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神经胶质瘤是在大脑和脊髓中发现的神经胶质细胞的肿瘤，是一种恶性程度极高的原发性脑肿瘤，约占所有原发性神经系统肿瘤的30%。其中，多形性胶质母细胞瘤 (Glioblastoma multiforme, GBM) 是最常见的胶质瘤类型，占脑胶质瘤的一半以上，统计5年来患者的生存率仅为5%。GBM生长快速，侵袭性强，即使在采用手术、放疗和常规化疗等治疗手段之后，患者的平均生存时间也只有14个月左右，因此迫切需要新的治疗策略。
DNA甲基化剂替莫唑胺 (TMZ) 是一种口服烷化剂，能穿过血脑屏障直达病灶，是临床上化疗脑胶质瘤的一线常用药物之一。TMZ通过攻击肿瘤细胞的DNA，致使DNA的O6位鸟嘌呤甲基化并导致碱基错配，所得到的O6MeG/T可以被错配修复系统识别，随后新合成的链被切除，但是O6MeG链保持完好无损。当产生另一条链时，重复该修复周期。胸腺嘧啶插入和切除的无效循环导致细胞周期停滞和凋亡，从而诱导癌细胞死亡。但是GBM中存在极强的DNA损伤修复系统和复杂的损伤修复机制，这些修复机制是造成GBM对TMZ产生耐药性的重要原因，包括O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶 (MGMT)、错配修复 (mismatch repair, MMR)、碱基切除修复 (base excision repair，BER) 等1,2。
2022年7月28日，耶鲁大学Seth Herzon实验室和Ranjit Bindra实验室合作，在Science期刊上发表了题为Mechanism-based design of agents that selectively target drug-resistant glioma的论文。文章报告了通过在MGMT缺陷型肿瘤细胞中诱导MMR非依赖性细胞选择性杀伤来克服这种耐药机制的药物开发。这些药物沉积了动态的DNA损伤，可以通过MGMT逆转，但在MGMT缺陷的环境中缓慢演变成链间交联，在体外和体内实验中造成不依赖于MMR的细胞死亡。不仅对正常细胞毒性低，同时规避了由MMR途径突变引起的抗药性。这一发现开创了神经胶质瘤的新疗法，并可能采用特定DNA修复缺陷的化学疗法且应用到其他的癌症治疗中。
MGMT在DNA损伤修复中的关键功能已被广泛研究，其主要是通过脱除鸟嘌呤O6位甲基来直接修复TMZ所致的病变。MGMT在鸟嘌呤去甲基的过程中，自身发生甲基化并立刻失活，最后被蛋白酶体降解，也被称为“自杀酶”。大约一半的GBM和超过70%的II级和III级胶质瘤通过启动子超甲基化修饰从而降低MGMT的表达量3。尽管MGMT缺陷型肿瘤细胞起初对TMZ具有较高的敏感性，但一段时间后会因为MMR途径的变异而获得耐药性，导致癌症复发。

基于MGMT缺陷型肿瘤细胞的MGMT沉默表达，并为了避免MMR途径突变引发的抗药性，研究者们构思了一种新的治疗策略。他们在TMZ药物基础上，合成了两个新的小分子——KL-50和KL-85（图1D）。与TMZ提供强效甲基化剂甲基重氮不同，这两个小分子作为载体提供2-氟乙基重氮，形成O6FEtG，造成DNA的一级损伤。这种损伤能够在健康细胞中由正常表达的MGMT所修复；而在MGMT缺陷型细胞中会缓慢积累，(N1,O6Et)G进一步与脱氧胞苷 (dC) 交联，形成链内交联 (interstrand cross-link, ICL)，造成MMR突变无法修复的DNA二级损伤（图1E），形成的ICL不能被MMR突变所回避，并导致细胞死亡。这种两步途径可以有效地减轻类似TMZ耐药性的产生。并且由于这两种小分子导致的ICL速度足够缓慢（KL-50显示在治疗后8至24小时内引起最大ICL），足以使正常细胞修复大部分或所有原发性病变，因此该药物同时具有低毒性和特异性。
图1 治疗策略和结构概述
接下来，研究者测定了不同的小分子分别在不同细胞模型中的短期活力曲线（图2）。实验发现，TMZ仅对MGMT缺陷型、MMR功能正常的细胞存在细胞毒性；而KL-50和KL-85显示出以前未见的MGMT依赖性、MMR非依赖性细胞毒性。这些数据表明，KL-50和KL-85可以克服MMR突变而产生的耐药性，同时保留对MGMT缺陷型肿瘤细胞的选择性。
