论文标题：Intranasal immunization with an RBD-hemagglutinin fusion protein harnesses preexisting immunity to enhance antigenspecific responses
论文链接：DOI: 10.1172/JCI166827
研究背景
SARS-CoV-2大流行以前所未有的速度加速了疫苗的开发。几种类型的新冠肺炎疫苗，包括表达SARS-CoV-2棘突糖蛋白的RNA疫苗和腺病毒载体疫苗，提供了高效的保护，并已被广泛使用。目前，批准的新冠肺炎疫苗是肌肉注射，诱导强大的全身免疫反应，如循环抗体以及CD 4+和CD 8+T细胞，并已显示出预防严重疾病和降低死亡率的能力。许多病原体，包括SARS-CoV-2和流感病毒，在上呼吸道引发感染。然而，传统的非肠道疫苗引起较差的粘膜免疫，如上呼吸道分泌的IgA。因此，它们不能完全防止病毒感染或传播。因此，需要开发鼻腔疫苗，能够诱导机体黏膜表面的IgA和体循环中的免疫球蛋白G的免疫反应。
使用病原体衍生的蛋白质或多肽作为疫苗抗原的亚单位疫苗比其他类型的疫苗如减毒活疫苗和灭活疫苗有多个优点，这些优势包括卓越的安全性、易于生产、低成本和易于存储等。然而，由于黏膜屏障阻止抗原递送细胞(APC)，如DC、巨噬细胞和B细胞，鼻腔亚单位疫苗在诱导抗原特异性免疫反应方面效率低下。因此，虽然已经尝试开发与佐剂结合使用的鼻腔亚单位疫苗，但也存在较多的不良反应。综上所述一种无佐剂的鼻腔亚单位疫苗与增强的抗原递送将是理想的解决办法。
将抗原输送到APC是有效疫苗的关键策略。在鼻腔疫苗中，将抗原输送到APC有两个主要挑战。第一个是粘膜上皮屏障，它将抗原挡在体外。此外，即使抗原穿过第一个屏障，它们也需要被有效地递送到APC并被激活，以触发强大的抗原特异性免疫反应。然而，对于我们已经有特定抗体的抗原来说，这些障碍并不成立。最近，一些研究表明，鼻腔中的抗体，如IgA，有助于结合的抗原通过粘膜屏障。此外，免疫球蛋白Fc部分与其受体(Fcγ受体)在APC上的相互作用大大促进了APC的抗原摄取和激活。因此，利用先前感染诱导的预先存在的免疫可能是提高疫苗效力的一个极其有效的工具。例如，流感病毒感染不仅诱导全身免疫球蛋白，而且还诱导粘膜免疫球蛋白和免疫球蛋白对流感病毒表面的HA糖蛋白，许多人类成年人由于以前接触季节性流感病毒而自然地具有针对HA的抗体。因此，本研究集中在这样一个设计，即疫苗抗原与识别先前存在的抗体的载体蛋白融合在一起，可以促进通过粘膜屏障，并同时被APC摄取。
本研究中制作了RBD-HA，它是SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域(RBD)与HA的融合，作为疫苗的靶标，以测试是否可以利用HA特异性的预先存在的免疫。结果发现，在没有佐剂的情况下，用先前感染过流感病毒的小鼠鼻内免疫RBD-HA，可以通过利用HA特异性的预先存在的IgG和CD4+T细胞，诱导出强大的RBD特异性系统免疫球蛋白和粘膜IgA，RBD-HA保护上呼吸道和下呼吸道的小鼠免受SARS-CoV-2的感染。此外，可以利用肺炎链球菌感染诱导的预先存在的免疫和可注射的mRNA疫苗，这表明疫苗系统具有很高的通用性。因此，我们提出了一种无佐剂鼻腔疫苗平台，可以诱导强大的系统和粘膜保护性免疫。
研究结果
结果1：无佐剂RBD-HA鼻腔疫苗诱导抗原特异性的系统免疫球蛋白和粘膜免疫球蛋白A。
