各位科研兔,大家好呀!今天要给大家分享的是 cGAS-STING 信号通路。作为肿瘤免疫治疗靶点的后起之秀,STING 自 12 年前被发现以来,就吸引了众多科研学者的关注,并快速俘获了一大票“粉丝”,常常“霸占”科研界热搜 top 榜。而 cGAS-STING 信号通路的发现,也疾病的发病机制和治疗方法提供了一条全新的思路,有助于开发出更多的治疗策略。
2021 年 4 月 8 日,瑞士洛桑联邦理工学院的 Alexiane Decout 教授及其团队在 Nature Reviews Immunology(IF=108.555)发表了一篇重磅综述,题为《The cGAS-STING pathway as a therapeutic target in inflammatory diseases(cGAS-STING通路作为炎症性疾病的治疗靶点)》,在该文中,作者介绍了cGAS-STING信号级联的主要成分,总结了目前对于 cGAS-STING 信号通路的各种理解并分析了其在疾病临床前模型中的作用,以及在治疗炎症和自身炎症疾病中的治疗潜力。
环状鸟嘌呤核苷酸-腺嘌呤核苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子通路,即环状GMP-AMP合成酶-STING通路 (鸟嘌呤核苷酸,guanylate,GMP;腺嘌呤核苷酸,adenosine monophosphate,AMP;环状GMP-AMP合成酶即环鸟苷酸腺苷酸合成酶,cyclic guanylate adenylate synthase,cGAS;干扰素基因刺激因子stimulator of interferon genes,STING)已成为在感染、细胞应激和组织损伤的情况中炎症的关键介质。
cGAS-STING通路具有广泛的参与性,这基于它感知和调节细胞对脱氧核糖核酸(DNA)反应的能力,这些DNA来源于微生物和宿主,是普遍存在的危险相关分子。深入了解cGAS-STING通路的结构和分子生物学,使研究人员考虑是否可能开发出选择性小分子抑制剂。这些小分子抑制剂可以将人类许多炎症性疾病中的cGAS-STING轴作为治疗靶点。
在本综述中,我们概述了cGAS-STING信号级联的主要元素,并讨论了cGAS-STING的活性与各种自身炎症、自身免疫性和退行性疾病关联的一般机制。最后,我们概述了最近开发的cGAS和STING拮抗剂的化学性质,并总结了他们潜在的临床应用。
引言
对外来DNA的检测是许多有机体免疫的一个关键因素。在哺乳动物细胞中,这在很大程度上是由环状GMP-AMP合成酶(cGAS)-干扰素基因刺激因子(STING)完成的,该通路已成为连接机体感知DNA和诱导强大的先天免疫防御程序的关键机制。在这条通路中,cGAS与双链DNA(dsDNA) 结合后发生构象改变并被激活催化活性,从而产生STING的第二信使分子和强效激动剂:2′3′环磷酸鸟苷(guanylate,GMP;adenosine monophosphate,AMP;2′3′cyclic GMP–AMP即cGAMP,2′3′环磷酸鸟苷)。
cGAS-STING通路的一个显著特征是,它的激活是由生命的一种基本元素(即DNA)触发的,因此,它没有病原体种属特异性,这与其他几种先天免疫信号机制不同。出于这个原因,cGAS能识别来源广泛的DNA,包括外部来源的和自身来源的。如今,我们对cGAS-STING通路在宿主免疫中的多样化功能的认识越来越清晰,多个例子强调了该通路在感染中的保护作用。最近关于cGAS-STING系统起源于一种古老的细菌抗噬菌体机制的研究也强调了这一观点。
由于cGAS-STING通路具有多功能性,它的失调可以通过引发与许多病理相关的异常先天免疫反应来破坏细胞和有机体的稳态。目前关于影响宿主保护性和致病性的因素仍处于研究中,但似乎在大多数情况下起主要决定因素的是cGAS-STING信号的强度和长期性。考虑到这一点,研究人员已经或仍在努力确定策略,以便在各种疾病环境中选择性调节cGAS-STING的活性。
我们注意到目前有些重大的研究正在进行药物探索工作,以鉴定并转化出cGAS-STING途径的激动剂作为疫苗佐剂或抗癌免疫刺激药物,这些工作在最近的综述中也已经被广泛讨论过了。相比之下,在这篇综述中,我们重点关注cGAS-STING通路作为炎症性疾病的主要驱动因素的新进展。
我们简要总结了目前对于cGAS-STING通路信号通路的理解现状,概述了在不同病理生理背景下触发cGAS-STING通路活性的分子机制,并分析了其在疾病临床前模型中的作用。根据对cGAS-STING通路结构和调控的最新了解,我们研究了针对该通路的药理学干预策略,并讨论了它们在治疗炎症和自身炎症疾病中的治疗潜力。
