2023诺贝尔生理学或医学奖背后：疫情之初，mRNA疫苗的位置

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拿诺贝尔奖的技术原来也曾不被看重

昨天下午5点45分，20203年诺贝尔生理学或医学奖开奖。Katalin Karikó 和 Drew Weissman因为他们研发的mRNA技术，推动COVID-19 的 mRNA 疫苗发展而获奖。

他们的发现促使两种基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗于 2020 年底获得批准。这些疫苗在最近100年间人类面临的最艰巨的流行病挑战——新型冠状病毒肺炎大流行中挽救了数百万人的生命，并预防了更多人的严重疾病。

在新冠疫情爆发之初，疫苗与特效药是公认的唯二能够真正终止大流行的存在。然而特效药的研发周期之长，令科学界对它不报多少希望。故，如何制定一个安全有效的疫苗策略则成为了科学界探寻的重点。2020年9月4日，加拿大麦克马斯特免疫学研究中心的Mangalakumari Jeyanathan及其团队在Nature reviews Immunology（IF=100.3）上发表了题为《Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies（新冠疫苗研发策略的免疫学思考）》，研究了当时新冠候选疫苗的优势和潜在不足，并讨论了在开发成功的疫苗过程中会面临的科学和实际挑战，以及新冠疫苗战略在未来几年可能的演变方式。

我们可以通过这篇文章一窥，在新冠大流行之初，mRNA技术在新冠疫苗研发中的位置。

摘要

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)大流行由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起，是一个世纪以来人类所面临过的最严峻挑战。人们普遍认为，只有研发出安全有效的疫苗，并成功实施全球疫苗接种计划，社会才能回到疫情前的正常状态。本文将讨论研制新冠疫苗时需要考虑的免疫学原理，再根据这些原理探索当前新冠候选疫苗的优势和潜在不足，并推断其成功的可能性。最后，作者还讨论了研制有效疫苗过程中会面临的理论上和实践上的挑战，以及新冠疫苗研发策略在未来几年内可能的方向。

简介

2019年末，中国武汉首次报告了新冠疫情。在作者撰写本文时，此轮疫情已传播到216个国家和地区，世界就此陷入停滞。新冠在全球范围内已至少感染了2010万人，造成了73.7万多人死亡，并仍在持续传播。尽管在当前大流行期间，大多数国家通过物理隔离和其他阻断传播的一些措施保护了大多数公民免受感染，但矛盾的是，这些措施会使民众对SARS-CoV-2没有免疫力，导致其更容易受到感染的影响。特别是医务人员、老年人和有潜在健康风险的人，他们被感染的可能性更大。人们普遍认为，只有研发出安全有效的疫苗，并成功实施全球疫苗接种计划，社会才能回到疫情前的正常状态。

由于新冠对人类来说是一种新病毒，人们对其导致的保护性免疫反应的性质知之甚少，目前尚不清楚哪种疫苗研发策略是最有效的。因此，我们必须同步对各种疫苗类型和疫苗策略开展研究。自疫情爆发以来，世界各地的研究人员一直在竞相研发新冠疫苗，目前至少有166种候选疫苗正在进行临床前或临床实验（图1）。为了满足疫苗的迫切需要，一种新的大流行疫苗开发模式被提出，以便将疫苗研发的时间表从10-15年缩短到1-2年。然而很多问题仍然有待解决，比如什么可能构成安全和有效免疫的新冠疫苗策略，如何定义疫苗的效能，以及未来几年全球疫苗工作是什么方向。本文概述了设计新冠疫苗研发策略的免疫学指导原则并分析了当前新冠疫苗的前景和面临的挑战。

自然免疫和疫苗诱导的免疫

虽然对于SARS-CoV-2的免疫反应还有很多不清楚的地方，并且由于病毒的免疫逃逸机制，疫苗诱导的保护性免疫在一定程度上也不同于自然免疫。但加深对自然免疫的理解将有助于开发有效的疫苗和治疗策略。了解无症状感染者、轻症患者、重症患者在感染早期和晚期的免疫反应差异，以及老年人较年轻人更易感新冠的原因，对我们的研究尤为重要。通过有效数据统计，40-75%的感染者可能是轻微或无症状的，无症状感染者较有症状感染者来说，病毒排出时间长得多。此外，无症状感染者和轻症患者可能存在低水平的抗体介导免疫，这对探索群体性免疫具有重要意义。

SARS-CoV-2的初始感染部位是呼吸道，其入侵时通过棘突蛋白受体结合域（RBD）与支气管和肺泡上皮细胞上的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体相互作用，该蛋白受体结合域随后由跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）激活，从而使SARS-CoV-2进入细胞。通过单细胞RNA测序对编码ACE2和TMPRSS2的转录本进行分析，结果表明，这些转录本在各种细胞类型中共同表达。通过对感染者尸检发现，在包括肺、咽、心、肝、脑和肾等多个器官中均能检测到SARS-CoV-2的存在。

图1：全球新冠疫苗的发展情况

先天免疫反应

最新证据表明，SARS-CoV-2的免疫反应在某些方面与SARS病毒或中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的免疫反应相似。上述两种冠状病毒分别导致了2002-2004流行源于中国的SARS疫情，和2012年源于沙特阿拉伯的MERS疫情。与SARS-CoV和MERS-CoV一样，SARS-CoV-2不仅抑制了包括树突状细胞在内的固有免疫系统的激活，还抑制了抗病毒I型和III型干扰素反应。与普通流感1-4天的潜伏期相比，新冠的潜伏期或症状前期延长至2-12天，这可能是由于SARS-CoV-2具有破坏先天免疫反应的能力。先天免疫抑制导致感染早期SARS-CoV-2不受控制地进行复制，这可能就是新冠患者炎症反应失调的基础。这个过程在重症患者中尤其明显。重症患者的特征是血液中炎性单核细胞和中性粒细胞的数量显著增加，气道中CD14⁺ 、CD16⁺单核细胞衍生的巨噬细胞增加，以及体内炎性细胞因子和趋化因子整体增加。如果早期未能及时控制呼吸道内SARS-CoV-2的入侵，在一定程度上可能导致患者体内病毒高负荷，并且诱导失调且潜在致命的炎症反应和免疫反应发生（包括急性呼吸窘迫综合征）。出于这个原因，老年人和相关合并症患者的免疫衰老和过度炎症反应将导致他们更易感染新冠。除了后文将会讨论的疫苗诱导适应性免疫外，在新冠疫苗设计中纳入最近出现的训练免疫的概念（方框1）或将进一步加强免疫保护，尤其是在感染的早期阶段。

