恶性淋巴瘤（ML）是淋巴瘤中恶性程度最高也是最难治的一种。虽然靶向治疗和免疫治疗很大程度上提高了患者生存率，但鉴于该疾病异质程度太高，依然有不少患者无法从中获益。ICML于1981年第一次召开，至今已成为淋巴肿瘤研究和治疗科学界的顶级活动，现在每两年召开一次。与参会者共同探讨淋巴肿瘤领域的最新研究和目前存在的难题。2019年第15届恶性淋巴瘤国际会议于6月18-22日在瑞士卢加诺召开。还未进入临床但可能在临床上大放异彩的新药对ML治疗至关重要。因此，让我们一起分享下ICML中的非临床新药部分。

HAT活化剂联合泛HDAC抑制剂
组蛋白乙酰转移酶（HAT）的失活突变编码基因EP300和CREBBP，存在于约40%的生殖中心（GC）来源淋巴瘤中。突变是单等位基因，这表明如果野生型等位基因的功能增强，它们的活性可能会恢复。
本文将CTPB作为源头化合物，合成了一个包含70个HAT调节类似物的化合物库。用细胞效价评价细胞毒作用；用免疫印迹测定了组蛋白乙酰化的功能效应；在组蛋白提取和免疫印迹或质谱分析后，在细胞中测量组蛋白乙酰化；用免疫印迹法测定p53乙酰化。
通过记录重组15N富集的P300溴域的1H-15N HSQC核磁共振波谱，测定了先导HAT化合物YF2与P300的结合。协同效应通过EOB计算（EOB>10=协同效应）。
将SUDHL6细胞移植到SCID-beige小鼠体内，分为给予溶媒对照、40mg/kg YF2、2mg/kg romidepsin或者联合用药。用卡尺测量小鼠肿瘤体积。生存率用Kaplan Meier法测定。
在4个DLCBL细胞系中，29种化合物的IC50范围为3.6-43.2μm。四种化合物显示acH3K27（EC50 9.4±3.1-152.7±0.8 nM）和acH3K18（EC50 83.4±1.3-269.9±0.8 nM）的剂量依赖性显著增加。
选择YF2作为先导化合物，因为与野生型细胞相比，它对EP300突变细胞株的乙酰化和选择性细胞毒性更高（IC50 5μm和19μm，P<0.0005），在细胞中，YF2诱导6倍H3K27乙酰化、5倍P53和2倍小鼠淋巴瘤组织acH3K2。
YF2的IC50在DLBCL细胞系范围为5.9～25μm（n=11），在TCL细胞系为4.4～14μm（n=6）。YF2在3个主要患者样本中诱导细胞毒性，包括一个FL患者（CREBBP和p53突变）。YF2的加入在15N富集的p300溴域的1H-15NHSQC NMR中引起了许多化学位移变动，表明结合。
YF2和romidepsin联合在11个DLBCL细胞系中有8个（6/6 EP300 突变，2/5 野生型，EOB=48）和4个TCL细胞系中有2个（EP300 野生型，EOB=28）表现出很强的协同作用。与单一药物相比，这种组合导致多组蛋白标记的乙酰化增强。
在小鼠中，YF2和romidepsin联合耐受性良好，没有体重减轻。YF2或romidepsin单药治疗可延缓肿瘤生长，但联合治疗效果更佳。联合治疗的小鼠显示出显著延长的生存率【1】。
YF2诱导HAT介导的acH3K2和Acp53。在EP300突变的DLBCL中表现出选择性的细胞毒性，在DLBCL和TCL中与romidepsin有很强的协同作用。这一联合用药表明，小鼠肿瘤生长明显延迟，提示HAT突变患者有潜在的精准治疗机会。
克服ibrutinib-venetoclax耐药
套细胞淋巴瘤（MCL）是一种侵袭性和不可治愈的非霍奇金淋巴瘤（NHL）。BTK和抗凋亡蛋白BCL-2能够促进MCL存活和进展。BTK抑制剂ibrutinib和BCL-2抑制剂venetoclax单独或联合应用已被证明是治疗MCL的有效方法。但是，单药或联合用药耐药性也经常出现，需要开发新的药物来克服这些耐药性。
通过细胞活性、细胞凋亡和细胞周期阻滞实验，研究了单用或联合应用copanlisib和volasertib的体外疗效。采用蛋白质印迹法研究药物治疗后信号通路的变化。以对ibrutinib-venetoclax双重耐药的MCL患者为研究对象，建立了原位PDX模型。