cGAS-STING通路概述
在不同的物种中,cGAMP的合成被认为是启动cGAS介导的抗病毒作用关键的第一步。在哺乳动物中,cGAS与dsDNA相互作用后,它的催化活性被触发,这个过程已经通过广泛的结构研究和生化研究被详细了解过了。
简而言之,人cGAS(h-cGAS)的C末端部分含有核苷酸转移酶结构域(催化部分),包含带正电荷的DNA结合位点,一个主要位点和两个附加位点,它们与DNA的糖-磷酸骨架结合。DNA与主要位点(即所谓的A位点)结合会引起蛋白质的构象变化,从而重新排列酶的催化口袋,以实现与底物腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和三磷酸鸟苷(GTP)酶的最佳相互作用,而DNA与并列的B-位点结合位点对于核心2∶2 cGAS DNA复合物(最小的活性酶单元)的形成至关重要。
在长的dsDNA分子上,cGAS二聚体将自身排列成梯状网络和互相分离的细胞器。这种空间结构的形成限制了高级 cGAS-DNA复合物的装配,是触发生物效应的关键步骤。这种激活模式为活细胞提供了一种重要的内在保护机制:即,只有当更长的dsDNA长度超过某个信号阈值时,才能启动cGAS信号传导。相反,cGAS在有限的和短的dsDNA上的虚假激活则被阻止。
通过内质网(ER)膜蛋白STING检测cGAMP(图1)。STING由一个短的胞质N末端片段、一个四跨膜结构域、一个连接器区域和一个具有C末端尾(CTT)的胞质配体结合结构域(LBD)组成。STING已经以apo形式(即在没有配体的情况下)形成结构域交换的同源二聚体,它在与cGAMP结合时会发生广泛的构象重排,包括LBD的解旋(180°旋转),LBD向内的旋转和形成覆盖LBD的有序β-折叠
总之,这些变化帮助STING二聚体发生并列寡聚化。通过跨越分离的STING二聚体的二硫键,以及两个半胱氨酸残基C88和C91的棕榈酰化,可以进一步促进STING的寡聚化。因此,低聚的STING二聚体能形成激活的STING单元,能够启动效应器功能。有趣的是,经典的环状二核苷酸以及某一类小分子STING激动剂在覆盖区域的构象不发生重排的情况下具有激活作用,但仍然可以促进寡聚化。
图1:cgAS-STIng信号通路综述
在细胞水平上,启动下游信号的先决条件是STING从ER通过ER-高尔基中间室(ER–Golgi intermediate compartment,ERGIC易位到高尔基体。迄今为止,参与这一运输过程的假定参与者之间的精确分子步骤和相互关系尚未完全被清楚。我们知道,经典的ER到高尔基体的运输机制会促进STING的运输,该运输机制由外壳蛋白复合物II(COPII)囊泡组成,这个过程依赖于GTP酶SAR1A和COPII复合物组成,包括SEC24C以及ARF-GTP酶ARF1。
研究人员已经提出了各种因素以此促进STING的调节、激活依赖的STING输出,或者在非刺激条件下被锚定在ER上。当到达ERGIC和高尔基体隔间后,STING会招募TANK结合激酶1(TBK1)来启动下游信号传导(作者会在后文详细讨论)。同时,STING离开ER后也促进了微管相关蛋白1轻链3(LC3+)自噬囊泡的形成。
关于人类基因研究(见下文)的最新见解揭示了一种机制,该机制在机体稳定状态下运行并主动将STING从高尔基体恢复到ER以抑制细胞活化。具体来说,衔接蛋白SURF4(一种跨膜货物受体)在高尔基体上与STING相互作用,以促进STING封装到COPI囊泡中进行逆行运输。虽然未来的工作需要研究者细化完善STING在细胞内运输目的地的分子协调机制,但它们似乎与STING一样,最终都在溶酶体中被降解。
cGAS-STING通路激活的效应
纵观整个进化史,cGAS-STING通路的激活似乎有助于防止病毒感染,并与抗病毒细胞程序相关。在人和小鼠细胞中,cGAMP信号最显著的下游效应器功能是从头合成抗病毒I型干扰素和相关基因产物,通常认为它们解释了该途径的大部分抗病毒功能。
然而,cGAS-STING途径也存在于原核生物,以及海葵和果蝇等物种中,它们不编码I型干扰素。因此,cGAS-STING最初依赖于进化更古老的抗病毒防御策略,这些策略仍然在人类细胞内发挥作用,并且对cGAS-STING途径的各种生物学后果非常重要(图2)。
图2:cgAS-STIng效应机制与cgAmP细胞间传输