方框1| 训练免疫作为潜在的新冠疫苗策略

先天免疫记忆（也称为训练免疫）最近被公认为会影响疫苗策略的免疫记忆组成部分。除了病原体特异性适应性免疫记忆外，几种减毒活疫苗可诱使训练免疫介导对异源感染的非特异性保护反应。抗结核的卡介苗（BCG）是可以诱导训练免疫的人类疫苗中被研究得最透彻的。卡介苗接种通过骨髓中髓系祖细胞的表观遗传和代谢重组，将训练免疫的特征赋予循环单核细胞，这些单核细胞会增强对异源性感染的保护，包括呼吸道病毒感染。因此，卡介苗在一定程度可能可以对新冠感染（COVID-19）提供保护。卡介苗接种率与COVID-19死亡率负相关的调查结果也支持这一观点。目前正在通过几项临床试验评估卡介苗或麻疹疫苗接种对新冠的影响。

一种可诱导训练免疫的新冠疫苗可能通过克服病毒施加的先天免疫抑制和促进适应性免疫激活来加强对病毒的早期控制。在新冠后期，巨噬细胞过度产生细胞因子可能会导致病态免疫，因此尽早强化训练免疫非常重要。尽管如何最好地利用训练免疫来实施新冠疫苗策略仍有待研究，但最新证据表明，微生物暴露或接种的途径决定了训练免疫的组织分布。由于呼吸道粘膜免疫是早期清除SArS-cov-2的关键，因此通过鼻喷接种疫苗的方式诱导肺泡巨噬细胞和其他先天免疫细胞的训练免疫可能是一种有效的策略。运转到呼吸道粘膜的人血清型5腺病毒载体疫苗可以诱导记忆性肺泡巨噬细胞去提高人体对异种感染的免疫力。然而，尚不清楚在SArS-cov-2的免疫应答中，肺泡记忆巨噬细胞是否会被炎性单核细胞替代。

抗体反应

大多数感染者在症状出现后1-2周内可检测到SARS-CoV-2的IgM和IgG抗体。尽管中和抗体和抗原特异性T细胞与疾病严重程度和临床结果之间的关系仍有待了解，但在康复者体内可观察到与T细胞免疫应答相关的高滴度的中和抗体，尤其是CD4⁺T细胞的应答，这在某种程度上为研究恢复期血浆治疗提供了助力。最新研究表明，中和抗体反应的程度与疾病严重程度呈正相关。因此，尽管大多数感染SARS-CoV-2的人在感染后数周内抗体应答减弱（这也是其他“普通感冒”冠状病毒的抗体应答的特征），无症状感染者的中和抗体反应的程度比有症状感染者小且下降得更快。

冠状病毒中和抗体的主要靶点是S蛋白，它由S1和S2结构域组成。S1在远侧膜，含有与细胞受体ACE2结合的RBD，S2在近侧膜，在膜融合中发挥作用。SARS-CoV和SARS-CoV-2的S蛋白具有88%的同源性，均以高亲和力与ACE2结合。某些针对SARS-CoV S蛋白的单克隆和多克隆抗体可以交叉中和SARS-CoV-2。与S1 RBD结合的抗体阻断其与ACE2的相互作用，而与S1和S2的其他区域结合的抗体可以分别抑制S蛋白的构象变化并阻断膜融合。

在对SARS-CoV-2的自然免疫反应期间，也会产生针对核蛋白（N）的高滴度抗体，而核蛋白是最丰富的病毒蛋白。尽管抗N抗体不太可能中和病毒，但有报道发现它们可以预防小鼠肝炎病毒（一种小鼠冠状病毒）。值得注意的是，这些抗体是IgG2a，这表明它们可能是通过Fc介导的效应功能发挥保护作用，而不是通过直接的病毒中和。另外几项研究报告表明，比起IgM，IgA对S蛋白的反应更早达到峰值且更明显，这使得IgA成为基于抗体诊断分析的一个热门研究靶点。目前对于早期诱导S-特异性IgA的机制基础尚不清楚。

我们对SARS-CoV-2的抗体反应的持久性有待研究。此前对SARS感染者的纵向研究发现，在感染后1-2年内其中和抗体滴度显著下降。这与经典研究中展示的季节性冠状病毒229E抗体快速下降的现象相一致。目前尚未发现对SARS-CoV-2或其他人类冠状病毒具有保护作用的免疫相关性，因此，何种滴度的中和抗体能够提供抗感染保护也尚不清楚。建立这种相关性对于指导开发有效的新冠疫苗至关重要。

T细胞介导的免疫

有效的人类抗病毒疫苗（如流感和麻疹疫苗）很大程度上取决于抗体反应的诱导，但新的证据表明，抵御SARS-CoV-2有赖于抗体介导和T细胞介导免疫的共同作用。众所周知，CD4+ T细胞的协助对于优化抗体反应和在宿主防御中激活CD8+ T细胞非常重要。此外，中和抗体保护的漏洞有赖于细胞毒性CD8+ T细胞对病毒的清除。研究发现，在100%的新冠康复者血液中存在S蛋白特异性CD4+ T细胞，70%的康复者血液中存在S蛋白特异性CD8+ T细胞，另有临床前研究发现T细胞在宿主防御SARS-CoV中具有保护作用。

