Treg细胞的分选方法

哈啰，小伙伴们好，我是Cherry

正常的生理环境就像是“国泰民安，男耕女织”的太平盛世，各类细胞都是“良民”，各司其职，维持着社会稳定。然而，当肿瘤细胞这群“暴徒”打破盛世太平的时候，昔日的“良民”却摆出不同的立场和作风。

一些细胞坚定地想要维护社会稳定，另一些细胞却与肿瘤沆瀣一气。就拿CD4 T细胞举例，有Th1这样的良民，也有Treg这样的暴徒。

如果大家复习往期推文《肿瘤微环境之CD4 T—角色多变的心机细胞》《Treg—被肿瘤绑架的叛徒》，就知道调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）是目前肿瘤免疫治疗的研究热点。

本期推文给大家分享Treg细胞的分选方法。

Treg细胞的分子标志

Treg是CD4⁺ T细胞的一个亚群，它最特异性的标签是核内转录因子Foxp3，此外，它还高表达IL-2α受体(IL2Rα)—CD25，因此，经典的Treg标志是CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T。

研究表明，在Treg细胞上，CD127的表达与Foxp3的表达呈负相关，因此也可以使用CD4⁺CD25⁺CD127^lo/-来定义Treg细胞^[^1-2]。

在研究Treg的实验当中，我们应该如何选取分子标志呢？CD4、CD25、Foxp3、CD127是定义Treg细胞的四大分子标志，其中，CD4、CD25、CD127是细胞表面蛋白，而Foxp3是细胞核内的转录因子。

（1）如果我们需要检测Treg细胞，一般是先进行表面蛋白CD4和CD25的标记，然后对细胞进行固定、透化（可以理解为在细胞膜或细胞核膜上打孔，方便抗体进入细胞质或细胞核），最后加入Foxp3的抗体进行标记。

（2）如果我们需要分选活的Treg细胞开展后续实验，就无法检测Foxp3了，因为Foxp3染色前需要的固定、透化步骤，会让细胞死亡，此时可以选取CD4⁺ CD25⁺或CD4⁺CD25⁺CD127^lo/-作为Treg细胞的标志。

本期推文重点介绍如何制备小鼠脾脏单细胞悬液，以及如何从小鼠脾脏单细胞中分选获得存活的Treg细胞。

图 1 Treg细胞的表型和功能特征（来源于参考文献3）

细胞分选

细胞分选是指根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术。

常用的细胞分选包括两大类：一类是基于细胞物理性质的密度梯度离心法，另一类是基于免疫识别特性的方法，包括荧光激活细胞分选方法（Fluorescence-activated cell sorting, FACS）和磁性激活细胞分选法（Magenetic-activated cell separation, MACS），但第一类方法由于细胞表面的标志不明确，特异性较差，所以使用率较低。

脾脏单细胞悬液的制备

从小鼠脾脏单细胞中分选获得存活的Treg细胞，常用的方法有2种：一是磁珠分选，二是流式分选。两种实验方法都有共同的前期步骤，也就是脾脏单细胞悬液的制备。

试剂耗材：镊子，剪刀，40µm细胞过滤器，60mm培养皿，20ml注射器，50ml离心管，5ml移液管，红细胞裂解液，胎牛血清（FBS），1xPBS缓冲液，75%酒精。

仪器：高速低温离心机，细胞计数仪。

实验步骤：

1. 取一只6-8周龄的C57BL/6小鼠，以颈椎脱臼法处死，将其浸泡在75%酒精中数秒，再置于无菌操作台上。

2. 将小鼠左侧腹朝上，于左侧腹剪开小口，撕开皮肤，即可暴露腹膜囊，可见小鼠脾脏呈红色长条状，用无菌剪刀和镊子打开腹膜囊，取下小鼠脾脏，将其转移到60mm无菌培养皿中，并在培养皿中加入适量含1%FBS的PBS。

3. 去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，将脾脏置于40µm细胞过滤器上，并用20ml注射器的柱塞轻轻研磨脾脏，直至整个脾脏均研磨成单细胞悬液。

4. 采用用5mL移液管吸取脾脏单细胞悬液，通过40µm细胞过滤器，转入50ml 无菌离心管中。

5. 4℃，300g 离心5min。

6.弃去上清，加入1mL 红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温孵育5min。

7. 加10mL PBS稀释红细胞裂解液，4℃，300g离心5min，弃上清，以2ml PBS重悬，细胞计数。

图 2 脾脏单细胞悬液制备示意图（取脾脏，研磨脾脏，过滤细胞悬液）

磁珠分选（MACS）CD4⁺CD25⁺ Treg细胞

原理：细胞通过表面抗原与链接有磁珠的抗体结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠偶联物，外加磁场时，细胞-抗原-抗体-磁珠偶联物滞留在磁场中，其它细胞流出磁场。因此可以通过选择抗体的种类分选不同类型的细胞。

试剂耗材：CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit（美天旎，#130-091-041），MACS Columns，Buffer (pH=7.2,含0.5%BSA及2mM EDTA的PBS溶液)，RPMI完全培养基，胎牛血清，50nM β-巯基乙醇， primocin抗生素，1M HEPS平衡液，100mM丙酮酸钠，10mM非必须氨基酸

仪器准备：MACS磁珠分选仪

实验步骤：

1. 磁珠标记non-CD4⁺细胞，同时抗体标记CD25⁺细胞

（1）CD4⁺T细胞磁性标记：取上述制备的脾脏单细胞1×10⁸, 300g离心5min，重悬于400µl buffer，加入100µl Biotin-Antibody Cocktail，混匀后于4℃孵育10min。