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cGAS-STING对转录应答的调控
迄今为止,cGAS-STING激活控制干扰素调节因子3(IRF3)的激活,及其对I型干扰素和其他干扰素刺激基因(ISG)的诱导的过程是被了解得最为清楚的。STING的CTT首先通过保守的PLPLRT/SD氨基酸结合基序招募TBK1,促进二聚化介导的TBK1自磷酸化。活化的TBK1反过来在CTT中磷酸化STING的Ser366位点(除非另有说明,我们指的是人类蛋白序列),这是pLxIS基序的一部分(其中p代表亲水残基,x代表任何残基,S代表磷酸化位点),使得STING-TBK1复合物能够招募IRF3。TBK1磷酸化IRF3,使其发生二聚化、核易位和靶基因诱导。
除了I型干扰素和ISGs,IRF3活性也是许多其他靶基因的诱导所必需的,包括编码炎性细胞因子的基因(如白细胞介素6(IL6)和白细胞介素12(IL12))。不足为奇的是,IRF3控制的转录输出随着所研究的细胞类型、使用的STING触发器和确切的体内环境而有很大差异。
至关重要的是,前面提到的STING的寡聚化对于这些事件的发生非常重要,因为由于空间限制,一个给定的STING二聚体不能同时作为TBK1及其底物的对接位点。总之,干扰STING的寡聚化会显著降低其促进I型干扰素上调的能力。
毫无疑问,I型干扰素对STING的抗病毒活性至关重要。然而,STING在免疫中的作用不仅仅受I型干扰素信号控制。最近的一个例子证明,携带STING突变的小鼠可以选择性地影响其诱导I型干扰素的能力,但仍能抵抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的感染,而完全缺乏STING的小鼠则易受感染。
STING通路另一个主要信号模块是核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(NF-κB)介导的转录激活。这种依赖于STING的活性并不完全依赖CTT。因此,虽然TBK1本身可以促进NF-kB的激活,但它不是必需的,这条信号传导可以通过IKKε的上游TAK1和IκB激酶(IκB激酶即IKK;IκB即inhibitor of NF-κB,核因子κB的抑制蛋白)复合物来补偿,至少在某些细胞类型中是这样的。
与这个观察结果一致的是,昆虫和早期后生动物的祖先STING同源物完全缺乏CTT信号,但仍可通过促进NF-kB反应来发挥宿主防御的作用,研究人员认为这可能构成了一种典型的STING依赖性抗菌机制。
有趣的是,某些脊椎动物鱼类,如斑马鱼和其他有鳍的鱼类,已经获得附加在CTT上的额外基序,通过募集肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)进一步促进NF-kB的激活。尽管STING介导的NF-κB转录似乎是一种高度保守和相关的下游活动,但STING与NF-κB通路组分在分子分辨率上的相互作用仍不清楚。
cGAS-STING的刺激也可以通过p52-RELB(p52和RELB是NF-kB家族的成员)核转位促进非经典NF-kB应答,这种信号输出限制了I型干扰素和经典NF-κB信号传导,成为STING效应机制的关键负调节因子,可能对癌症免疫逃逸和转移产生重要的生物学后果(见下文)。
在某些情况下,cGAS-STING信号可能另外影响p53(人的抑癌基因编码的蛋白之一),丝裂原活化蛋白激酶p38(MAPKp38,分子量为38kD的促分裂素原活化蛋白激酶)和信号传导及转录激活蛋白3(STAT3)信号,表明STING可能通过其他途径影响细胞状态和细胞因子的产生。
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cGAS-STING和自噬
到目前为止,讨论集中在STING介导的对基因转录的调控上,但STING也促进了更直接的(抗病毒)细胞过程,自噬是一个关键的效应活动。事实上,cGAS-STING信号与自噬密切相关。作为一种细胞自主防御机制,cGAS-STING不仅会诱导自噬,而且还会受到自噬成分的调节。
一些较早的研究探索了STING和自噬之间的联系,但在诱导自噬的确切机制上存在一些尚未解决的问题,这可能反映了一个强烈的环境依赖的调控因素存在。虽然经典自噬通过依赖ULK复合物和TBK1可以调控STING介导的自噬囊泡的形成,但似乎STING的激活也可以触发非经典的自噬反应,只需要选择性的自噬机器组分,包括磷脂酰肌醇(磷脂酰肌醇 )效应子WD重复域磷酸肌醇结合蛋白2 (WIPI2)和自噬相关蛋白5-12-16L1( autophagy related protein,ATG,自噬相关蛋白;ATG5-12-16L1,自噬相关蛋白5、自噬相关蛋白12和自噬相关蛋白16组成的延长复合物)复合物。
