有许多相分离凝集物（phase-separated condensates）的特性，包括高球形度和高融合倾向。凝集的p62能够招募ULK1复合物，这就解释了相分离凝集物的摄取是如何发生的了。在细胞中，这些凝集物的大小与其他选择性自噬的底物相似。
另一个受体，NBR1，则可以直接促进p62凝聚物的形成。因此，至少在有明确证据表明内容物凝聚的情况下，本体自噬实际上可能是一种凝聚物自噬（condensate-phagy）或液体自噬（fluid-phagy）。最近，吞噬泡的膜弹性模型被证明与液体p62凝聚物的吞噬（engulfment）相似。但这也只是选择性自噬的多种形式之一，吞噬泡的生长由凝集物的大小和形状来决定。
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低亲和力相互作用的多价网指导（directs）启动
一个重要的基于酵母遗传学的自噬启动模型表明，在饥饿诱导的自噬中，核心复合物是按照严格的顺序被招募的，从FIP200的对应物Atg17开始，最后是Atg8脂化机制。然而，活细胞成像发现，在哺乳动物饥饿诱导的自噬中，ULK1和ATG8脂化机制的ATG5成分可同时到达自噬体形成部位。越来越多的证据表明，多个高亲和力和低亲和力的相互作用网络可稳定新生吞噬泡上的自噬启动复合体网络。这有助于提高该过程的冗余性（redundancy）和稳健性。
ULK1复合物（或酵母中的Atg1复合物）清楚地说明了多种相互作用是如何驱动自噬启动的。ULK1复合物的ULK1、FIP200和ATG13亚单位都含有较大的固有无序区（IDRs）。事实上，ATG13的大部分由C端的IDR组成。ATG13-FIP200和ATG13-ULK1的关键接触是由ATG13 IDR驱动的，它构成了整个复合物的主要统一元素。因此，该复合物的组织结构是松散的（图2c）。
虽然每个亚单位都是经典自噬所必需的，但它们的组装并不总是严格按要求来进行的。在饥饿诱导的自噬中，去除FIP200和ULK1的ATG13 IDR结合位点后，会有中等的或没有表型。这意味着ULK1复合体亚单位与自噬启动系统的其他成分有足够的冗余相互作用，使它们能够执行其功能而不需要严格地组装成经典的ULK1复合体。
酿酒酵母的Atg1复合物也主要由其Atg13亚基的IDR所组织，它在二聚体香蕉形的（banana-shaped）Atg17亚复合物中与多个部位存在相互作用。Atg13桥接多个Atg17二聚体的能力可驱动Atg1发生相分离，至少在体外是这样。Atg13和Atg17各只需要15-50个拷贝就能启动一个吞噬泡。如何解释只涉及几十个分子的生物分子过程的介观（mesoscopic）相分离也是一个目前尚未解决的问题。凝聚物的许多物理特性在生物学中很重要，如它们封存其内容物和相互融合的能力，尽管这并不适用于少数分子的规模/尺度（scale）。其他方面尤其是通过多种低亲和力相互作用的网络进行组装则在所有的尺度上都是相关的。
自噬起始协同作用的另一个例子是一个包含PI3KC3-C1、WIPI2和ATG16L1复合物的回路（circuit）。当PI3KC3-C1被招募到自噬启动位置时，它可将磷脂酰肌醇磷酸化为PI（3）P。膜结合型PI（3）P然后可将WIPI蛋白招募到膜上（图2d）。
至少有一个WIPI（即WIPI2）是招募ATG16L1复合物到膜上从而触发ATG8脂化的关键。PI3KC3-C1、WIPI2和ATG16L1回路的重排表明WIPI2和PI3KC3-C1之间额外的弱相互作用可促进正反馈以推动ATG8的脂化反应。泛素化内容物、内容物受体和ULK1复合物的存在进一步提高了ATG8脂化的速度。
增长
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自噬体膜的脂质运输
自噬体因其能够在几分钟内就从头开始生长而备受关注。这种大规模增长的脂质供应，估计每秒需要转移4000个磷脂分子，所以也一直是该领域中谜团之一。对Atg2蛋白的研究则提供了问题的答案，该蛋白于2001年被发现，但其具体功能直到最近仍然难以捉摸。人类的ATG2A是棒状的，在与WIPI4的复合物中，能够拴住膜。ATG2与脂质转运蛋白家族的VPS13蛋白具有序列同源性。这些观察结果使三个研究团队获得了开创性的发现，即酵母Atg2和人类ATG2A蛋白是连接生长中的吞噬泡和内质网等膜源的脂质转运蛋白（图3）。
在体外测得的脂质运输率足以使每个吞噬泡获得大约100个ATG2分子以满足膜生长的需求。嗜热酵母Vps13在低温电子显微镜（cryo-EM）下显示出有一个长而宽的疏水通道，贯穿整个杆状蛋白的长度，这也就解释了Vps13/Atg2蛋白家族成员为何能作为磷脂的firehose。
用于自噬体扩张的Atg2 firehose模型立即引发了另外几个问题。其中一个主要问题是如何解决磷脂快速输送到吞噬泡外叶所造成的潜在不平衡。Atg9（哺乳动物的ATG9A/B）是核心自噬机制的唯一完整膜蛋白，其功能本身就是一个重要疑问。ATG9A的低温电镜结构显示出一个充满空腔的三聚体膜嵌入组件，表明了其在脂质运输中的潜在作用。