就像SARS和MERS一样，SARS-CoV-2感染后2-12天的潜伏期或症状前期不仅与病毒介导的先天免疫抑制有关，而且与T细胞（特别是CD8+ T细胞）延迟激活也有关系。新冠康复者可能具有高水平的中和抗体和T细胞，并且轻症患者较重症患者在呼吸道中有更多的记忆性CD8+ T细胞。有证据表明，肺组织驻留记忆T细胞的诱导将取决于疫苗接种的途径。鼻喷疫苗接种可诱导强烈的肺TRM细胞反应，而静脉疫苗接种则不能做到这点。实验证明鼻喷疫苗诱导的气道TRM细胞对阻止SARS-CoV感染提供了强有力的保护。

疫苗诱导的辅助性T细胞表型也与其介导的保护作用有关。加速诱导T_H1细胞反应与SARS轻症患者有关，而TH2细胞反应与接种灭活SARS疫苗的宿主后肺部疾病的加重有关。因此，新冠疫苗诱导的TRM细胞应具有TH1细胞表型。

上述这些证据，再加上疫苗保护相关性数据表明在老年人中T细胞介导的免疫反应比起抗体滴度检测更可靠，大大加强了应该将T细胞反应纳入新冠疫苗设计的论点。

先存在的交叉反应性

最新的证据表明，未暴露于SARS-CoV-2的健康个体中，35%个体的CD4⁺T细胞识别SARS-CoV-2 病毒S蛋白，40-60%个体的CD4⁺T细胞对除S蛋白以外的SARS-CoV-2蛋白反应。这表明SARS-CoV-2特异性CD4⁺T细胞与人类常见感冒冠状病毒、SARS-CoV和动物β-冠状病毒特异性CD4⁺T细胞之间存在交叉反应。四种人类冠状病毒（229E、NL63、OC43和HKU1）约占人类常见感冒的15%。成年人可能平均每2-3年感染一次四种病毒之一，因此这些人在一定程度上对SARS-CoV-2抗原预先存有交叉反应性免疫，这可能解释了SARS-CoV-2感染易感性的差异。除了了解这种预先存在的人类冠状病毒免疫与宿主防御SARS-CoV-2感染之间的关系外，还必须考虑新冠疫苗增强的交叉反应免疫反应对疫苗诱导的保护性免疫的贡献。

重要的是，来自新冠患者的CD4⁺T细胞同时识别SARS-CoV-2的S1和S2亚单位，而来自未暴露个体的交叉反应性CD4⁺T细胞识别S2亚单位。新冠患者的CD4⁺T细胞与人冠状病毒OC43和229E的S2亚单位发生强烈交叉反应。健康的成年受试者中超过90%的个体具有针对四种人类常见感冒冠状病毒的IgG抗体。无论如何，与SARS-CoV和SARS-CoV-2的抗体反应类似，人类冠状病毒的抗体反应在感染后数月内迅速减弱。因此，控制人类冠状病毒再感染似乎主要依赖的是T细胞而不是抗体。

由于冠状病毒交叉反应性T细胞对结构和非结构病毒蛋白都具有特异性，目前仅基于S蛋白的大多数蛋白亚基和重组病毒载体的新冠疫苗诱导的疫苗增强交叉反应性T细胞反应的程度，将不同于多价新冠疫苗（例如基于灭活SARS-CoV-2病毒的疫苗）。但接种SARS-CoV-2减毒活疫苗可能有所不同，因为预先存在的交叉反应免疫可能会限制此类疫苗的效力。由于一些个体存在显著交叉免疫，所以需要根据接种新冠候选疫苗的临床受试者先前存在的冠状病毒免疫状态进行分层。

方框2| 新冠疫苗的安全注意事项

由于大多数新冠患者是无症状感染者或仅出现轻微症状，新冠疫苗正朝着全球大规模免疫的最终目标发展，疫苗的安全性至关重要。任何不安全因素都可能加剧反疫苗运动并增加大众对接种疫苗的忧虑，这也不利于实现群体免疫的预期效果。在这方面，目前的大多数新冠疫苗临床试验最初都是在55岁或55岁以下的健康成年人中进行的，仅少数的后期试验包含老年受试者。而高度易感的老年人和体质较弱者特别需要高度安全和有效的疫苗。目前尚不清楚最初试验的新冠疫苗在短期和长期内是否对幼儿和老年人安全，因此，想要保护老年人，可能仍需要另外一种被证明安全有效的疫苗策略。

疫苗的安全性通常取决于疫苗类型的性质、佐剂的选择、疫苗接种的方式和途径、接种者的年龄和现有疫苗的免疫状况。例如，减毒活病毒疫苗或病毒载体疫苗可能不适用鼻喷接种途径，某些免疫佐剂（如明矾和细菌衍生的蛋白质）也同样不适用于这种方法。这导致强化免疫之后，不良事件通常更频繁、更严重。新冠疫苗策略需要像其他呼吸道病毒感染一样作更多安全考虑，例如ADE效应的增强以及在肺部免疫反应中的促炎细胞因子过度分泌，后者与鼻喷疫苗策略的应用尤为相关。

