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关键词：阿尔茨海默病；治疗；
摘要：
疾病的发生改变了基因的表达，然而这些分子反应是如何产生并对病理生理学产生贡献的，目前了解得不够深入。
美国哥伦比亚大学阿尔茨海默病和大脑老化研究所的研究者发表于Sci Adv的研究发现，阿尔茨海默病（AD）的触发因素β-淀粉样蛋白（β-amyloid）能促进神经元中的CREB3L2-ATF4转录因子形成病理性异二聚体。基于AD数据集和一种新的化学遗传学方法（ChIPmera），研究者进行了多层次的研究；结果发现：CREB3L2-ATF4能激活一个转录网络，该网络与大约一半的在AD中差异表达的基因相互作用，包括与β-淀粉样蛋白和tau神经病理学相关的子集。
CREB3L2-ATF4的激活驱动神经元中tau蛋白的超磷酸化和分泌，同时也导致了内质网复合体（retromer）的失调，这个复合体与AD的病因学有关。
研究者进一步提供了证据，显示在AD大脑中异源二聚体信号的增加，并确定dovitinib为一种候选分子，可以用来恢复β-淀粉样蛋白介导的转录反应。
总的来说，这些发现揭示了异转录因子二聚体化作为一种机制，将疾病刺激与病理性细胞状态的发展联系起来。
引言：
阿尔茨海默病（AD）是一种进行性的神经退行性疾病，在全世界的发病率越来越高，其临床前阶段可持续10至20年，特点是β-淀粉样蛋白和tau聚集体在大脑中逐渐积累，同时伴有神经炎症和突触改变。一些证据表明，β-淀粉样蛋白的沉积先于并加速了tau的病变，后者与认知能力下降的发生相关。同时，人们还观察到与病理生理学相关的特定途径的基因表达变化，强调转录调节在AD中的重要作用。
然而，是什么导致了这些变化，它们如何与β-淀粉样蛋白和tau病理学相互作用，以及它们是疾病的驱动因素还是对疾病的反应，仍然未知。

基因表达远不是一个二元的开关，它是一个细微的、动态的、涉及各种转录层的协作过程。因此，与AD相关的基因表达变化只有在这种相互依赖的调控下才能得到充分解释。转录因子（TF）二聚体是许多TF家族的共同特征，它可以在DNA结合特异性和转录活性方面产生巨大影响。最重要的是，AD研究中通常使用的基因共表达谱的网络分析往往忽视掉了对这些TF二聚体信号的捕捉，导致对AD进展的基因程序的理解支离破碎，很可能会错过治疗机会。

2023年3月，来自哥伦比亚大学的Ulrich Hengst团队在Science Advances杂志上发表了一篇文章，题目是“CREB3L2-ATF4 heterodimerization defines a transcriptional hub of Alzheimer’s disease gene expression linked to neuropathology”，他们发现β-淀粉样蛋白会促进神经元中病理性CREB3L2-ATF4转录因子异二聚体的形成，CREB3L2-ATF4会激活一个转录网络，与大约一半的AD差异表达的基因相互作用，包括与β淀粉样蛋白和tau神经病变相关的子集。CREB3L2-ATF4的激活驱动tau的过度磷酸化。这些发现总体上揭示了不同的转录因子二聚体化是连接疾病刺激和致病细胞状态发展的一种机制。
主要研究内容
一、Aβ42促进转录因子ATF4 与CREB3L2形成异二聚体
转录因子ATF4已被报道与包括AD在内的各种神经退行性疾病有关，可介导Aβ42引发的致病性转录变化和神经变性，但ATF4是如何在Aβ42的下游作为AD发病机制的驱动因素发挥作用的呢？
该团队利用siRNA技术和ChIP-qPCR（染色质免疫共沉淀定量聚合酶链反应）发现Aβ42能促进CREB3L2与ATF4形成二聚体。随后，该团队基于ChIP-seq开发了一种方法“ChIPmera”以确认二聚体结合的DNA片段，对这些片段进行GO富集分析发现这些基因片段与“RNA代谢、蛋白质翻译和周转、内质网应激、线粒体组织、DNA修复和细胞内液泡运输”等通路显著相关。尤其需要注意的是，大量的CREB3L2-ATF4信号映射在AD风险位点内，包括ABCA7、ADAM10、ADAMTS1、BCKDK、BIN1、CELF1、CSTF1、CD2AP、EED、FERMT2、HESX1、IQCK、KAT8、MEF2C、PICALM、PSMC3、OARD1和ZCWPW1等，其中许多信号通过对内细胞途径和淀粉样β前体蛋白（APP）平衡的影响与AD易感性直接相关。
图1. CREB3L2-ATF4异二聚体影响的转录程序，大量映射在AD风险位点内。