（2）加入380µl buffer，200ul Anti-Biotin MicroBeads，20µl CD25-PE antibody，混匀后于4℃孵育15min。

2. 去除non-CD4⁺细胞

（3）将LS Column分选柱放在合适的MACS磁珠分选仪上，用2ml buffer先润洗柱子，再将上述孵育好的细胞悬液缓慢加入柱子中，避免产生气泡阻塞柱芯。

（4）收集通过分选柱的未标记细胞，并用2ml buffer洗涤分选柱，细胞悬液300g离心5min后用900ul buffer重悬。

3. CD25⁺ T细胞磁性标记：

（5）加入100ul Anti-PE MicroBeads，混匀后4℃孵育15min。

4. CD4⁺CD25⁺T细胞的阳性选择：

（6）拿一个MS column分选柱置于磁珠分选仪上，用500ul buffer润洗柱子，将细胞悬液缓慢注入分选柱中，留在分选柱上的为CD4⁺CD25^-的细胞，当柱子为空时，再用500ul buffer洗涤2次柱子。

（7）将MS column从分选仪上取下，放入15ml离心管中，加1 mL缓冲液到柱子上，通过将柱塞牢固地推入柱中，可立即冲洗出磁性标记的细胞，即为CD4 ⁺ CD25 ⁺T细胞。

5. CD4⁺CD25⁺Treg细胞的培养：

（8）将收集到的CD4⁺CD25⁺Treg细胞以适当的密度培养于RPMI培养基中（10%FBS，0.1%β-巯基乙醇，0.2% primocin抗生素，2% HEPS平衡液，1%丙酮酸钠，1%非必须氨基酸）。

图 3 美天旎磁珠分选仪

图 4 磁珠分选流程图

（A：阴性选择CD4+T细胞；B：阳性选择CD4+ CD25+ T细胞）

流式分选CD4⁺CD25⁺CD127^lo/- Treg细胞

原理：采用荧光染料标记细胞，并将细胞重悬在溶液中，制备成单细胞悬液，单细胞悬液进入流式细胞仪之后，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。

在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。

将这些液滴根据标记的荧光染料，充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

图 5 流式分选仪工作原理图

试剂耗材：PBS，流式管，anti-mouse CD4-APC antibody，anti-mouse CD25-PE antibody, CD127-APC antibody, anti-mouse CD16/32 antibody，RPMI完全培养基，胎牛血清，50nM β-巯基乙醇， primocin抗生素，1M HEPS平衡液，100mM丙酮酸钠，10mM非必须氨基酸

仪器：BD FACSAria III流式分选仪

实验步骤：

1.取脾脏单细胞悬液于流式管中：

（1）每管取1×10⁶细胞，制备Blank管（细胞不进行抗体染色），CD4单染管（细胞只染色anti-mouse CD4抗体），CD25单染管（细胞只染色anti-mouse CD25抗体），CD127单染管（细胞只染色anti-mouse CD127抗体）。用于调节测试电压和荧光补偿。

（2）最多可取3x10⁷细胞，制备全染管（添加了anti-mouse CD4抗体、anti-mouse CD25抗体、anti-mouse CD127抗体），用于分选。

2.各管加入1mL PBS，1500rpm 离心5min，弃上清，剩100-200ul体积用于流式染色，重悬细胞沉淀。

3.FCR封闭：除了Blank管以外，每管添加1ul anti-mouse CD16/32抗体用于封闭细胞表面的非特异抗原结合位点。

4.按说明书推荐用量加入CD4、CD25、CD127流式抗体，全染管相比较单染管抗体用量适当提高至3-5倍，混匀后，4℃孵育30min。

5.各管加入1mL PBS（洗掉未结合的抗体），1500rpm离心5min。

6.弃上清，Blank及单染管用1mL PBS重悬即可，而全染管用2-3mL PBS重悬（防止细胞太多堵塞分选管道），流式上机分选CD4⁺CD25⁺CD127 ^lo/-的Treg细胞群。

7.将收集到的CD4⁺CD25⁺Treg细胞以适当的密度培养于RPMI培养基中（10%FBS，0.1%β-巯基乙醇，0.2% primocin抗生素，2% HEPS平衡液，1%丙酮酸钠，1%非必须氨基酸）。

图 6 BD FACSAria III流式分选仪

应该如何选择细胞分选的方式呢？

首先，MACS分选所需设备简单，对技术人员要求不高，而且过程迅速，可以同时处理数十亿的细胞，分选所得细胞灵敏度高且细胞活性和复苏率较好，可以尽量保证无菌操作，但分选纯度低；

而FACS则高纯度和高回收率，但是过程缓慢，限制了可以处理的细胞数，而且无法保证无菌操作。具体如何抉择，主要还是根据当下实验平台及课题组能满足的实验条件啦~

今天是纯纯干货的一天，不知道各位小伙伴们get到Treg的制备方法了嘛？我们下期再见，拜拜。

参考文献

1.Yu Ning,Li Xiaomei,Song Weiya et al. CD4(+)CD25 (+)CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood.[J] .Inflammation, 2012, 35: 1773-80.

2.Liu Weihong,Putnam Amy L,Xu-Yu Zhou et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.[J] .J Exp Med, 2006, 203: 1701-11.

3.Zhang Ximei,Olsen Nancy,Zheng Song Guo,The progress and prospect of regulatory T cells in autoimmune diseases.[J] .J Autoimmun, 2020, 111: 102461.