疾病的抗体依赖性增强

中和抗体滴度不足可能会诱导疾病的抗体依赖性增强（ADE），这是开发安全有效的新冠疫苗的一个潜在障碍（方框2）。ADE最典型例子是登革热病毒，其中针对一种病毒血清型的亚中和滴度水平的抗体的交叉反应会增强携带Fcγ受体的细胞（包括巨噬细胞）被另一血清型感染的几率。引起ADE的病毒有一个共同特性，就是它们能够在巨噬细胞中复制和/或导致其异常反应。虽然巨噬细胞似乎不是SARS-CoV-2感染的主要靶点，并且ACE2在不同单核细胞和巨噬细胞群体上的表达高度可变，但先前关于SARS-CoV的数据表明，FcγRs可以协助病毒进入巨噬细胞和B细胞。SARS-CoV-2患者的细胞因子前体类似于巨噬细胞激活综合征患者的细胞因子前体，其特征是高水平的炎性细胞因子和趋化因子。另有报道称，有症状的新冠患者产生岩藻糖基化水平降低的IgG抗体，这反向促进了他们与激活的FcγRIIIa的相互作用。

SARS感染背景下ADE的研究证据是视情况而定的。已有报道称，抗体滴度与感染严重程度之间存在相关性，但尚不清楚高抗体滴度是否会导致疾病，或严重感染是否会引起更高的抗体滴度。此外，用SARS患者血清在体外处理巨噬细胞后，巨噬细胞会具有放大的炎性细胞因子谱。

在一些接种SARS疫苗的临床前实验动物模型中发现了ADE。用表达全长S蛋白的改良安卡拉痘苗病毒（MVA）疫苗对雪貂进行接种后，后续的感染率和肝炎发病率增加。通过组织学检查发现，S蛋白抗体可诱导实验感染猕猴的急性肺损伤。相比之下，虽然SARS重组全长S蛋白抗体能够通过FcγRII协助SARS冠状病毒进入B细胞，但是接种该疫苗的仓鼠得到免疫保护。

SARS-CoV-2感染的情况下是否会发生ADE尚不清楚，但仍需要进一步研究抗体是否会加重疾病严重程度，如果是，还需要描述这些抗体的特性。似乎很清楚的是，高滴度的中和抗体可以介导保护作用。未来尽量避免ADE发生，需要确定具有保护作用的中和抗体的滴度，确保新冠疫苗能够达到这些滴度，并通过重复给量避免抗体减弱到亚中和水平。合理设计的新冠疫苗，将降低ADE的发生率，并通过添加非中和/或弱中和的表位，有利于已知的介导保护性反应的表位发挥作用，从而最小化疾病发生的可能性。最后，来自登革热病毒感染小鼠模型的证据表明，抗病毒T细胞有助于抑制ADE发生。因此，旨在诱导中和抗体和强大的T细胞介导免疫的疫苗策略可能有助于降低ADE的风险。

疫苗设计

疫苗设计涉及抗原的选择、疫苗类型、疫苗接种途径和方案。疫苗类型的选择决定了疫苗病毒抗原的免疫原性强度、是否需要免疫佐剂以及保护性免疫的性质。这些属性还决定了疫苗对特定接种途径的适用性，以及是否需要一种主要的增强免疫方案来提高疫苗介导的保护性免疫及其持久性。此外，选择减毒活病毒疫苗或鼻喷疫苗接种途径将需要更严格的安全测试（方框2）。

SARS-CoV-2抗原的选择

感染性病毒粒子中存在的结构蛋白包括S蛋白、N蛋白、基质（M）蛋白和包膜（E）蛋白。N蛋白包裹着大的正链RNA基因组，该基因组包裹在来自宿主细胞膜的脂质包膜中，其他三种蛋白质（S、M和E）插入其中。就SARS冠状病毒而言，已经证明，只有针对S蛋白的抗体才能中和病毒并预防感染。因此，所有正在开发的新冠疫苗都至少包含一部分S蛋白，而这部分S蛋白可能仅限于S1结构域或RBD结构域。

针对S蛋白和其他暴露蛋白（E和M）的非中和抗体的产生，由于这些非中和抗体以及弱中和抗体与ADE的发生相关，所以将其他结构蛋白和/或非结构蛋白作为疫苗抗原可能有助于产生包括体液和T细胞介导的免疫在内更平衡的免疫反应。疫苗设计中可以考虑高表达蛋白的利用（如N蛋白或在病毒生命周期中起关键作用的高度保守功能蛋白），比如加入病毒酶（如RNA依赖性RNA聚合酶），因为这些蛋白质的高度保守性，可以确保其对所有新出现的变异株有效，甚至在未来可能威胁人类的其他蝙蝠衍生冠状病毒中依然有效。

疫苗类型

一般来说，疫苗类型分为六类：减毒活疫苗、经生物工程在体内表达目标病原体抗原的重组病毒载体疫苗、灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）和核酸（DNA或mRNA）的疫苗。从广义上讲，疫苗需要两个组成部分：第一是直接提供给受种者或由受种者产生的来自目标病原体的抗原，第二是用于警告和激活宿主免疫系统的感染信号（例如病原体相关分子模式或损伤相关分子模式）。减毒活疫苗可以天然地提供这两种成分，而非病毒疫苗类型可以提供抗原，但通常需要人工提供信号来激活免疫系统，即佐剂。

通常，这些非病毒疫苗类型需要多次接种以诱导保护性免疫，而基于活病毒的疫苗能够“一针”免疫。与非病毒类型类似，灭活病毒疫苗有时需要加入佐剂并重复给药才能完全有效。如下文所述，每种类型都有各自的优缺点（表1）。

