Hi，大家好，我是小Q
近期推文《Treg细胞的分选方法》和《Treg细胞的体外诱导分化》给大家介绍了Treg细胞的制备策略。如何证明我们拿到的就是Treg细胞呢？答案是：表型鉴定+功能验证。
上期推文《Treg细胞的表型鉴定》中，小Q给大家分享了检测Treg细胞关键转录因子Foxp3的方案，相信小伙伴们已经对照小Q的protocol，对自己的Treg细胞进行了表型鉴定。
表型鉴定完成，还需要进行功能鉴定。肿瘤微环境中的Treg细胞，具有免疫抑制功能：(1) 能够分泌IL-10等免疫抑制性的细胞因子；(2) 能够抑制T淋巴细胞（Responder T细胞）的增殖和活化。
本期，首先跟大家分享酶联免疫吸附实验 (ELISA)鉴定Treg细胞IL-10分泌量的方法。
PART
01
Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制
图 1 Treg发挥免疫抑制功能的机制 [1]
定居在肿瘤微环境中的Treg细胞已经完全被肿瘤细胞绑架，成为了机体免疫力的“叛徒”。
往期推文《Treg—被肿瘤绑架的叛徒》中提到了Treg细胞发挥免疫抑制功能的机制，包括：
(一)放冷箭：分泌IL-10等免疫抑制性因子。Treg细胞通过释放免疫抑制性细胞因子（IL-10、TGF-β和IL-35）和杀伤分子（穿孔素与颗粒酶B），既能抑制效应性T细胞活化增殖，同时诱导效应性T细胞凋亡。
(二)夺资源：抑制T细胞的增殖。Treg喜欢竞争性掠夺T细胞增殖必需的细胞因子IL-2。
 (三)离间盟友：抑制T细胞的活化。Treg细胞竞争性结合抗原提呈细胞APC，使T细胞接触抗原的机会大大降低，活化受阻。
PART
02
ELISA鉴定Treg细胞IL-10分泌量
2.1 双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术的原理
生物素与亲和素能够高亲合力地牢固结合，称为生物素－亲和素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）。酶标板上预包被捕获抗体，能够与标准品或待测样品特异性结合。
标准品或待测样品与检测抗体结合，检测抗体上连接生物素，生物素与链霉亲和素牢固结合，链霉亲和素上链接有辣根过氧化物酶，能够催化其底物显色。加入终止液终止反应，在450 nm波长(参考校正波长540nm或570nm)测定吸光度值。
图 2 ELISA原理示意图[2]
2.2酶联免疫吸附实验步骤[2]
试剂：Mouse IL-10 ELISA试剂盒（品牌：Signosis，货号：EA-2513），检测范围16 - 1000 pg/mL，8 pg/mL；去离子水。
耗材： 50ml离心管，移液枪，25ml容积的干净容器。
仪器：酶标仪。
操作步骤：
(1)计算标准品和待测样品数：一般标准品做8个浓度。标准品和待测样品做2复孔。
(2)制备梯度浓度的标准品：标准品的8个浓度由高到低依次排列，最高4000pg/ml，最低31.25 pg/ml。在第1个浓度孔内加入200µl的1×Diluent buffer，在其余7个浓度孔内加入100µl的1×Diluent buffer。取2µl的 Recombinant mouse IL-10 standard (400ng/ml)，加入到第1个浓度孔内，终浓度4000pg/ml。移液枪量程调整为100µl，在上一个浓度孔内吹打数次混匀后，吸取100µl溶液加入下一个浓度孔内，最终得到8个浓度，每个浓度2复孔。
(3)加入待测样品：Treg细胞的培养上清，1000g离心5分钟，去除细胞碎片，100µl/孔加入待测样品孔内，采用细胞培养液作为阴性对照。
(4)捕获抗体与标准品/待测样品结合：室温孵育1小时，可采用摇床轻柔震摇。
(5)配制1×Assay wash buffer：40ml 5×Assay wash buffer与160ml去离子水混合均匀。
(6)洗去未结合的标准品/待测样品：甩弃酶标板中的液体。每孔加入200µl 1×Assay wash buffer，静置片刻，甩弃，重复此步骤共3次。最后一次洗板，在干净的纸巾上倒置拍打酶标板，尽量去除酶标板中残留的液体。
(7)稀释生物素标记的检测抗体：采用1×Diluent buffer稀释Biotin labeled rabbit anti-mouse IL-10 antibodies，稀释比例1：400，按需取量，现配现用。
(8)检测抗体与标准品/待测样品结合：100µl/孔 加入稀释后的Biotin labeled rabbit anti-mouse IL-10 antibodies，室温孵育1小时，可采用摇床轻柔震摇。
(9)洗去未结合的检测抗体：甩弃酶标板中的液体。每孔加入200µl 1×Assay wash buffer，静置片刻，甩弃，重复此步骤共3次。最后一次洗板，在干净的纸巾上倒置拍打酶标板，尽量去除酶标板中残留的液体。
(10) 稀释连接有辣根过氧化物酶的链霉亲和素：采用1×Diluent buffer稀释Streptavidin-HRP conjugate，稀释比例1：200，按需取量，现配现用。
(11)链霉亲和素与生物素结合：100µl/孔 加入稀释后的Streptavidin-HRP conjugate，室温孵育45分钟，可采用摇床轻柔震摇。
(12) 洗去未结合的链霉亲和素：甩弃酶标板中的液体。每孔加入200µl 1×Assay wash buffer，静置片刻，甩弃，重复此步骤共3次。最后一次洗板，在干净的纸巾上倒置拍打酶标板，尽量去除酶标板中残留的液体。
(13) 辣根过氧化物酶催化底物显色：100µl/孔 加入Substrate，室温孵育10-30分钟，注意观察显色情况。
(14) 终止显色反应：待标准品孔出现明显的颜色梯度时，50µl/孔加入Stop溶液。
(15) 读取OD值：30分钟内通过酶标仪读取各孔OD值（450nm）。
2.3酶联免疫吸附实验数据处理
(16) 拟合标准曲线：根据标准品数据拟合标准曲线，推荐四参数拟合法。
(17)计算待测样品浓度：待测样品孔的OD值减去阴性对照孔（细胞培养液）的OD值，根据标准曲线，计算出待测样品中IL-10的浓度。
详细的操作介绍完了，大家学会怎样捕捉Treg细胞放出的“冷箭”了吗？那就就快快行动起来吧！
有小伙伴要问了，Treg细胞发挥免疫抑制功能的三大机制：“放冷箭”、“夺资源”、“离间盟友”，这篇推文只教会了我识别第一招，其它两招如何鉴别呢？我们下期分享~
参考文献：
[1] A. Tanaka, S. Sakaguchi, Regulatory T cells in cancer immunotherapy, Cell Res 27(1) (2017) 109-118.
[2]https://www.signosisinc.com/images/uploaded/1502395670ea-2513_il10_elisa_user_manual_030717.pdf
—
END
—
撰文丨小      Q
审核丨小Q老师
责编丨小张老师
往期推荐
继续阅读
阅读原文
关键词
细胞
Treg细胞
功能
OD值
IL-10