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阿片类药物是治疗疼痛最有效的药物之一。用于镇痛的阿片类药物分为阿片生物碱与合成类阿片，分别以吗啡和芬太尼为代表，二者都是被广泛应用的处方药
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。尽管阿片类药物是有效的镇痛剂，但是他们同时也会引发严重的副作用，比如成瘾、呼吸抑制和便秘，这些副作用也限制了它们的临床应用
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。阿片成瘾和过量所引起的呼吸抑制和死亡导致了众所周知的“阿片药物危机”。

阿片类药物主要通过四类G蛋白偶联受体，即μ、δ、κ和痛觉感受受体来发挥作用4,5。在这些阿片受体中(ORs)，μOR是主要介导吗啡的止痛和副作用的受体。μOR的信号主要通过Gi抑制cAMP的产生来传导。另外，μOR活化还能激活β-arrestin通路。一些研究显示，阿片药物介导的止痛效果可能主要由Gi通路介导，而呼吸抑制和便秘等副作用则主要归因于β-arrestin通路6,7。基于此，过去的几十年间，科学家们一直致力于筛选和开发具有Gi选择性的阿片类药物，希望通过减弱β-arrestin通路的活性来减少止痛药的副作用。oliceridine (TRV130), PZM21和SR17018是几种可能比吗啡和芬太尼更安全的、具有微弱的β-arrestin活性的μOR激动剂，但是他们与μOR相互作用及引发偏好性信号转导的结构基础尚不知晓。因此，更好的理解配体与μOR的互作及胞内信号转导机制将有利于设计和开发新的具有信号偏好性的镇痛药物。
2022年11月10日，中国科学院上海药物研究所的徐华强团队、谢欣团队和王明伟团队合作解析了人源μOR-Gi复合体分别与六种不同激动剂结合的cryo-EM结构。这些结构不仅揭示了吗啡与芬太尼与μOR结合的结构特点，也揭示了β-arrestin信号选择性的分子基础。基于这些发现，研究者们还设计了保留G蛋白活性，但削弱了β-arrestin活性的芬太尼衍生物，为未来理性设计以μOR为靶点对的镇痛剂提供了思路。
通过cAMP累积、Gi/o 招募以及β-arrestin招募实验，研究者们首先描述了了六种结构  各异的阿片类药物(DAMGO， 芬太尼，吗啡，R17018，TRV130和 PZM21)的信号通路特点。结果显示，以DAMGO作为参照，其他五种药物均能够激活μOR并抑制cAMP的产生。而在β-arrestin活性方面，吗啡和芬太尼能够强烈的激发β-arrestin的招募，SR17018和TRV130仅显示微弱的信号，而PZM21没有引发β-arrestin的招募。为了进一步探究配体与μOR之间的结合模式及信号特征, 研究者用冷冻电镜单颗粒技术解析了μOR-Gi蛋白复合体分别与上述六种激动剂结合的结构，分辨率在2.8Å到3.3Å 之间 （图1）。
图1. μOR-Gi复合体的冷冻电镜结构
研究者首先比较了吗啡和芬太尼这两种化学骨架各异的化合物与μOR的结合模式。尽管吗啡和芬太尼与μOR结合的位置相似，但是二者的结合模式却非常不同。芬太尼以一种“Y”型的构象结合在μOR的正位口袋(OBP)，并主要与蛋白跨膜区(TMD)的TM2, TM3, TM6, 和 TM7上的残基相互作用。而吗啡则以一个椭圆的“O”型构象与TM3, TM6 和TM7上的疏水残基相互作用。另外，与吗啡-μOR的结构相比，芬太尼的苯乙基基团延伸并占据了由TM2和TM3上的残基形成的一个小疏水口袋 （图2），使得芬太尼与μOR的结合更稳固，这也解释了芬太尼激活μOR的效力比吗啡强的原因。接下来，研究者们突变了结合口袋周围介导互作的多个残基，并观察到突变后G蛋白和β-arrestin信号的减弱，验证了吗啡和芬太尼与μOR结合位点。
图2. 吗啡和芬太尼与μOR的结合模式
为了解释吗啡和芬太尼激活μOR的机制，研究者们将二者与μOR结合的结构与拮抗剂β--FNA与μOR结合的结构进行了比较，并观察到了μOR从失活态到激活态的变化，包括TM3的扭转，TM5的内向移动，TM6的胞内部分的外向移动，以及TM2和TM7的顺时针转动 （图3）。这些构象变化打开了胞内腔隙，进而引发了G蛋白的偶联。类似的构象变化也同时在吗啡和激动剂BU72与μOR结合的结构中被观察到，说明了这三个激动剂通过共同的机制来激活μOR。
图3. 芬太尼结合并激活μOR
如图1所示，SR17018, TRV130, and PZM21偏好性的激活G蛋白信号通路，但只具有很弱的β-arrestin活性，而DAMGO，芬太尼和吗啡则能激活两个信号通路。为了解释这一点，研究者们又进一步解析了SR17018, TRV130, and PZM21与μOR结合的结构，并且发现三个配体均结合在μOR 在W295之上的OBP中，并且结合模式也类似。