随后的两篇低温电镜结构论文则更详细地揭示了酵母Atg9和人类ATG9A表面存在的亲水通道。这些通道沿着Atg9跨膜表面的长度进行延伸，这也是在膜双层的两个小叶之间平衡磷脂的混杂酶的特征。这些研究和另一项研究都证实了Atg9和ATG9A在体外具有磷脂加扰酶（scramblase）的活性。是野生型而不是atg9Δ型酵母中的磷脂是呈对称分布的，这与Atg9对多种磷脂所具有的加扰酶活性一致。综上所述，Atg2和Atg9的发现解释了磷脂是如何被引导到生长中的吞噬泡中的（图3）。
2
Atg9囊泡的作用
ATG9囊泡的功能一直是自噬体生物生成的主要问题之一。正如在酵母中所描述的那样，经高尔基体网络所衍生的Atg9囊泡是自噬启动时所需要的。然而，这些囊泡的大小和数量并不能说明产生吞噬泡所需脂质的数量是几个数量级的。据此也产生这样一个假设：Atg9囊泡不是膜的来源，而是吞噬泡生长的种子。最近对酵母自噬启动的重构研究，包括内容物受体Atg19、Atg11支架（酵母中的FIP200对应物）、PI3KC3-C1、Atg8脂化系统、Atg2和Atg9，都证实了Atg9囊泡可以作为吞噬泡生长的种子。
在这个系统中，Atg19和Atg11可将模型内容物与机制的其他部分联系起来。脂质转运体Atg2的招募也足以催化供体囊泡的脂质转移。新转移的磷脂酰乙醇胺能够通过缀合机制而作为Atg8脂化的受体。其中的一个关键点是，脂质转移可以发生在Atg8脂化的上游。这与哺乳动物细胞的研究结果也相一致，即ATG8结合机制蛋白对吞噬泡的启动并不重要，而且内容物受体TAX1BP1驱动的FIP200聚类（clustering）可以绕过ATG8脂化。因此，ATG9囊泡的吞噬泡播种似乎也可能在哺乳动物中起作用。
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自噬体本身可为其生长提供脂肪酸
ATG2和ATG9不是ATP酶，也不知道它们是否与其他能量输入相耦合；因此，它们的脂质转移和加扰酶活动必须由浓度梯度在热力学层面上驱动。这种梯度似乎最可能是由从头磷脂合成过程所建立的。在酵母中，长链脂肪酰基-CoA合成酶Faa1定位于吞噬泡，其存在是吞噬泡生长所必需的。用同位素标记来追踪由定位于吞噬泡且由Faa1所激活的脂肪酸，结果显示这些脂肪酸会被纳入磷脂中，然后被Atg2送回吞噬泡。与这一观点一致的是，哺乳动物的自噬启动发生在富含磷脂酰肌醇合成酶的内质网中，而且胆碱磷脂的合成被证明是癌细胞吞噬泡生长所需的。因此，吞噬泡中的脂肪酸激活似乎是推动吞噬泡生长的一个关键步骤（图3）。
关闭
随着吞噬泡的生长并吞噬其底物，最终，双膜发生会聚，直到只剩下一个未封闭的膜颈。开放的颈部允许细胞膜和内部之间的交流。在膜颈关闭之前，不可能使内部酸化，从而使其内容物发生降解。内部与细胞膜相连的膜颈，如闭合吞噬泡的膜颈，由运输所需的内体分选复合物（ESCRT）机制来解决。十多年前研究人员就注意到自噬中与神经退行性有关的ESCRT相关表型。直到最近，才似乎找到了能确定自噬中检测关闭步骤的方法（图4a）。
人类ESCRT-I是自噬体关闭所需的，特别是VPS37A亚基。目前还不知道ESCRTs是如何被招募到要关闭的吞噬泡上的，尽管它可能是以某种方式招募到VPS37A。一旦被招募到其作用部位，ESCRT-I就会形成一个由大约12份复合物组成的环形组件，这会有助于招募下游的ESCRTs并协调关闭（图4b）。
对于大型的内容物，如细菌和线粒体，自噬可能会在多个部位启动，ESCRTs也可能参与了将几个膜碎片拼成一个吞噬泡的过程（图4c），
如在核膜改造过程中所表现的那样。有一个关键的问题是如何使闭合与终止生长两者发生正确地同步，ESCRTs如何靶向吞噬泡颈部，以及如何在闭合完成前阻止溶酶体融合。
总结
上述发现展示了我们认为在过去两年中关于自噬机制最重要的进展。八年前，一篇综合性综述这样得出结论：
“然而，关于自噬膜的精确蛋白质和脂质组成、其形状背后的机制、它们如何从ER中分离以及自噬体是如何最终关闭的，仍有许多未解之谜。”
在过去的两年里，该领域已经在回答这些问题方面取得了重大进展。现在确实是改写教科书的时候了。当然，这些发展也提出了许多新的问题。现在，人们对启动、生长和闭合的各个步骤都有了更好的了解，因此出现了关于它们之间以及与其他细胞过程之间的协调问题。从启动到生长，以及从生长到闭合的过渡线索是什么？随着我们的理解变得更加量化/具体化，我们可以开始询问每个步骤的限速反应是什么。随着我们对这些过程和特征的了解，我们可以开始合理地调节这些途径，并利用基于上述的基本见解来开发潜在的治疗方法。
还想看什么类型的综述都可以留言哦~
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撰文丨二十二画生
排版丨豨莶
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关键词
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作用
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