图 2 KL-50显示出MGMT 依赖性、MMR 非依赖性细胞毒性
为了进一步揭示KL-50的抑肿瘤机制，研究者利用彗星实验（单细胞碱性凝胶实验）来确定KL-50处理后的肿瘤细胞中是否形成ICL。实验结果显示，TMZ处理过的细胞不能形成ICL；而KL-50处理过的细胞在MGMT缺陷细胞中缓慢生成了显著的链内交联，且该过程不依赖MMR。研究者进一步对DNA修复蛋白激活谱进行表征，发现ATR-CHK1信号轴被激活。KL-50在MGMT缺陷型细胞中不依赖MMR地诱导 CHK1 和 CHK2 磷酸化。研究者进一步对细胞进行细胞核染色发现，KL-50处理在MGMT缺陷细胞中激活了DNA损伤修复通路引起G2细胞周期停滞。与之对应，BRCA2和FANCD22缺陷型细胞对于KL-50治疗有着高度的敏感性，而这两个基因在DNA损伤修复机制中都发挥着重要作用。这些发现再次佐证了DNA损伤修复机制的失灵是KL-50发挥药效的先决条件和辅助因素。

最后，研究者在体内模型中探究了KL-50和TMZ的抗癌活性。研究发现KL-50呈现出了较好的抗癌活性，并尝试了不同的药物剂量检测KL50的细胞毒性，整体而言KL50对正常细胞毒性在可接受范围。此外，结果表明KL-50在MGMT缺陷型、MMR功能正常细胞中的抗肿瘤活性与TMZ没有显著差异，而在对TMZ耐药肿瘤（MGMT缺陷型、MMR失活），KL-50也成功抑制了其生长，药物总体的耐受性良好（图3）。
图3 KL-50  在 MGMT–/MMR+ 和 MGMT–/MMR– 肿瘤中安全有效
自1990年代初引入TMZ以来，MMR突变诱导的对烷化剂的耐药性一直是治疗效果的主要障碍。本篇文章巧妙利用了DNA 修复缺陷，创新性地研发出了MGMT依赖性、MMR非依赖性抗肿瘤小分子KL-50。采用两步途径治疗肿瘤细胞，很好地避免了MMR途径突变引发的抗药性，同时也兼具了对正常细胞的低毒性。与此同时，其他的一些癌细胞中也报告有MGMT沉默，因此这一创新型治疗策略也可拓展用于治疗其他癌症。
原文链接
https://www.science.org/doi/10.1126/
science.abn7570?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr
_dat=cr_pub%20%200pubmed
参考文献
参考文献
[1] G.-M. Li, Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res.18, 85–98 (2008).
[2] K. Yoshimoto, M. Mizoguchi, N. Hata, H. Murata, R. Hatae, T. Amano, A. Nakamizo, T. Sasaki, Complex DNA repair pathways as possible therapeutic targets to overcome temozolomide resistance in glioblastoma. Front. Oncol.2, 186 (2012).
[3] E. H. Bell, P. Zhang, B. J. Fisher, et al. Association of MGMT promoter methylation status with survival outcomes in patients with high-risk glioma treated with radiotherapy and temozolomide: An analysis from the NRG oncology/RTOG 0424 trial. JAMA Oncol.4, 1405–1409 (2018).
供稿 | 肖媛
审稿 | 谭佳鑫
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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