疫苗接种途径和方案

除谨慎选择疫苗抗原和类型外，疫苗接种途径也是疫苗策略的一个整体考虑。这对于粘膜病原体（如SARS-CoV-2），以及其它既需要中和抗体又需要先天性和适应性细胞免疫才能达到最佳防护的病原体，尤为重要。控制和清除SARS-CoV-2的最佳窗口期是新冠的无症状期或症状前期（2-12天），这在一定程度上需要在病毒入侵前使呼吸道粘膜内聚集所有相关的免疫保护分子。疫苗接种途径在此发挥关键的作用。静脉接种疫苗诱导的保护性IgG抗体极易聚集在呼吸道粘膜上，这是肌肉注射麻疹或流感疫苗为人类提供保护的主要机制。然而，这样的疫苗接种途径无法有效诱导肺粘膜IgA抗体或TRM细胞。相比之下，鼻喷接种可以诱导肺粘膜IgA抗体或TRM细胞，以及巨噬细胞介导的训练免疫（方框1）。由于灭活病毒、蛋白亚基和核酸疫苗需要重复接种以及需要潜在不安全的免疫佐剂协助（表1），它们不能通过鼻喷接种途径接种。相比之下，重组病毒载体疫苗，特别是使用人类血清型5腺病毒（Ad5）或黑猩猩源性腺病毒（ChAd）的疫苗，通过鼻喷接种是安全高效的。

一般来说，基于灭活病毒、蛋白亚基、核酸或病毒载体（如Ad26）的弱免疫原性疫苗需要重复同源接种才能有效。事实上，现有的大多数人类疫苗都需要重复注射。由于尚不知道将使用哪种新冠疫苗策略，也不知道疫苗诱导的保护持续时间，因此即使是一些强有力的疫苗类型（如ChAd），我们仍然可能需要同源或异源的加强免疫策略来维持其保护作用。重复接种疫苗可以采用相同或不同的途径。

表1：新冠主要候选疫苗类型的免疫学特性

新冠主要候选疫苗

截至2020年7月31日，临床评估中有27种新冠候选疫苗，临床前开发中有139种疫苗（图1）。在接受临床评估的27种疫苗中（表2），三种主要候选疫苗是病毒载体和基于mRNA的疫苗，于2020年3月中旬分别在中国、英国和美国进入临床试验。其余24种候选疫苗的临床试验目前正在招募志愿者，另外还有几种候选疫苗也即将进入临床试验（表2）。候选疫苗的临床前评估需要使用新冠的相关动物模型（方框3）。传统实验中，在开始临床试验之前，首先在动物模型中严格评估和建立实验疫苗的安全性、免疫原性和保护效力。然而，在大流行疫苗开发的背景下，疫苗临床前和临床阶段的研发进程被压缩并同时推进。

减毒活病毒疫苗

纵观历史上几种研发成功的人类疫苗，如麻疹疫苗和结核病疫苗卡介苗（BCG），都是基于实际病原体的减毒菌株，通过体外传代使毒力基因丢失或突变。现在可以通过毒力基因的突变或删除来合理设计减毒病毒株，这些缺失突变体通常可以在宿主细胞中进行有限复制且不致病。

将冠状病毒复制过程中数个非必要基因切除，可致其在体内衰减。敲除各种非结构蛋白和结构E蛋白已被用作一种设计人畜共患冠状病毒疫苗的策略。E蛋白的缺失导致病毒衰减并产生有效疫苗，但也有报道称衰减表型可再逆转。删除毒力因子或是衰减病毒的首选机制。例如，从SARS冠状病毒基因组中删除2′-O-甲基化酶基因可以消除病毒在宿主细胞MDA5蛋白（也称为IFIH1）和IFIT1中隐藏其RNA的能力，从而在体内中诱导强大的抗病毒反应。病毒衰减的另一种方法称为密码子去优化，即使用次优密码子编码野生型氨基酸序列以修改其核酸序列，这大大减缓了病毒蛋白质在感染期间的翻译。这种方法可以产生一种在体内高度减毒的病毒，但如果选择正确的病毒蛋白去优化，则其仍然能够在体外复制。

无论如何，作为疫苗使用的减毒菌株需要证明其在基因上无法转化为致病性（表1；方框2）。对于冠状病毒来说这尤其具有挑战性，因为已知它们在自然中会重组。理论上，减毒疫苗株可与野生冠状病毒重组重构致病株。截至目前，在临床前开发中只有三种通过密码子去优化产生的SARS-CoV-2减毒疫苗，这三种分别由土耳其的Mehmet Ali Aydinla大学，美国Codagenix公司联合印度血清研究所，印度Immunologicals有限公司联合澳大利亚格里菲斯大学开发。

表2：正在进行或进入临床试验的新冠候选疫苗

实重组病毒载体疫苗

重组病毒载体疫苗构建在复制缺陷病毒载体或减毒复制活性病毒载体上，该病毒载体经生物工程处理以表达来自目标病原体的抗原。虽然只有两种病毒载体疫苗被批准用于人类来控制病毒感染（比如埃博拉），但因为这种疫苗的遗传可塑性、安全性和无需佐剂就可诱导强大T细胞反应的能力，其已被广泛研究并在传染病和癌症研究方面特别完善。一些病毒载体，如Ad5和ChAd，通常只需注射一次即可获得保护，并且对呼吸道粘膜有着天然的向性，这意味着它们可以使用鼻喷接种途径。该技术已用于大规模临床生产和储存。

重组病毒载体是新冠疾病疫苗研发的第二大常见类型，目前候选疫苗中有4种处于临床三期（表2），38种处于临床前开发阶段，还有3种（ChAdOx1 nCoV-19、Ad26-S和VSV-S）被选入美国政府疫苗研发项目“曲速行动”（表2）。非复制病毒类型大多基于Ad5或MVA，这些候选疫苗大多表达SARS-CoV-2的S蛋白或RBD。具有复制能力的病毒载体主要基于其他人类病原体（如麻疹或流感病毒）或动物病原体（如水泡性口炎病毒（VSV））的疫苗株。然而，重要的是要考虑人类是否对病毒载体具有预先存在的免疫力（表1）。预先存在的抗体会削弱这种疫苗与免疫系统结合的能力。使用诸如ChAd之类的病毒载体可以协助规避这一问题，因为人类对这种病毒载体几乎没有甚至根本没有预先存在的免疫力。