二、CREB3L2-ATF4转录网络在功能上与AD病理生理学有联系
为了进一步了解CREB3L2-ATF4的病理作用，该团队利用化学诱导促进其二聚化后对原代大鼠海马神经元进行了RNA-seq，在CREB3L2-ATF4激活下游的879个差异表达基因（DEGs）中，有221个被确定为异源二聚体的DNA结合目标，随后与先前发表的晚期AD转录组进行比较。CREB3L2-ATF4靶向的增加最显著的基因是肿瘤坏死因子受体TNFRSF1A，该受体通过介导神经元细胞死亡而有助于AD的发病机制。接下来，该团队试图确定异源二聚体如何影响特定的AD基因表达反应。通过对数据的分析发现多个与retromer（内体货物分类复合物，其功能障碍与AD和其他神经退行性疾病的发病机制有关）的直接联系，CREB3L2敲除后降低了神经元中各种retromer亚基在mRNA和蛋白水平上的表达，ChIP-qPCR进一步证实CREB3L2与细胞中几个retromer基因附近的DNA调控元件结合，与CREB3L2作为神经元retromer的组成性转录激活剂的功能一致。

此外，作者想知道CREB3L2-ATF4是否与APP和tau的调节相关。首先使用Meso Scale多重免疫测定法测量了表达CREB3L2-ATF4异构体的大鼠海马神经元介质中的可溶性Aβ肽。与对照组相比，CREB3L2-ATF4神经元的Aβ42/Aβ40比率明显较高，而Aβ42和Aβ40水平降低，且Aβ40的下降比易聚集的Aβ42肽的下降更明显。 但由于mRNA水平没有明显差异，因此这些变化不是CREB3L2-ATF4激活对App的直接转录作用的结果。为了评估tau的代谢，作者首先关注神经元tau的磷酸化模式，因为这种蛋白的高磷酸化形式与AD的tau聚集增加有关。使用识别特定tau磷酸化表位的抗体，该团队发现CREB3L2-ATF4异构体导致各种疾病相关位点的磷酸化明显增加。通过Western blot观察到Ser202/Thr205比对照组神经元增加了约53.4%。同样，Ser396/Ser404的磷酸化水平相较于对照组来说也高出31.1%。

CREB3L2-ATF4的激活如何影响tau的代谢？对神经元RNA-seq数据集的分析发现PP2A的转录受到CREB3L2-ATF4抑制，而PP2A在人脑中占约70%的tau导向的磷酸酶活性，表达变化被认为是其在AD中受损的原因之一。与对照组相比，CREB3L2-ATF4神经元纯化提取物中的PP2A磷酸酶活性明显降低，这与在这些细胞中观察到的tau磷酸化模式的改变在机制上是一致的。
图2. CREB3L2-ATF4对β淀粉样蛋白和tau磷酸化的影响。

三、CREB3L2-ATF4异二聚体存在于AD大脑中
迄今为止的分析提供了CREB3L2-ATF4在AD病理生理学中潜在的重要作用的证据，这促使该团队追求更多的证据来证明这一点。首先，他们确定了CREB3L2-ATF4是否存在于人脑中，以及它的异源二聚体化水平在AD中的不同程度。该团队发现在AD大脑的ATF4共免疫沉淀物中，CREB3L2的水平比在对照组中发现的要高，特别是在有晚期tau病理学的个体中（Braak阶段≥V）。通过对AD前额叶皮层的PLA分析发现，CREB3L2-ATF4异源二聚体不仅存在于神经元细胞核内中，也存在于轴突以及其他细胞中。与对照组病例的比较显示，核CREB3L2-ATF4信号在AD神经元中富集了约20%，提示神经元是AD大脑中CREB3L2-ATF4异质体的一个来源。

接下来，该团队试图用直接的人类证据来证实他们对CREB3L2-ATF4转录程序的描述。根据前额叶皮层CREB3L2和ATF4的高表达以及死后处理间隔的缩短，他们选择了两个具有中毒AD病理特征且年龄>89岁的女性样本进行ChIP-seq分析，鉴定出228个富含CREB3L2的基因组位点，与上述的ChIPmera研究一致，这些基因与包括内体运输，ER应激、蛋白稳态、RNA代谢、线粒体组织和DNA修复等通路有关。
图3. 在人类大脑中检测到CREB3L2-ATF4异二聚体及AD病理相关通路改变。

