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2023年1月5日，香港大学生物科学学院翟元梁研究组、香港科技大学党尚宇研究组、香港科技大学/康奈尔大学戴碧瓘研究组和法国居里研究所陈春龙研究组合作在Cell杂志在线发表题为“The human pre-replication complex is an open complex”的研究论文，该研究报告了2.59-Å人类MCM-DH (human MCM-DH, hMCM-DH)的冷冻电子显微镜结构，也称为复制前复合体。在这种结构中，具有狭窄中心通道的hMCM-DH解开并拉伸DNA链，以至于近半圈的结合双工DNA被扭曲，1个碱基对完全分离，在六聚体结处产生初始开放结构(initial open structure, IOS)。
干扰IOS会抑制DH的形成和复制启动。hMCM-DH足迹的绘制表明，IOSs以大簇的形式分布在整个基因组中，与随机起源激发的起始区很好地对齐。总之，这项工作揭示了一种内在机制，将DH的形成与初始DNA结合起来，以许可人类细胞中的复制启动。
真核生物的复制许可始于起源识别复合物(origin recognition complex，ORC)以依赖于ATP的方式将两个小染色体维持(MCM) 2-7复合物招募到双工DNA上。两个六聚体MCM环一次一个装入头对头双六聚体(DH)构型，形成预复制复合体(pre-replication complex，preRC)。一旦获得许可，MCM-DH被转化为两个CDC45-MCM2-7-GINS (CDC45-MCM2–7-GINS，CMG)解旋酶，它们被进一步组装成从复制起点双向复制DNA的复配体。双向分叉形成的决定性步骤是两条起始DNA链的融化和随后的分离，以及两个CMG解旋酶的解耦，然后沿着相互交叉的单个DNA链作为复制复制体的核心进行转移。
在过去的几年里，大量的努力已经阐明了由MCM-DH结合的原始DNA初始熔化的结构基础。酵母MCM-DH (yMCM-DH)确定的第一个高分辨率结构表明，两个六聚体的界面被扭曲、倾斜和偏移，以扭结的形式形成一个狭窄的中央通道，这可能导致在六聚体结处捕获的DNA变形。不幸的是，在这个内源制备的样品中捕获的DNA是不稳定的，与yMCM-DH能够从DNA上脱落的事实相一致。酵母CMG解旋酶的结构进一步表明，CMG解旋酶利用其MCM环的氨基末端层作为前端，沿着前导链模板进行3’-5’的转运，从而展开DNA。
这些结构分析支持了一个模型，即MCM-DH结合的原始DNA被分离，然后在解旋酶激活过程中分离成两个活化的CMG解旋酶。该模型后来被体外重组酵母系统的生化和结构分析证实，只有在CMG组装后，MCM腔内才可检测到DNA 展开。尽管取得了这些进展，但对于起始DNA打开何时何地开始以及MCM-DH如何促进这一过程以促进复制启动，人们仍然知之甚少。
人类MCM-DH (hMCM-DH)的复制起源许可在其他脊椎动物的研究中也有涉及。事实上，我们对人类启动复制的分子机制的大部分假定知识都是从对酵母和其他后生动物的研究中推断出来的。除了在人类中起源选择和MCM负载受到更精心调控的事实外， MCM在复制启动中的作用可能在所有真核生物中都是保守的。最近对人类CMG解旋酶和复体体的结构研究表明，复制解旋酶的结构在酵母、果蝇和人类中是保守的。然而，为了促进我们对与DNA复制相关的人类疾病的理解，需要对DNA结合的hMCM-DH结构进行详细分析。
为了实现这一目标，研究人员在Dbf4依赖性激酶(Dbf4-dependent kinase，DDK)磷酸化之前，从HeLa G1细胞中纯化了内源性染色质结合的hMCM-DH(，并在2.59 A˚下通过单颗粒冷冻电镜确定了其结构。
研究表明，与先前的研究一致， hMCM-DH结合位点在非转录区域内以极高的密度被发现，形成广泛分布于人类基因组的广泛区域。此外，该研究发现hORC和H2A.Z在RDs早期与MCM-DH簇有明显的关系。虽然两者都在簇边界高度富集，但只有H2A.Z分布在整个簇中，这很可能是在H2A. Z的帮助下hORC循环打开和关闭染色质，以促进每个簇内多个hMCM-DHs的负载，中心有一个IOS的双链DNA被紧紧抓住。这表明在人类体内组装的pre-RC是固定的，不像在酵母中观察到的MCM-DH的滑动。
此外，突变分析表明，干扰IOS与MCM5或MCM2的任何ZFs的相互作用减弱了MCM六聚体的耦合，这由突变MCM-DHs的盐敏感性所示。重要的是，在体外重组的yMCMDHs中没有观察到这种IOS。在这些研究中观察到的染色质结合MCM-DHs的这些截然不同的初始结构说明了人类和酵母之间固有的物种特异性差异，或者是内源组装和体外重建样品之间的人为差异。
研究概述（图源自Cell ）
综上所述，这项研究首次展示了hMCM-DH的高分辨率结构和足迹。它为初始DNA解链机制提供了重要信息，并为pre-RC形成、解旋酶激活和双向复制体组装机制提供了有价值的见解。重要的是，它为研究在MCM基因中有突变的人类疾病提供了一个结构框架，这些疾病通常表现为发育缺陷，如耳聋、免疫缺陷、侏儒症、和癌症。
原文链接：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)01521-5#
来源 | iNature
编辑/审核：Andy
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