Ad5-nCOV由中国疫苗公司康希诺生物股份公司开发，旨在肌肉注射后诱导SARS-CoV-2 S蛋白的中和抗体（表2）。在没有公布临床前数据的情况下，它进入了一/二期临床试验，测试疫苗的三种剂量。值得注意的是，这些剂量比之前肌肉注射试验中使用的剂量高10-30倍。虽然最高剂量产生了不可接受的毒性，并退出了II期研究，而两种较小的剂量仅在50%的疫苗受种者中诱导产生了S蛋白特异性中和抗体。二期试验在很大程度上重复了一期试验的观察结果，即尽管疫苗同时诱导抗体和T细胞反应，但其效力因预先存在的Ad5免疫而降低，尤其是在老年受种者中。根据地理区域的不同，35–95%的人体内具有显著的Ad5中和抗体水平。这与在二期Ad5埃博拉疫苗研究中观察到的抗体滴度快速下降相一致。该疫苗正在中国和加拿大作进一步的试验，但其有效性目前存疑。强生公司正在开发另一种基于人类腺病毒的新冠疫苗，称为Ad26-S，尽管Ad26在人类中仍有40%的血清阳性率。就像Ad26-HIV和Ad26-博拉疫苗的人类研究那样，由于Ad26固有的免疫原性低于Ad5，有效免疫需要重复的同源或异源疫苗接种。尽管如此，在SARS-CoV-2非人类灵长类模型中，单次静脉注射Ad26-新冠疫苗（Ad26.COV2.S）可提供强有力的保护。

ChAdOx1 nCoV-19（也称为AZD-1222），由英国牛津大学和阿斯利康开发，是临床上最先进的新冠疫苗（表2）。人类对ChAd的血清阳性率较低，因此其具有很强的免疫原性，并可用于异源新冠疫苗增强免疫方案。ChAdOx1 nCoV-19疫苗的开发基于很具有前景性的ChAdOx1-MERS疫苗和ChAdOx1-TB疫苗研究。然而，尽管肌肉内注射ChAdOx1 nCoV-19可以降低恒河猴肺部的SARS-CoV-2病毒载量并预防肺炎，但它并没有降低上呼吸道的病毒载量。最近报道的一项I/II期试验研究表明，其具有安全性并能在单次静脉注射后诱导有效的中和抗体和T细胞反应，第二次同源疫苗接种进一步促进了这些反应。目前尚不清楚CD4+和CD8+ T细胞群被激活的程度如何。

VSV-S是由默克和其他团队开发的一种具有复制能力的新冠疫苗。默克的疫苗是建立在其高效VSV-埃博拉疫苗的基础上的，该疫苗可诱导针对埃博拉病毒表面糖蛋白的中和抗体和细胞免疫。VSV是一种动物病毒，人类对其没有预先存在的免疫力。然而，VSV载体的克隆能力仅限于4kb，其是否适合鼻喷疫苗接种尚不清楚。在小鼠和仓鼠模型中，用表达S蛋白的VSV载体进行单次静脉接种可抵御SARS-CoV-2病毒。在其他病毒载体候选基因中有非复制型MVA。MVA已被广泛用作疫苗载体，其克隆能力高达30kb。然而，由于其免疫原性不强，MVA通常被用作增强疫苗或者需要重复注射才能有效，MVA-MERS-S疫苗的临床试验也是如此。

方框3| 用于新冠疫苗测试的动物模型

迫切需要为新冠（COVID-19）疫苗的临床前评估确定合适的动物模型。许多物种对SARS-CoV-2感染的易感性程度不同，这取决于病毒与宿主血管紧张素转换酶2（Ace2）受体的相对结合亲和力或宿主S蛋白上的蛋白酶活性。

在所测试的动物物种中，恒河猴的Ace2对SARS-CoV-2的结合活性最高。受感染的猕猴从上呼吸道和下呼吸道排出SARS-CoV-2，但它们的临床症状和年龄依赖性疾病严重程度与人类不同。猫、雪貂和仓鼠也容易感染SARS-CoV-2。需要注意的是，分别有研究报道了猫和仓鼠会空气传播和接触传播SARS-CoV-2，但在雪貂中没有此类报道。此外，仓鼠会表现出严重的临床症状，猫和雪貂则不会。因此，这些动物模型再现COVID-19相关方面的能力是不同的。

由于免疫试剂和转基因小鼠品系的可负担性和可用性，小鼠模型被广泛用于疫苗测试。然而，常规小鼠的Ace2不能很好地与SARS-CoV-2蛋白结合。表达人Ace2的转基因小鼠最初是为研究SARS-CoV而开发并进行彻底表征的，现已被证明能够支持SARS-CoV-2在肺部的复制，这些小鼠会出现与人类相似的间质性肺炎。进一步人源化以表达人类HlA基因和/或具有人类免疫细胞的人类Ace2表达小鼠将有助于研究接种SARS-CoV-2和病毒感染后的人类免疫反应和免疫优势表位。除了动物模型之外，进一步与人类应用相关的是让年轻的疫苗接种者故意接触SARS-CoV-2的伦理辩论。

实灭活病毒疫苗

物理或化学灭活的病毒已成功用于脊髓灰质炎、甲型肝炎和流感的人类疫苗。利用趋于成熟的框架和方法，可以在大流行情况下快速生成灭活病毒并扩大其规模。与减毒活疫苗不同，灭活病毒疫苗的安全问题很少，它们表达广泛的天然病毒抗原性，包括具有保留的表位构象的表面抗原，可以诱导构象依赖性抗体反应。