在整个研究过程中，作者使用了7μL的疫苗抗原作为鼻腔疫苗的模型，免疫每只小鼠的上呼吸道。为了评估预先存在的免疫是否可以作为疫苗抗原的载体，将RBD作为靶抗原与HA融合，在真核系统中表达RBD-HA并进行纯化。BALB/c小鼠上呼吸道感染甲型流感病毒(IAV)，在IAV感染后30天和51天，幼鼠或IAV-小鼠在没有佐剂的情况下用RBD-HA鼻腔免疫(图1A)。
作为阳性对照组，用RBD加环二GMP(c-di-GMP)免疫IAV-小鼠，c-di-GMP在动物实验中用作疫苗佐剂。为了与注射疫苗进行比较，用RBD加明矾皮下免疫IAV-小鼠。结果发现，在初次免疫后第14天，RBD-HA滴鼻免疫IAV小鼠可诱导出血浆中RBD特异的IgG，但在鼻内注射RBD-HA的初生鼠中未诱导出RBD特异性IgG(图1B)。此外，在初次免疫后14天，RBD-HA滴鼻免疫的IAV小鼠的血浆RBD特异性IgG水平显著高于PBS、RBD加c-di-GMP或scRBD-明矾治疗的IAV小鼠(图1B)。加强免疫7天后，用RBD-HA免疫的IAV小鼠的RBD特异性免疫球蛋白水平显著高于用RBD加c-di-GMP免疫的IAV小鼠(图1C)。在加强免疫后14天，RBD-HA免疫的IAV小鼠的鼻腔冲洗液中RBD特异性IgA水平显著高于RBD加c-di-GMP免疫的IAV小鼠(图1D)。相反，单独用RBD免疫的IAV小鼠并没有在鼻腔冲洗中诱导RBD特异性IgA的产生，这表明我们的疫苗效力不依赖于IAV感染对黏膜免疫耐受性的破坏。
一些研究表明，疫苗抗原与抗体Fc结构域的融合可以增强免疫反应。因此，为了比较RBD-HA和Fc融合抗原，用RBD-HA、RBD-Fc(IgG)或RBD-Fc(IgA)免疫IAV-小鼠，而不加佐剂(图1E)。我们发现，在加强免疫14天后，经鼻免疫RBDHA的IAV小鼠的RBD特异性IgA水平显著高于RBD-Fc(免疫球蛋白G)和RBD-Fc(IgA)免疫的小鼠(图1F)。这些结果表明，该鼻腔疫苗平台优于传统的FC融合策略。
结果2：鼻腔接种RBD-HA可预防上呼吸道和下呼吸道感染SARSCoV-2。
为了评估RBDHA免疫诱导的抗体的中和活性，我们使用了显示SARS-CoV-2的Alpha、Delta或Omicron尖峰的假型病毒。用RBD-HA免疫的IAV小鼠的鼻液中和了Alpha和所有其他假型病毒(图2，A-C)。即使在最低稀释度下，从scRBD-明矾中提取的鼻液也不能中和任何假型病毒，反映了针对RBD的IgA应答水平(图2，A-C)。
此外，作者还评估了RBD-HA诱导的免疫应答是否对SARS-CoV-2感染具有保护作用。上呼吸道感染后用RBD-HA免疫的IAV小鼠的病毒滴度显著低于用PBS和scRBD-明矾免疫的IAV小鼠，与RBD+c-di-GMP免疫的病毒滴度相当(图2D)。由于下呼吸道感染，经PBS处理的初生鼠和经PBS或RBD+c-di-GMP免疫的IAV鼠在攻击后体重下降(图2E)。特别是，经PBS处理的幼鼠和经PBS处理的IAV小鼠的存活率分别约为60%和40%(图2F)。所有服用RBD-HA和scRBD-明矾的小鼠都完全避免了体重减轻或因下呼吸道感染而死亡(图2，E和F)。为了进一步评价RBD-HA诱导的抗体对SARS-CoV-2感染的保护作用，将RBDHA免疫的IAV小鼠的血清(RBD-HA-血清)转移给幼龄小鼠，然后攻击下呼吸道感染。尽管在SARS-CoV-2攻击后，用从幼鼠采集的血清(幼虫血清)的小鼠体重下降，但用转移的RBD-HA血清的小鼠的体重保持不变(图2G)。这些结果表明，尽管没有佐剂，鼻腔接种RBD-HA疫苗仍可通过诱导抗体提供足够的保护。