四、CREB3L2-ATF4可作为Aβ42神经变性的干预目标
由于CREB3L2-ATF4与AD转录组的大量子集相互作用，并再现了疾病进展的各个方面，破坏其活性可能会减轻Aβ42介导的有害影响，从而有可能改善疾病的结果。因此，作者试图破坏两者的二聚化及与相关基因的结合。根据这一原则，我们设计了CREB3L2和ATF4 aZIPs（详情可见文章，基于之前工作中确定的bZIPs的靶向干扰设计的另一种序列），并测试了它们在病毒传递后拯救Aβ42诱导的神经细胞死亡的能力。与野生型神经元相比，实验组在48小时的刺激方案中明显改善了暴露于Aβ42的神经元的细胞活力，提示CREB3L2和ATF4是Aβ42神经变性的中心效应器。

虽然传统上认为TFs是很差的治疗目标，但基因表达正在成为药物发现和再利用工作的一个强大平台。通过CMap（包含药物及其干扰的100多万个基因表达特征的网络资源），可以比较与疾病过程相关的基因表达的变化与药物诱导的扰动的相似性，并将那些具有最负相关的基因作为治疗线索进行跟踪。使用CREB3L2-ATF4转录组对CMap数据库进行查询，发现泛受体酪氨酸激酶抑制剂多维替尼是最重要的命中，于是他们在受到Aβ42挑战的神经元中测试该药物。使用RNA-seq，他们在24小时Aβ42刺激方案后发现了203个DEGs，其中超过一半的基因在多韦替尼共处理下显示出纠正性转变。
结果表明，多韦替尼可以在某种程度上缓解， Aβ42下游的早期转录反应。惊喜的是，之前的工作已经证明这种药物可以穿越血脑屏障，并具有良好的安全性特征，这对未来的临床前工作是个好兆头。
图4. CREB3L2-ATF4可作为Aβ42神经变性的干预目标。

主要结论
综上所述，研究者证明：
  • 这篇报告提出了一种新的阿尔茨海默病的病理机制，即β-淀粉样蛋白促进CREB3L2-ATF4转录因子形成异源二聚体，从而影响神经元中相关基因的表达，并且这种效应与AD的神经病理学特征紧密相关。
  • 此外，这项研究还识别出了一种可能的药物目标dovitinib，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的思路。
  • 这项研究为我们理解AD的病因机制以及开发新的治疗策略提供了重要的信息，提供了重要的信息，并且具有极高的研究价值。
(Image credit: selvanegra via Getty Images)
Hanson解读
截至目前，淀粉样蛋白级联假说仍然是最主要的发病机制模型，因此，阐明β-淀粉样蛋白导致疾病发生的机制具有重要意义。
这项研究开发了一种可以检测二聚体TFs的方法ChIPmera，检测到CREB3L2-ATF4异二聚体的存在，证明基因表达的变化不仅仅是对AD病理的反应，而是作为AD病理的实际驱动因素发挥作用。
然而，考虑到异源二聚体转录程序的范围，它的影响能否归因于单一的功能失调途径（如retromer或PP2A）是值得怀疑的，未来还需要进一步证实。

此外，这项工作还有一个局限性在于对CREB3L2-ATF4所作的一些推断是基于相关分析来进行的，但是该团队也通过使用来自不同来源的人类数据集，并尽可能倾向于无偏见的读数来克服这一局限性。
科研启发
报告的作者们应用了创新的化学遗传学方法，得出了具有重大影响的发现；这个方法学有助于解决其他类似问题。
根据本研究结果，在未来需要重点开发一种特异性抑制其异源二聚体的小分子，以便进行更直接的验证，并从根本上证明CREB3L2-ATF4的作用。
总的来说，这篇报告为我们理解阿尔茨海默病的发病机制以及开发新的治疗方法提供了新的视角和方向；值得我们高度关注和深入研究。
期待这些重要的发现能在未来为阿尔茨海默病的防治带来实质性的改变。
参考文献：
【1】 Gouveia Roque C, Chung KM, McCurdy EP, Jagannathan R, Randolph LK, Herline-Killian K, Baleriola J, Hengst U. CREB3L2-ATF4 heterodimerization defines a transcriptional hub of Alzheimer's disease gene expression linked to neuropathology. Sci Adv. 2023 Mar 3;9(9):eadd2671. doi: 10.1126/sciadv.add2671. Epub 2023 Mar 3. PMID: 36867706; PMCID: PMC9984184.
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本期编辑：Henry，微信号healsan。
Hanson临床科研团队，在美国的七位生物医学科学家主持并担任独立理事。主要通过大数据分析，分享医学研究前沿、数据库建设、医学统计分析方面的进展；交流规范的课题设计与SCI论文撰写经验。
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