在PDX模型的小鼠中，分别给予6 mg/kg/2d的单药copanlisib、50 mg/kg/2d的idelalisib、50 mg/kg/d的ibrutinib、10 mg/kg/week的volasertib或媒剂对照，以评估其体内疗效。
数据显示PI3K-AKT信号与ibrutinib、venetoclax和双重耐药密切相关。组成性PI3K-AKT-MTOR信号克服了G2/M细胞周期检查点，促进肿瘤细胞的持续增殖。在所有的MCL细胞系中，PI3K、α、β、γ和δ的四种亚型都有表达。
与PI3Kδ特异性抑制剂idelalisib不同，copanlisib是一种针对所有PI3K亚型的泛抑制剂，被FDA批准用于治疗FL。copanlisib显著抑制ibrutinib-venetoclax双耐药PDX模型的体内肿瘤生长。
PLK1是调控G2/M转化的关键分子，通过磷酸化PTEN在PI3K/AKT信号的上游作用，导致肿瘤促进代谢状态。作为一种特殊的PLK1抑制剂，volasertib正在进行一项针对AML患者的III期临床试验。
volasertib在G2/M期显著抑制了MCL肿瘤细胞，导致细胞在较低的nM范围内凋亡。10 mg/kg/周时，volasertib显著抑制ibrutinib-venetoclax双重耐药PDX模型的体内肿瘤生长。更有趣的是，copanlisib和volasertib联合使用可诱导抗ibrutinib、抗venetoclax和抗ibrutinib-venetoclax双重耐药细胞系的协同效应【2】。
总而言之，copanlisib和volasertib是体外和体内靶向MCL细胞的有效药物，在克服MCL中ibrutinib和venetoclax耐药性方面具有巨大潜力。
药物响应和肿瘤类型
随着新一代靶向治疗的出现，突变与肿瘤表型或药物反应之间的功能关系在很大程度上仍是未知的。该研究共测量了710个来自18个血液癌的肿瘤样本对63种药物的体外敏感性，以及基因组、转录组和DNA甲基化组分析，以了解药物反应的决定因素。
化合物在DMSO中预稀释，冷冻保存的原代细胞在含有10%人AB血清的RPMI 1640培养基中培养，以1×106细胞/ml的终浓度接种在含待测药物的384孔板内。48h后利用ATP荧光测量测定细胞活性。
使用数据分析管线（R/Bioconductor Package CellHTS2）处理原始数据，使数据可视化。通过技术（n=9；R2>0.9）和生物复制（R2=0.7-0.9）证实了准确性和再现性。在该平台上共筛选出710份血液样本。从141例患者的不同临床时间点采集347份样本进行纵向调查。
为了全面了解药物反应，我们对所有患者采用分层聚类和T-SNE，发现疾病和基因型表现出不同的药物反应。IGHV状态、三体综合和单个基因突变与多种药物的药物反应相关（n>10）。p53突变与阿糖胞苷、氟达拉滨和Nutlin-3a体外治疗反应降低有关（n=321；2μm；p<0.05）。
研究确定了对包括T-PLL在内的单个淋巴瘤具有疾病特异性反应的药物。对连续样本的分析显示，大多数患者随着时间的推移药物反应稳定，但也显示，一部分接受了Idelalisib或Ibrutinib（n=16）体内治疗的患者对几种小分子抑制剂的维生素敏感性发生了变化。
BCR抑制剂治疗导致对溴域抑制剂OTX015的敏感性更高，对热休克蛋白90抑制剂Ganetespib和Onalespib的敏感性更低（均为2μm；p<0,05），这与BCR靶向介导的HSP抑制剂的活性一致【3】。
体外高通量药物筛选发现实体/基因型特定的易感性。BCR抑制剂导致药物敏感性模式的改变，可作为评价和优化联合治疗的基础。药物反应谱和组学特征数据将提供一个独特的工具来查询反应的分子决定因素，从而为临床试验提供假设。
MALT1蛋白酶抑制剂