结果3：RBD-HA诱导的抗体可维持较长时间。
接下来，作者评估了RBD-HA诱导的抗体的持久性。在加强免疫后，经RBD-HA鼻腔免疫的IAV小鼠血浆中RBD特异性免疫球蛋白水平可维持约6个月(图3A)。然而，在加强免疫4个月后，RBD加c-diGMP免疫的IAV小鼠的血浆RBD特异性IgG水平显著低于RBD-HA免疫的IAV小鼠(图3A)。此外，在加强免疫6个月后，用RBD-HA免疫的IAV小鼠的鼻液中RBD特异性IgA水平显著高于用RBD+c-diGMP免疫的IAV小鼠(图3B)。这些结果表明，我们的疫苗策略可以诱导持久抗体。
接下来，又评估了RBD-HA是否能在IAV感染后很长一段时间内诱导小鼠RBD特异性黏膜IgA和系统免疫球蛋白G。分别于感染后175天和196天用RBD-HA和RBD+c-di-GMP滴鼻免疫IAV小鼠。结果表明，与未感染的小鼠相比，IAV-小鼠体内的HA特异性免疫球蛋白在感染后112天或140天一直升高，随后达到平衡(图3C)。与RBD+c-di-GMP免疫的IAV小鼠相比，RBD-HA免疫的IAV小鼠在免疫后14天和加强免疫后7天的HA特异性免疫球蛋白水平显著升高(图3C)。此外，我们还发现，经鼻注射RBD-HA的IAV组小鼠的血浆中RBD特异性IgG和鼻腔冲洗液中的IgA水平显著高于接受RBD加c-di-GMP治疗的IAV组小鼠(图3，D和E)。因此，这些结果表明，即使在IAV感染后的较长时间内，RBD-HA也能够在小鼠体内诱导强大的粘膜IgA和系统免疫球蛋白反应。
结果4：血液中预先存在的HA特异性抗体参与了RBD-HA鼻腔免疫诱导的免疫应答。
为了观察树突状细胞对抗原的摄取，将EGFP-HA滴鼻给IAV小鼠。用EGFP-HA免疫6小时后，IAV小鼠鼻腔内树突状细胞中检测到的EGFP信号比未感染的小鼠多(图4，A和B)。此外，在免疫24小时后，与未接种EGFP-HA的幼鼠相比，EGFP-HA诱导IAV-小鼠NALT树突状细胞上共刺激分子CD86的表达增强(图4，C和D)。这些结果表明，预先存在的免疫促进了抗原的摄取，并进一步激活了DC。
作者假设，树突状细胞对抗原摄取的增强是通过HA特异性抗体来实现的。因此，为了检测预先存在的抗HA抗体在RBD-HA诱导的免疫应答中的重要性，用RBD-HA和HA联合免疫IAV-小鼠，以与先前存在的HA特异性抗体竞争。以RBD-HA+OVA免疫IAV小鼠作为对照组。与RBD-HA或RBD-HA+OVA相比，RBD-HA+HA免疫IAV小鼠的RBD特异性IgG显著降低(图4E)。为了进一步阐明HA特异性预先存在的免疫球蛋白的作用，在RBD-HA免疫前24小时，将2毫克纯化的IAV-IgG注射到幼鼠体内，以模拟IAV感染诱导的血液中HA特异性抗体的水平(图4H)。此外，在注射后24小时的鼻液中检测到了HA特异性的免疫球蛋白，这表明血液中循环的IAV-免疫球蛋白已经进入鼻腔(图4I)。在RBD-HA初次免疫和加强免疫后，经IAV-Ig G预处理的小鼠血浆中RBD特异性Ig G显著高于未经NAIVE-Ig G处理的小鼠。此外，在用RBD-HA加强免疫后，用2 mg IAV-Ig G预处理的小鼠鼻腔冲洗液中的RBD特异性IgA显著高于用naive-Ig G预处理的小鼠(图4J)。这些数据表明，HA特异的预先存在的免疫球蛋白能充分促进RBD特异性黏膜免疫球蛋白A和鼻腔注射RBD-HA疫苗诱导的系统免疫球蛋白的产生。
