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同源重组是一种基本的细胞过程，其对于维持基因的完整性及产生基因的多样性起到了重要的作用。在同源重组过程中，两条配对的同源双链DNA发生断裂，断开的单链交互重接，在分支点处形成由四条单链组成的Holliday交叉（Holliday junction，HJ），分支点可以发生移动，也被称为分支迁移（branch migration）（图1a）【1】。在原核生物中，RuvA和RuvB两种蛋白质在分支迁移中发挥了重要的作用，早期的生化实验证实RuvA四聚体组装在HJ周围使得双链DNA可以分离成单链，每条单链进入HJ侧部的两个RuvB AAA+ ATPase六聚体中，使得新生的重组DNA可以发生分支迁移（图1b）【2】。但是目前没有RuvAB-HJ复合物的相关结构，以及RuvB如何促进DNA的移位这一重要生物学过程的分子机制仍不清楚。
图1 HJ的形成及RuvAB-HJ复合物促使的分支迁移过程【3】
2022年8月24日，来自德国汉堡大学的Thomas C. Marlovits课题组在Nature上发表了题为Mechanism of AAA+ ATPase-mediated RuvAB–Holliday junction branch migration 的文章。通过时间分辨的冷冻电镜技术和单颗粒分析，解析了RuvAB-HJ复合物的结构，得到了复合物7种不同的构象，这些构象揭示了RuvAB-HJ复合物在分支迁移过程中ATP水解、核苷酸交换、DNA移位的具体信息，提出分支迁移过程中新的分子机制及原理。
作者通过将原核生物生物的RuvA、RuvB蛋白质与DNA在体外进行组装，并使用冷冻电镜解析其结构。由于高度柔性，RuvAB-HJ复合物整体结构的分辨率为8 Å（图2a），其中8个RuvA分子对称组成了2个四聚体（3.3 Å），4条单链进入1个或者2个RuvB六聚体组成三部分复合物（2.9～4.1 Å）或者二部分复合物（3.9 Å）（图2b）。在所有类型的颗粒中，都是DNA以双链形式进入RuvA的核心，在离开时以单链形式与另一DNA的单链组合穿入RuvB的中心马达（图2d）。其中，RuvA核心通过RuvAD3结构域与RuvB马达相连，说明其可能存在控制RuvB运动的方式（图2c）。由于此复合物的高度动态性，作者进行后续的3D分类分析，发现RuvB呈现60度旋转运动，从而呈现不同的构象介导分支迁移（图2e）。
图2 RuvAB-HJ复合物的冷冻电镜结构
作者在后续额外的3D分类中，发现了RuvB马达分子呈现出了9个不同的构象密度图，分辨率为2.9 Å～4.1 Å，其中3.9 Å和4.1 Å的密度图无法进行无偏差的分析，所以文章后部分没有进行讨论，而剩余的7个被分为，1个不结合RuvAD3的密度图（s0-A），2个结合1个RuvAD3的密度图（s0、s1）和4个结合2个RuvAD3的密度图（s2、s3、s4、s5）。在所有的RuvB马达蛋白中，六聚体（A～F亚基）中的A、B、C、D四个亚基形成一种螺旋楼梯样式的结构，并与DNA的磷酸基团相结合（图3a和图3b）。其中每个亚基结合2个bp（图3c），富含Arg氨基酸带正电的结构域与带负电的磷酸基团相结合（图3d）。
图3 RuvB马达的构造及其构象的多样性
根据不同构象间RuvB马达中Cα的位置，作者将RuvB六聚体分为稳定的（白色）、柔性的（蓝色）及中间状态的区域，其中B和C亚基较为稳定，E和F亚基较为柔性，而A和D亚基则处于中间状态（图3e），说明了在分支迁移过程中不同亚基的柔性是不同的。而不同亚基之间也存在着一定的构象差异（图3f）。
为了衡量6个亚基在5种状态下一共30种构象间的差异，作者通过引入RuvB亚基中3个特定角度来进行定量研究，发现E亚基在5种状态下的差异最大（图4a）。而分析E亚基在5种状态下的移动轨迹，可以发现其移动了7 Å（图4b），刚好对应了2 bp的DNA移位距离，说明这5种状态呈现了一次完整的移位步骤。
为了分析ATP水解与RuvB构象变化间的关系，作者分析了30种核苷酸结合口袋，总结如图4c，可以发现，对于A亚基在s2～s3状态时发生了ATP的水解，而D亚基在s1～s2状态时发生了ADP的释放，在s4～s5状态时发生了ATP的结合，B和C亚基在5种状态下都是ATP结合，E和F亚基在5种状态下都是ADP结合。对于整个RuvB马达来讲，在s1～s2状态时释放ADP、s2～s3状态时水解ATP，s3～s4状态时释放镁离子，s4～s5状态时结合ATP（图4d），而亚基A位于螺旋楼梯的顶部、亚基D位于底部，说明核苷酸循环与DNA移位存在着内在的关系。同时，作者发现每个亚基在s5状态下的构象与逆时针相邻亚基在s1状态下的构象较为接近，说明其存在着一个逆时针转动的过程（图5e），比如A亚基的s5状态逆时针转动变为F亚基的s1状态，当转动发生时，口袋内的核苷酸也都没有发生变化（图5c）。作者将这一转动过程称之为集群转换（cluster switch），每一个亚基的发生的反应也会在其相邻的亚基中陆续发生。
图4 RuvB的动态性及核苷酸结合口袋分析
通过以RuvAD3结构域作为固定点，将五种状态的结构进行比对，发现RuvB向上移动（图5a），在一次循环中通过拉力将DNA移动了2 bp的距离（图5b）。作者提出了DNA移位的杠杆模型，即以RuvAD3结构域为支点，RuvB在杠杆上施加机械力，使得DNA向上移动，造成DNA在RuvAB-HJ复合物中分支迁移。随后恢复s1状态，进行接下来的循环（图5d）。
图5 RuvB通过杠杆原理来促进底物移位
最终，作者构建了一个DNA在RuvAB-HJ复合物分支移动的模型，分为两个阶段（图6）：
第一阶段为初始阶段，这一阶段不发生移位反应，（1）RuvA结合到HJ处并通过RuvAD3结构域招募RuvB组装形成六聚体；（2）RuvB六聚体随机组装核苷酸（ATP或ADP）并通过ATP水解或者核苷酸交换从而使得其为s1状态。
第二阶段为移位阶段，这一阶段发生具有顺序性，（1）RuvB六聚体经历s1～s5五种状态水解ATP，将ATP的化学能转为机械能造成“杠杆移动”，使得DNA移位；（2）每次移位的距离为2 bp；（3）通过集群转换不断进入下一循环，使得DNA在RuvAB-HJ复合物进行分支移动。
图6 RuvAB-HJ复合物促进DNA分支移动的模型
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41586-022-05121-1
参考文献
参考文献
【1】Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, 282–304 (1964).
【2】West, S. C. Processing of recombination intermediates by the RuvABC proteins. Annu. Rev. Genet. 31, 213–244 (1997).
【3】Rafferty, J. B. et al. Crystal structure of DNA recombination protein RuvA and a model for its binding to the Holliday junction. Science 274, 415–421 (1996).
供稿 | 朱盎岐
审稿 | 李浩田
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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