经典核因子kappa轻链增强子激活活化B细胞（NF-κB）途径的组成性激活是B细胞淋巴瘤，特别是DLBCL的ABC亚型的明确驱动因素。粘膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1（MALT1）是经典的B细胞和T细胞受体下游NF-κB信号通路的关键介质。
MALT1具有2个功能：一个是蛋白支架功能来招募NF-κB信号蛋白，一个蛋白酶功能来切割和失活NF-κB信号通路的抑制剂。
采用高通量筛选，然后进行结构-活性迭代关系（SAR）分析，确定了一种MALT1抑制剂先导化合物。采用生物化学、体外细胞、体内肿瘤疗效和安全性模型评价这种先导化合物。
先导化合物是一种有效的、选择性的、变构的MALT1抑制剂，通过生化分析、下游细胞因子读数（IL 6/10）或直接MALT1底物裂解（RelB，BCL10）测定。该化合物抑制具有CD79b或CARD11突变的ABC-DLBCL细胞系的增殖，以及对BTK抑制剂耐药的模型。
此外，在CD79b突变细胞ABC-DLBCL模型中，当MALT1抑制剂与BTK抑制剂联合使用时，观察到协同效应。通过测试血清IL10或未剪切的BCL10水平，显示先导MALT1抑制剂导致CD79b以及CARD11突变的ABC-DLBCL模型中的体内药效动力学关闭。
另外，在两种人类DLBCL异种移植模型OCI-LY3和OCI-LY10中，MALT1先导抑制剂表现出有效的肿瘤生长抑制作用。为了研究MALT1在T细胞中的抑制作用，从正常健康志愿者身上提取的原代人T细胞在体外用MALT1抑制剂进行治疗。
在用MALT1先导抑制剂治疗后，观察到CD3/28刺激后对Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）生成的剂量依赖性抑制，表明MALT1抑制具有潜在的免疫调节作用【4】。
一期临床试验评估先导MALT1抑制剂的安全性和有效性，计划在2019年开始。这种MALT1抑制剂和BTK抑制剂的联用是一种有前景的治疗方案，可以治疗CARD11突变的BTK抑制剂耐药肿瘤。
除ABC-DLBCL外，MALT1抑制剂是治疗CLL、MCL、WM和FL患者的一个很有前景的选择，这些患者的肿瘤对BTK的抑制很敏感。以MALT1和BCL10易位为特征的MALT淋巴瘤也是抑制MALT1的另一个有吸引力的适应症。
IRAK4蛋白降解剂
ABC DLBCL约占DLBCL的45%，与GCB DLBCL相比，R-CHOP化疗的预后更差。MYD88的激活突变发生在30-40%的ABC DLBCL中；L265P是最常见的MYD88突变，引起MYDD小体的组成性组装和激活。
IRAK4激酶和支架功能对于通过MYDD小体到NFκB和MAPK通路的完全信号传导至关重要。Kymera Therapeutics疗法正在使用化学击倒策略来开发异双功能小分子IRAK4降解剂，例如KYM-001，用于治疗MYD88驱动的B细胞恶性肿瘤。
用免疫分析法或靶向质谱法对人PBMC、ABC-DLBCL细胞系和异种肿瘤移植物中的IRAK4进行定量分析。流式细胞术监测细胞活力和细胞周期。肿瘤异种移植研究是通过将人类ABC-DLBCL系植入免疫缺陷的小鼠株进行的。
KYM-001导致IRAK4的E3连接酶依赖性降解。值得注意的是，与IRAK4激酶抑制剂相比，KYM-001更有效地抑制TLR激活的MYDD小体信号传导。在MYD88 L265P突变的ABC DLBCL细胞系OCI-LY10中，IRAK4比其他超过10000种检测到的蛋白具有更高的降解选择性。
由于MYD88突变经常与B细胞恶性肿瘤的CD79突变共同发生，其研究了IRAK4降解与BTK或PI3Kδ抑制联合活性的可能性。
在具有MYD88和CD79B激活突变的OCI-LY10和TMD8细胞系中，用ibrutinib抑制BTK或用umbralisib抑制PI3Kδ，均能与KYM-001协同诱导体外细胞死亡。
KYM-001口服给药对人MYD88突变体ABC-DLBCL的几种小鼠异种移植模型在耐受剂量和时间下表现出剂量依赖性抗肿瘤活性。在OCI-LY10模型中，肿瘤消退与大于80%的IRAK4降解率相关，建立了达到最大疗效所需的药效学效应。