对上述的配体与μOR结合的结构进行比较分析后，研究者发现，DAMGO、芬太尼和吗啡均与μOR的TM6和TM7产生了稳定的相互作用，而无β-arrestin活性的SR17018和PZM21则没有这样的相互作用，研究者们假设，激动剂与TM6和TM7之间较弱的相互作用可能是SR17018和PZM21产生信号偏好的原因。为了验证这一假设，研究者们对OBP中的残基进行了突变，并观察到多个在TM6和TM7上的突变(W295A, W320A, I298A)对芬太尼，吗啡和DAMGO引发的G蛋白通路活性的影响很小，但是却几乎消除了激发的β-arrestin招募活性（图4）。这一结果说明μOR激动剂与TM6和TM7的稳定互作是保持β-arrestin信号活性的必要条件。另外，研究者们还发现，μOR的部分激动剂TRV130的吡啶环仅与μOR的TM6/7形成了较弱的疏水作用，这可能解释了TRV130微弱的β-arrestin信号活性。
图4.β-arrestin信号激活的结构基础
为了进一步探究μOR受不同配体激活后所引起的胞内区的变化，研究者们利用分子模拟的方法模拟了多种激动剂与受体结合后μOR胞内侧的结构模型 （图5）。结果显示，在芬太尼和DAMGO结合的结构中，μOR的TM6 和TM7-H8的内向移动使得胞内口袋收紧，并扩大了与β-arrestin的互作界面，促进了μOR与β-arrestin的相互作用。相反，在SR17018, TRV130和 PZM21与μOR的结合的模型中，TM6 和TM7-H8倾向于远离跨膜区中心，从而减少了μOR-β-arrestin的互作界面从而削弱了他们的结合能力。综上，激动剂与μOR的TM6-TM7的稳定互作及其引发的TM6 和TM7-H8的内向移动，是引发β-arrestin信号偶联的关键。
图5.不同激动剂引发的μOR胞内区的构象变化
为了验证配体与TM6-TM7互作对β-arrestin信号的重要性，研究者们设计了能够弱化与TM6/7互作的芬太尼衍生物，并希望以此获得保留G蛋白信号活性但是削弱β-arrestin信号活性的μOR激动剂。研究者用丙基和或异丙基替代了芬太尼分子中与TM6/7互作的正丙胺基团，合成了两个结构相似的化合物，FBD1和FBD3。丙基和或异丙基相较于芬太尼的正丙胺基团较小，因此与TM6/7的互作也较弱。与假设相符，FBD1和FBD3与芬太尼激活G蛋白信号的效力相当，但是β-arrestin的招募活性却非常有限 （图6）。
图6. 芬太尼衍生物的μOR活性
综上，研究团队解析了人源μOR-Gi复合物与多个激动剂结合的结构。通过比较具有G-蛋白信号偏好的激动剂-受体(SR17018, TRV130和 PZM21)和信号中性的激动剂-受体（DAMGO，吗啡和芬太尼）结构，研究者们发现激动剂与μOR的TM6/7的稳定互作是激活β-arrestin信号通路的必要条件。这一发现将为理性设计具有G-蛋白信号偏好的芬太尼衍生物和下一代镇痛药提供结构基础。
原文链接
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)01260-0#gr1
参考文献
参考文献
1. Manglik, A. (2020). Molecular basis of opioid action: From structures to new leads. Biol. Psychiatry 87, 6–14.
2. Chan, H.C.S., McCarthy, D., Li, J., Palczewski, K., and Yuan, S. (2017). Designing safer analgesics via mu-opioid receptor pathways. Trends Pharmacol. Sci. 38, 1016–1037.
3. Del Vecchio, G., Spahn, V., and Stein, C. (2017). Novel opioid analgesics and side effects. ACS Chem. Neurosci. 8, 1638–1640.
4. Al-Hasani, R., and Bruchas, M.R. (2011). Molecular mechanisms of opioid receptor-dependent signaling and behavior. Anesthesiology 115, 1363–1381.
5. Waldhoer, M., Bartlett, S.E., and Whistler, J.L. (2004). Opioid receptors. Annu. Rev. Biochem. 73, 953–990.
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7. Bohn, L.M., Lefkowitz, R.J., Gainetdinov, R.R., Peppel, K., Caron, M.G., and Lin, F.T. (1999). Enhanced morphine analgesia in mice lacking beta-arrestin2. Science 286, 2495–2498.
供稿 | 赵雅娴
审稿 | 朱盎岐
责编 | 囡囡
排版 | 可洲
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