目前，有五项关于灭活SARS-CoV-2疫苗的早期临床试验（表2），另有九项候选疫苗正在进行临床前开发。PiCo Vacc是科兴生物科技有限公司在中国开发的一种灭活SARS-CoV-2和明矾佐剂组合的疫苗，是已公布临床前结果的最先进候选疫苗。它可以保护恒河猴免受SARS-CoV-2感染，降低病毒滴度，并降低与S蛋白和核衣壳蛋白相关抗体的免疫病理学效应。BBIBP-CorV是国药集团正在开发的另一种灭活候选疫苗，在一系列动物模型中进行了测试，证明了其在非人灵长类动物中的有效性。尽管这些发现非常令人乐观，但是它们在相当短期的研究中得出的，我们仍应谨慎对待这些观察结果。

灭活病毒疫苗通常需要佐剂和重复给药才能有效（表1）。用明矾作佐剂使其不适合被用于鼻喷接种。虽然肌肉注射PiCoVacc或BBIBP-CorV介导的免疫保护说明其存在一定粘膜免疫能力（可能是体内抗体运输到了肺部），但这种免疫的持久性仍不清楚，因为SARS-CoV-2的入侵是在接种后1-4周进行的。此外，与蛋白亚单位疫苗类似，灭活病毒疫苗抑制了细胞毒性CD8+ T细胞，而有效的新冠疫苗可能需要这些细胞发挥作用。

对灭活SARS冠状病毒疫苗和呼吸道合胞病毒疫苗的研究报告了疫苗相关疾病发病率增加，可能涉及TH2细胞反应和肺嗜酸性粒细胞增多，这在老年人中更为明显。虽然PiCoVacc或BBIBP-CorV在接种后7天内没有加重肺部疾病，但明矾可以驱动TH2细胞介导的免疫反应，这需要进一步的安全性研究。使用TH1细胞倾斜性明矾或其他佐剂（如CpG）可避免此类安全问题。

实蛋白亚单位疫苗

目前，有7种新冠亚单位疫苗正在进行临床试验（表2），另有50种候选疫苗正在进行临床前试验，这使新冠亚单位疫苗成为最常见的新冠疫苗类型。亚单位疫苗主要诱导CD4⁺TH细胞和抗体反应。因此，大多数疫苗含有全长或部分SARS-CoV-2 S蛋白，目的是诱导产生中和抗体，这与大多数SARS和MERS疫苗类似，但疗效水平有所不同。

亚单位疫苗可将免疫反应集中于中和表位，从而避免产生可能促进ADE效应的非中和抗体。然而，与基于核酸或病毒载体的疫苗不同，除非亚单位疫苗在哺乳动物细胞中产生，否则其重组蛋白可能具有不正确的表位构象。由于只有蛋白质或肽的疫苗免疫原性较差，通常需要添加佐剂且重复给药，并且它们对CD8+ T细胞反应的激活作用较差（表1）。此外，该类型通常不适用于鼻喷接种。与灭活病毒疫苗一样，使用未经修饰的明矾作为佐剂会促进TH2细胞介导的免疫反应，而TH2细胞介导的免疫反应不利于宿主防御SARS-CoV-2感染，并可能在ADE疾病中发挥作用。在这方面，GlaxoSmithKline和Novavax正在开发的新冠亚单位疫苗分别使用AS03和M基质佐剂。

病毒样颗粒（VLP）疫苗

VLP是由几个共同表达或混合的病毒结构蛋白自发形成的颗粒。一些商业疫苗，如乙型肝炎和人乳头瘤病毒疫苗都是基于VLP研发的。对于冠状病毒，当病毒蛋白S、M和E（含或不含N）在真核生产细胞中共同表达时，形成VLP。这导致产生VLP的细胞结构与感染性病毒相同但缺乏病毒基因组，因此是非感染性的。VLP表面S蛋白的存在使其能够以与亲代病毒相同的方式结合并进入ACE2+细胞。与亚单位疫苗不同，VLP表面的S蛋白交联B细胞受体并直接激活B细胞，但与亚单位疫苗、灭活病毒疫苗一样，VLP通常也需要佐剂和重复给药。尽管如此，VLP技术已经成熟，冠状病毒VLPs的生物学和安全性已被了解，其大规模生产符合良好制造规范标准相对简单。

目前，只有1种基于VLP的新冠疫苗在进行临床试验（表2），另有12种正在进行临床前开发。它们要么在体内由表达VLPs成分的病毒载体（如MVA）产生（GeoVax开发的类型），要么在体外由生产细胞产生。值得注意的是，加拿大的Medicago公司利用基因工程植物生产SARS-CoV-2 VLPs，尚未发表的结果似乎验证了其在小鼠中可以诱导中和抗体。

核酸疫苗

重组质粒DNA作为疫苗已经有数十年的历史，而mRNA作为疫苗是最近才出现的颇有应用前景的疫苗类型。目前，有6种基于mRNA的新冠候选疫苗和4种基于DNA的新冠候选疫苗处于临床试验中（表2），其中27种候选疫苗（16种基于mRNA的疫苗和11种基于DNA的疫苗）正在进行临床前开发。

编码抗原的mRNA通过脂质纳米颗粒负载可以被有效传递到宿主细胞中进行蛋白的翻译和翻译后修饰，这是相对于重组蛋白质亚单位疫苗的优势。mRNA疫苗是非传染性的，通过体外转录合成，不含微生物分子。这些在安全性、有效性和抗载体免疫问题方面的优势，将mRNA疫苗与减毒活病毒疫苗、灭活病毒疫苗、亚单位疫苗和重组病毒载体疫苗区别开来，使其能够快速、廉价地生产以及重复接种（表1）。