STING诱导的自噬限制了病毒的繁殖,并可能在某些物种中作为一种主要的宿主防御机制,这与STING在细胞自主抗病毒免疫中的关键作用相符。对人类来说,STING-自噬的联系似乎为宿主提供了额外的好处。因此,最近的一项研究报道,在复制危机期间,细胞参与STING-自噬途径来驱动自噬细胞死亡程序,从而阻止肿瘤细胞的生长。
值得注意的是,通过协助STING的胞内运输能力及其在溶酶体降解,自噬的组件还能反馈对STING活性的调节。因此,缺乏自噬蛋白或用药物抑制溶酶体酸化的细胞,显示I型干扰素的产生增强。在肿瘤中干扰自噬通路成分能以STING依赖的方式增强抗肿瘤策略的有效性,这与cGAS-STING途径活性的增强是一致的。
自噬还可以通过将胞质DNA传递到溶酶体并被脱氧核糖核酸酶II(DNase II)降解来阻止STING的激活。总之,自噬是STING的一个关键的下游活动,它不仅是一个重要的下游效应器,也是通路参与后恢复稳态的关键协调器。
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抗增殖和细胞死亡功能
STING的激活会启动支持抵抗细胞增殖状态的级联反应,包括细胞衰老和最终的细胞死亡(下面将进一步详细讨论衰老问题)。为此,STING促进了细胞周期抑制剂(P21)和促凋亡BH3-only蛋白 [Bcl-2 homology domain 3, BH3; Bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)编码产物; BH3-only蛋白是Bcl-2家族中具有凋亡启动作用的亚家族,仅含有家族4个同源结构域(BH1~4)中的BH3域] 的诱导。
另外,磷酸化的IRF3还能以更直接的方式与促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2,B淋巴细胞瘤-2基因;Bcl-2 Associated X Protein, BAX, Bcl-2相关X蛋白)和BAK(BAK是Bcl-2家族的一种促凋亡蛋白)相互作用诱导STING下游发生凋亡,这种方式不依赖转录。
在细胞凋亡被抑制的情况下,STING激活也可以通过参与I型干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路促进受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)依赖性坏死性凋亡。细胞是如何平衡STING激活后这些不同的结局仍然是一个正在进行研究的问题。
但似乎细胞是否死亡取决于环境,并受到细胞类型和特定细胞环境的影响(有丝分裂相对于间期)。淋巴细胞和单核细胞似乎会在STING激活后最先死亡,在STING发生极度活跃的突变的人中也可以观察到这一现象 (见下文)。由于细胞死亡是炎症条件的关键启动因子和扩大器,在考虑STING介导的炎症过程的起源和/或后果时,记住这些效应功能是很重要的。
细胞间cGAMP信号网络
cGAS和STING是通过一个可传递的第二信使分子连接,这一发现在很早之前就提出一个观点,即该途径还可能通过cGAMP的细胞间交换来协调多细胞免疫反应。事实上,尽管我们还没有发现细胞外不同的cGAMP信号传导模式,但我们现在认识到cGAMP诱导的免疫参与了大量的细胞间通信,极大地放大了整体免疫反应,具有重要的生物学作用。
反式信号中的cGAMP现象最初被证明是由缝隙连接介导的,缝隙连接是由连接蛋白构建的细胞间通道,能够直接连接相邻细胞的细胞质。细胞经DNA转染或病毒感染后,cGAMP从产生细胞扩散到周围的旁观者细胞,引起STING的显著激活,增强抗病毒免疫。
缝隙连接不仅可以在相同类型的细胞之间形成,也能在更多的异质细胞群中建立,这些异质细胞群能在生理免疫反应的背景下相互作用。因此,研究人员发现缝隙连接介导的cGAMP传递可以放大癌症环境下的炎症反应,癌细胞是cGAMP的产生者,星形胶质细胞或树突状细胞(DCs)是cGAMP的接受者。根据具体的情况,这可能对肿瘤进展产生有益或不良的影响。