KYM-001和ibrutinib联合应用可使OCI-LY10和TMD8在每种药物的次优剂量下均出现肿瘤消退。在MYD88突变的DLBCL异种移植模型中，与umbralisib和其他具有DLBCL活性的药物（包括来那度胺）的联合研究正在进行中【5】。
总之，KYM-001是MYD88突变体ABC-DLBCL模型中一类、高效的、选择性的、口服活性的irak4降解剂，可导致肿瘤消退。IRAK4的降解去除了IRAK4的激酶和支架功能，可能优于单独的激酶抑制。
这些数据支持临床开发IRAK4降解物，作为MYD88驱动淋巴瘤的一个有希望的新治疗机会，无论是单独使用还是联合使用互补途径抑制剂。
靶向CD19的抗体-药物偶联（ADC）
Loncastuximab tesirine（ADCT-402）是一种抗CD19 ADC，通过蛋白酶可切割连接物与SG3199结合，SG3199是一种高度细胞毒性的DNA小槽交联吡咯苯并二氮卓二聚体（PMID 29298756）。
ADCT-402作为单药治疗复发/难治DLBCL已处于二期临床（NCT03589469），与其他药物联合处于一期临床（NCT03684694和NCT03685344）。本文进一步评估了其作为单药的临床前活性，并与淋巴瘤细胞系中批准的药物联合使用。
48个B细胞淋巴瘤患者的中位ADCT-402 IC50为4 pm（95%CI，2-10 pm），根据CD19的表达模式，9个T细胞淋巴瘤细胞系（3.5 nm；95%CI，0.8-11 nm）的中位ADCT-402 IC50高出800倍。
以B细胞淋巴瘤为研究对象，ADCT-402体外活性与其在细胞表面蛋白水平（绝对定量，n=40，r=-0.37 p= 0.02；非绝对定量，n=42，r=-0.48，p= 0.001）和RNA水平（阵列，n=39，r=-0.69 p<0.001；HTG，n=31，r=-0.73, p=0.001）测量的靶向表达相关。
在DLBCL中，BCL2和MYC易位或TP53失活并不影响对ADCT-402的敏感性。
然后将ADCT-402在GCB和ABC DLBCL细胞系中与各种药物组合，包括BCL-2抑制剂venetoclax，PI3Kδ抑制剂idelalisib，PIK3抑制剂copanlisib，蛋白酶体抑制剂bortezomib（仅ABC），BTK抑制剂ibrutinib（仅ABC），化疗药物bendamustine和PARP抑制剂olaparib。
ADCT-402与venetoclax和idelalisib联合在所有细胞系中表现协同效应，与bendamustine联合除OCI-LY-3的其他细胞系中显示出协同效应；与copanlisib（OCI-LY3和VAL），ibrutinib和olaparib（VAL和WSU-DLCL2）联合在一半细胞系表现出协同效应。
然而，在两个ABC DLBCL细胞系（TMD8，OCI-LY-3）中，在ADCT-402中添加bortezomib和lenalidomide没有发现任何优势【6】。
总之，ADCT-402的体外抗淋巴瘤活性与其靶向表达相关，支持目前复发/难治性DLBCL的临床研究。新的组合数据为进一步的临床发展提供了合理的依据。
小结
我们和大家分享的这些药物大部分是未进入临床的新药，也有进入临床但在临床前重新评价的药物（ADCT-402）。这些药物的类型也包括多种：小分子化合物、蛋白降解剂（类似PROTAC）和ADC。这些药物的发现或是为了治疗有具体基因突变的肿瘤亚型或者是解决耐药性问题。
这些临床前的评价包括单药和药物组合，而药物组合对解决特定基因突变或耐药（如ibrutinib-venetoclax双耐药）效果更佳。虽然临床前药物评价不能完全反映临床状况，但能为今后临床试验提供理论依据和指示作用。
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