结果5：鼻腔内HA特异性免疫球蛋白参与了RBD-HA鼻腔免疫的免疫应答
为了评估鼻腔中预先存在的HA特异性抗体(如免疫球蛋白G和免疫球蛋白A)的作用，在幼鼠身上进行了RBD-HA和IAV-小鼠鼻液(IAV-NW)的鼻腔联合给药。在接受RBD-HA和IAV-NW混合物的小鼠中没有检测到RBD特异性IgA(图5A)。相反，我们发现IAV-NW增强了经0.5 mg IAV-Ig G预先处理的小鼠鼻腔中RBD特异性IgA；然而，IAV-Ig G本身的数量不足以增强鼻腔中RBD特异性IgA(图5A)。这些结果表明，鼻腔中的HA特异性抗体可以在血液中存在HA特异性抗体的情况下，增强鼻腔内RBD-HA诱导的免疫应答。此外，为了评估免疫球蛋白在鼻腔内的参与情况，我们进行了rBD-HA和IAV-Ig G的鼻腔联合给药试验。我们观察到，与RBD-HA和NAIVE-Ig G共用组小鼠相比，IAV-Ig G显著促进RBD-HA和IAV-Ig G共用组小鼠鼻冲洗液中RBD特异性IgA的产生(图5B)。这些结果表明，在我们的RBD-HA鼻腔疫苗系统中，循环和鼻腔中IAV-Ig G的存在协同促进了RBD特异性抗体的诱导。
此外，我们使用了IgA基因敲除小鼠(IgA-/-)来评估鼻腔中存在的IgA的参与情况。我们证实，在IAV感染后28天，在IgA-/-小鼠中没有检测到HA特异性的IgA，而血浆中HA-特异性的免疫球蛋白与对照的IgA杂合子(IgA+/-)和IgA-/-小鼠(图5，C和D)没有显著差异。在IAV感染后30天和51天，用RBD-HA滴鼻免疫感染IAV的IgA+/-和IgA-/-小鼠。在RBD-HA加强免疫后7天，IAV感染的IgA+/-和IgA-/-小鼠血浆中RBD-HA诱导的RBD特异性免疫球蛋白水平无显著差异(图5E)。考虑到这些结果，很可能IAV-NW和RBD-HA混合给药所引起的增强免疫反应是由鼻腔冲洗液中存在的免疫球蛋白G而不是免疫球蛋白A介导的。
结果6：HA特异性的CD4+T细胞参与了RBD-HA鼻腔免疫诱导的免疫应答。
IAV感染不仅能诱导HA特异性抗体，还能诱导HA特异性CD4+T细胞的产生。小鼠在114天内恢复了幼稚的CD4+T细胞，与幼稚的小鼠一样多(图6B)。
在IAV感染后116天和137天，用RBD-HA滴鼻免疫小鼠。我们观察到α组小鼠血浆中的RBD特异性Ig G和鼻腔冲洗液中的Ig A水平显著低于同型Ig G组(图6，C-E)。这些结果表明，HA特异性记忆CD4+T细胞有助于增强RBD-HA鼻腔免疫IAV小鼠的免疫应答。
结果7：鼻腔疫苗平台是非常通用的。
为了证实该鼻腔疫苗平台针对不同类型抗原的通用性，将HA与SARS-CoV-2来源的Spike的N-末端结构域(NTD)、肺炎链球菌来源的肺炎球菌表面蛋白A(PSPA)或来自RSV的主要表面G糖蛋白(G)的保守中心区域融合在一起。用无佐剂的NTD-HA、PSPA-HA或G-HA滴鼻免疫IAV小鼠两次。结果发现，用NTD-HA、PSPA-HA或G-HA免疫的IAV小鼠的血浆中抗原特异性IgG和鼻腔冲洗液中的IgA显著高于未免疫的小鼠(图7，A-C)。
此外，加强免疫后，IAV小鼠攻击肺炎链球菌感染。用PSPA-HA免疫的IAV小鼠完全避免体重减轻或死亡(图7、D和E)。