美国生物技术公司Moderna生产了mRNA-1273疫苗，该公司具有基于mRNA的MERS疫苗的经验，编码包封在脂质纳米粒中的预使用稳定的SARS-CoV-2 S蛋白。该疫苗甚至在临床前数据发布之前就进入了临床测试。最近公布的一期临床试验数据表明，两次重复平行静脉注射低剂量和中剂量的疫苗通常是安全的，其在大多数试验参与者中诱导强烈的S蛋白特异性抗体应答和CD4⁺T细胞反应。Pfizer和BioNTech也在评估一种编码S蛋白RBD（称为BNT162b1）的mRNA脂质纳米粒疫苗在人类中的作用，该疫苗在两次重复平行注射后产生了强大的S蛋白特异性抗体和CD4⁺和CD8+ T细胞反应。Pfizer/BioNTech和Moderna疫苗均已被选择用于美国政府疫苗研发项目“曲速行动”（表2）。

虽然尚未有mRNA疫苗被许可用于人类，但在先前对流感、狂犬病和寨卡病毒感染的动物研究中其有效性得以验证。例如，流感病毒的mRNA疫苗在年轻和老年小鼠中诱导长期体液免疫，寨卡病毒的mRNA疫苗在小鼠中诱导生产抗体和细胞毒性CD8+ T细胞。但是，两项临床研究表明mRNA疫苗诱导的免疫反应的幅度和时间存在差异。因此，尽管基于mRNA的新冠疫苗在早期临床试验中显示出前景，但是其在人体的保护效力还需要进一步验证，另外其是否能够通过呼吸道粘膜传递也是一个值得探讨的问题。

质粒DNA疫苗与mRNA疫苗有几个共同特点，例如安全性、易生产性和可扩展性等。这些疫苗的免疫原性较差，需要加大剂量和添加佐剂。目前，有四种基于质粒DNA的新冠疫苗正在进行临床试验（表2），另有11种正在进行临床前开发。INO-4800是一种表达SARS-CoV-2蛋白的质粒DNA疫苗，由美国生物技术公司Inovio Pharmaceuticals开发。在小鼠和豚鼠模型中进行的临床前研究检验了该疫苗的免疫原性，但没有提供保护性免疫有关的数据。两次重复注射表达S蛋白的质粒DNA疫苗在恒河猴中产生了强大的保护性免疫。

图2：全球新冠疫苗发展的演变情况和需求

结论与展望

世界迫切需要安全、有效的新冠疫苗策略。许多实验室和公司争先恐后地快速开发这些疫苗，已经产生了160多种候选疫苗，有少数则在短短6个月内进入了I，II和III期临床试验。虽然我们对新冠及其疫苗了解尚浅，但大多数先进的疫苗类型已被广泛用于其他感染和癌症研究。虽然并行实施各种疫苗策略很重要，但基于现有的科学知识对相关策略的优先级做出明智的决定也非常重要。

各种疫苗类型和策略都在免疫学上有各自的优缺点（表1），但现代免疫学原理和以往类似疫苗类型研究的数据使我们猜测，有效的新冠疫苗策略应该是能够诱导有力且持久的中和抗体和T细胞免疫应答。目前人类免疫规划中几乎所有的疫苗都是通过皮肤或肌肉接种的，现大多数新冠疫苗策略也侧重于静脉接种途径（表2）。进一步推测，能够直接在呼吸道粘膜中诱导这些反应的鼻喷疫苗接种策略将在早期有效控制或清除SARS-CoV-2。尤其是高危的老年人群，他们将需要一种特别强大的疫苗策略。在这方面，新冠的鼻喷疫苗可以借鉴流感、麻疹和结核病疫苗鼻喷疫苗的成功经验。鼻喷接种不需要针，接种剂量也相比静脉接种要小得多的优点。然而，与静脉接种途径相比，可用鼻喷接种的安全有效的疫苗类型更少。此外，需要使用吸入设备可能会限制其在资源贫乏区域广泛应用。

根据大流行性流感疫苗开发范式（图2），新冠疫苗的研发进程由常规疫苗研发的10-15年被压缩到了1-2年，临床前试验、临床试验和扩大生产过程并行开展。由于开发过程加快，正在进行的临床和临床前疫苗研究的临时数据几乎实时发布。因此，无法获得有关疫苗诱导的保护性免疫的时限和质量的关键信息。由于许多国家的传播率和新病例数量减少，目前尚不确定领头的候选疫苗的二期和三期研究是否会能够对其保护功效得出可靠结论。此外，各个疫苗的研究目前也是单独进行的，因此也难以直接比较不同候选疫苗的有效性。因此，将新冠疫苗试验中观察到的安全性和免疫原性视为真正的成功还为时过早。在很大程度上，这些结果是从过去相同类型和实现路径的研究中预测出来的。然而，可能需要给高风险人群快速部署具有临床前疗效数据但临床数据有限的疫苗供应（图2）。

疫苗的研发将在未来几年持续进行，直到更多的临床试验被完成，更多的疫苗策略得到评估，更好地了解到宿主对SARS-CoV-2包括感染后免疫在内的防御能力（图2）。也许直到那时，全球大规模免疫接种才会成为现实。接受第一轮疫苗接种的人群可能会免疫力的下降，需要接种改进的第二代新冠疫苗来增强免疫。此外，除了未暴露人群外，部分患新冠恢复后免疫力较差或体质虚弱的群体也可能需要接种疫苗。

考虑到资源、制造、分销以及区域保护主义等相关问题，疫苗接种计划的实施很可能是不均衡、不同步和可变的，这涉及全球各地不同的疫苗类型和战略。在这方面，一些资源丰富的国家已经获得了大量各种候选疫苗，但不知道哪种可能有效。在疫苗供应有限的情况下，围绕谁该优先使用疫苗的激烈争论全球范围内展开。新冠疫苗实施计划（COVAX）由全球疫苗免疫联盟（Gavi）、流行病防范创新联盟（CEPI）和世界卫生组织（WHO）共同建立，以便筹集资源，团结高收入和低收入国家，在全球范围内协调、快速、透明和公平地获得新冠疫苗。

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