质粒：瘦身成功的我不就是你DNA的真命天女么？

解螺旋公众号·陪伴你科研的第2596天

胖质粒变形记

与身兼数职（复制、转录、翻译等）而致使瘦成螺旋状的染色体大哥不同，我只是一个胖胖的萌萌哒质粒，因心宽体胖兼有高度亲和力，能跟很多受体细胞都能打成一片；且又因身具多种单一切割位点、能容纳外源基因及合适的筛选标记，因而也备受科研者们的喜爱并被光荣选为各种基因的载体。

而我本人对于高富帅的外源基因也可谓是一见倾心。为了能和外源基因重组为一个完满的圆，“好闺蜜”限制性内切酶着实功不可没！为了打动高富帅外源基因的心，限制性内切酶会强制性帮我减肥，使我从圆滚滚的憨丫头顺利转为苗条的俏姑娘，并努力帮我争取与外源基因约会的机会。

对此，我很是感激。果然，在核酸内切酶家族中，只有Ⅱ型内切酶才是我的好闺蜜，因为她不仅了解外源基因真正喜好（粘性末端序列），并能依据我身上特异性的回文序列进行量体裁衣（定点切割）。哪像Ⅰ型和Ⅲ型限制酶这两个绿茶婊，说是要帮我，却只是简单粗暴在离切割位点1kb到几kb的地方随机切割，因而带着错误妆容（粘性末端序列不匹配）的我与心仪的外源基因只能擦肩而过，这样还不如当初直接让核酸外切酶将我切成渣渣的好。

至于我瘦身的过程，说起来也非常简单，就是闺蜜嗖嗖两刀下去，便可迫使我所有脂肪细胞（酶切位点）纷纷离去。换言之，就是将我和两种限制性内切酶以及Buffer和（huò）在一起，然后于37 ℃水浴锅里泡个1-2h的澡，即可通过电泳走秀检验我的瘦身成果。

而后瘦身成功且变得美美哒的我便会在“红娘”连接酶的搭桥连线中与高富帅外源基因结成一家人。而在重组家庭之后，很快我便又重新恢复本性，再一次变得心宽体胖起来。

就在一切都尘埃落定时，我便喜欢话当年，遥想起当年与闺蜜（限制性内切酶）之间种种过往，不得不感叹道好闺蜜的养成也是蛮不容易的。

初识闺蜜时，自然少不了摩擦与矛盾，以至于时常会出现以下两种极端情况：要么瘦身失败（切不断）；要么瘦到走火入魔（乱切一气以自虐）。因而这段友情唯有通过彼此之间的相互了解相互磨合方可得以维系。

所以一旦我瘦身失败，我首先会反思自己是否太过任性，竟将酶切位点的碱基修饰成了闺蜜识别不了的形式（如甲基化等）；又或者太过调皮，以至于酶切后的黏性末端在退火时又重新结合起来，让闺蜜做了无用功。

此时，我会当机立断的改用JM109来替代DH5α以减少修饰，同时尽量调整酶切体系（50ul、100ul，大体系可稀释酶中的甘油有利于反应）。

其次，为了确保限制内切酶与我是否真的志同道合（相互匹配），我会预先进行酶A和酶B各自的单酶切以及A+B的双酶切等实验。如果一切正常，即单酶切时只有一条线性化条带、双酶切出现两条带时，那么她才算具备成为中国好闺蜜的特质。

即便如此，我瘦身的道路依然曲折而险阻。毕竟，天下懒胖是一家。我既然占了胖，那么闺蜜自然也就赖上了懒。有时，闺蜜懒癌晚期，不肯尽心尽力的出大力（如酶活性下降甚至失活），也会极大的阻碍了我减肥大业的完成。这时，只有对其进行冷处理（冰上酶切）或者忍痛换新酶才能助我早日搞定自身的终身大事。

但有时我会为了瘦达到一种丧心病狂的地步（酶切过头），以至于经常发生一些该切的地方没切，不该切的地方瞎切的“自虐”事情。追根究底，竟是由好闺蜜的癫狂（非特异性酶切活性——星号活性）而引起的。

其实，能引起酶切的星号活性的因素有很多：

1）非最适的pH

2）Co2+、Mn2+取代Mg2+

3）酶浓度大于25u/ug

4）盐浓度降低

5）高浓度甘油的存在(>12%)

6）有机溶剂的存在等等

但最常见的原因莫过于酶切时间过长或者酶量过多。

这种时候，我的良心建议就是酶切水浴1-2h就已经完全足够了；另外，所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度就会超过5%，进而会产生星号活性。

虽说酶切没有辣么简单，但是对于不做构建的小伙伴们而言并没有什么卵用，可如果你想玩转基因克隆，那么以下两件神器就是必须要掌握的了。

1、REBASE（Restriction Enzyme dataBASE）

网址：http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

通过使用REBASE来获取限制性内切酶的最新信息，几乎已成为了该领域的主力军。REBASE于20世纪70年代由New England Biolabs创建，并被诺奖得主Richard Roberts进行了专利申请。REBASE可提供大量有关限制性内切酶的类型、识别序列和切割位点的信息。同时它还包含了有关甲基转移酶，晶体结构等信息。

2、NEBcutter

网址：http://nc2.neb.com/NEBcutter2/