进一步评估是否可以利用其他先前存在的免疫以及HA特异性免疫。为了确定肺炎链球菌感染诱导的PSPA特异性预先存在的免疫能否被用来增强免疫应答，将一个RBD作为靶抗原与PSPA融合。在上呼吸道感染肺炎链球菌后的30天和51天，用不含佐剂的RBD-PSPA鼻腔免疫小鼠(图7F)。加强免疫后，我们发现接受RBD-PSPA鼻腔注射的肺炎链球菌感染小鼠鼻腔冲洗液中RBD特异性IgA水平和血浆中IgG水平显著高于其他组(图7G)。这些结果表明，该鼻腔疫苗平台具有很强的通用性。
随着SARS-CoV-2病毒的出现，许多人已经接种了mRNA疫苗，并产生了刺激性抗体和CD4+T细胞。因此，为确定是否可以利用由mRNA疫苗诱导的先前存在的免疫。免疫后30天和51天，分别用1μg编码SARSCoV-2尖峰的mRNA2次免疫(mRNA鼠)，用无佐剂、pBS或HA+c-di-GMP的rBD-HA滴鼻免疫小鼠(图7H)。结果发现在加强免疫后7天，信使核糖核酸疫苗在血浆中诱导的刺激性免疫球蛋白水平显著高于未免疫的幼鼠，鼻腔注射RBD-HA的小鼠鼻腔冲洗液中HA特异性IgA水平显著高于RBD-HA免疫的幼鼠(图7I)。这与HA加c-di-GMP的结果相当(图7I)。
结论
在这项研究中，作者证明了鼻腔接种RBD-HA不使用任何佐剂的情况下，在IAV小鼠中诱导了强大的粘膜和系统免疫反应。结果显示，预先存在的免疫球蛋白足以通过RBD-HA诱导RBD特异性抗体，这表明预先存在的免疫球蛋白对我们的鼻腔疫苗平台非常重要。经0.5 mg IAV-Ig G处理的小鼠鼻内联合应用RBD-HA和IAV-Ig G可增强RBD特异性黏膜免疫球蛋白A。此外，数据显示一些系统治疗的免疫球蛋白到达鼻腔。
另外作者发现，在血液中没有IAV-Ig G的情况下，RBDHA和IAV-NW鼻腔联合给药不能诱导免疫反应。这一结果表明，循环中的免疫球蛋白除了向鼻腔供应免疫球蛋白外，还具有诱导免疫反应的其他作用。结果表明，在体外，IAV-Ig G可促进DC对抗原的摄取和活化。并通过粘膜上皮的抗原与NALT和血液中的IgG形成免疫复合物，从而促进抗原被DC摄取并进一步激活它们。
进一步证明RBD-HA鼻腔接种后，在IAV感染的小鼠中，IgA不是诱导RBD特异性IgG所必需的。评估了在免疫球蛋白充分存在以诱导RBD-HA免疫反应的条件下，IgA的参与情况。当免疫球蛋白水平不足以诱导免疫反应时，免疫球蛋白A可能有助于诱导免疫反应；然而，还需要进一步的研究。
本研究通过CD4+T细胞耗竭实验证实了HA特异性的预先存在的CD4+T细胞在增强免疫反应中的重要性。结果表明，HA与RBD融合可能作为IAV小鼠的载体蛋白，并增强针对RBD的抗体产生。本研究还使用了单体SPEKE-HA，与三聚体刺激物相比，单体刺激物的免疫原性一般较低。结果表明，由单体Spike组成的Spike-HA诱导的抗体具有很强的中和活性，表明Spike-HA具有足够的免疫原性来诱导免疫应答。然而，Spike-HA和RBD-HA都使用单体HA作为载体蛋白。因此，在未来的研究中，含有三聚体HA的RBD-HA可能是更有效地预防SARS-CoV-2和流感病毒的更好的选择。
作者证明RBD-HA诱导的HA特异性抗体与预处理的mRNA疫苗的剂量及其诱导的刺激性免疫球蛋白相关。如图3C所示，RBDHA免疫不仅增加了对新引入的疫苗抗原(即RBD)的抗体，而且增加了对用作载体的HA的抗体。这表明，本研究中的几剂疫苗可以在对携带者先前存在的免疫力较低的人身上发挥作用，因为针对携带者蛋白的抗体也可以增强。综上所述这项研究为鼻腔疫苗平台利用先前存在的免疫来激发免疫反应的机制提供了重要的见解。 

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