此外,cGAMP在肝细胞之间的传播被证明会加重酒精引起的肝损伤。显然,这种传播机制在空间上仅限于紧邻的周围细胞层。相比之下,囊泡、垂死的肿瘤细胞和病毒也被证明可以是cGAMP的载体,这使得cGAMP跨越更长的距离。这两种传输模式的共同之处在于,它们将避免cGAMP暴露于细胞外空间。这一点可能会很重要,因为胞外空间是细胞表达外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(ENPP1)的地方,它是一种能够降解cGAMP并因此抵消cGAMP驱动细胞间通讯的不确定的酶。
然而,最近的研究报道了多种非特异性跨膜载体,这些跨膜载体能够通过跨细胞膜运送cGAMP及其衍生物,包括溶质载体家族成员和体积门控阴离子通道。例如,LRRC8可以促进cGAMP进入细胞,如果从基因上去除该功能就会损害机体对HSV-1感染的防御。在癌症的临床前模型中,跨膜叶酸受体还原型叶酸载体(SLC19A1)介导的cGAMP内化对涉及通过向肿瘤内注射cGAMP药物的免疫治疗效果至关重要。
同样,腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)门控的P2XR7(ATP受体P2X家族的一种亚型)介导的cGAMP摄取可以促进机体抗肿瘤免疫。在沿着物理化学梯度扩散的基础上,这些特定的入口也可能反转其功能,在某些情况下促进cGAMP的输出。
一般来说,细胞间运输系统的活性极大地依赖于细胞类型和激活状态,因此,它们对cGAMP介导的免疫反应的作用可能极大地依赖于(局部的)细胞组成和组织的‘激活’状态。未来需要进一步探究它们对炎症性疾病状态的作用,这可能有助于阐明细胞间扩增环作为cGAS-STING通路异常激活的新靶点。
cGAS-STING感知细胞微小的扰动
cGAS-STING介导的细菌免疫不是被病原体特异性结构模式激活,而是似乎依赖于一种间接的危险感知方式,即克服自我抑制且或许自我平衡的机制,cGAS-STING通路获得DNA配体介导的变构激活模式,这使得它作为经典的模式识别受体发挥作用,cGAS能识别与环境无关的自身DNA并推动机体危险感知,使哺乳动物细胞也能受益于此。
同样地,几种无菌性疾病状态以细胞DNA稳态丧失为特征,cGAS-STING通路激活的不同机制已经被探究清楚,具体如下图3所示。重要的是,这些不同的激活模式并不是相互排斥的,而是可能在某些情况下以冗余的方式触发cGAS活性,而在另一些情况下以协同的方式触发cGAS活性。
图3:cgAS-STIng在无菌炎症条件下活性的机制
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由细胞外自身来源的DNA激活
非凋亡性细胞死亡可导致非程序性的细胞外DNA释放,一些与死亡细胞增加相关的情况与cGAS和/或STING的激活有关。例如,照射原始肿瘤所处的区域会促进DC中肿瘤细胞来源的DNA的内化,从而引起cGAS-STING的激活。同样地,急性缺血事件(包括冠状动脉闭塞)引起的同步细胞死亡,促进了单核细胞的募集和激活,这是一种依赖于STING的炎症事件。
佐剂介导的细胞死亡已被证明可通过STING促进免疫激活。此外,中性粒细胞胞外杀菌网络(NET),与各种无菌性炎症性疾病相关,导致细胞死亡和中性粒细胞DNA-蛋白质复合物被排出到细胞外空间,进而激活STING。
这些不同的机制似乎有一个共同点,即主要的应答细胞类型是髓系起源的,这表明了与细胞吞噬胞外物质能力的关联。内化的DNA是否只是使稳态处理机制负荷过载,是否有特定的宿主因子参与促进cGAS对细胞外DNA的识别,目前仍不清楚。
然而,已知的是,凋亡细胞尸体受调控的周转受损也可以触发cGAS-STING活性。这方面被研究得最好的例子是DNase II的缺乏,这是一种溶酶体脱氧核糖核酸酶,对机体降解凋亡细胞来源的DNA至关重要。从机制上讲,这种表型与肝巨噬细胞中濒临死亡的红细胞的累积有关。
最近的研究进一步阐明了那些可能在凋亡细胞中调控DNA降解和阻止cGAS活性方面发挥作用的上游因素。微管相关蛋白1轻链3相关吞噬作用(microtubule-associated protein1 light chain 3,MAP1LC3即LC3,微管相关蛋白1轻链3LC3-associated phagocytosis, LAP, LC3相关的吞噬作用)是一种非经典的自噬形式,在巨噬细胞和其他类型细胞中吞噬体成熟和下游(免疫)信号事件的调控中发挥重要作用。研究表明,缺乏LAP成分可促进髓系细胞内的STING活化。
外观察到T细胞膜蛋白4(TIM4)的缺乏与这种表型类似,可能表明了特定的凋亡受体通路将胞外DNA推向免疫沉默的降解过程。然而,如果这一途径被阻断,DNA内化被其他机制介导,cGAS-STING可能随之被激活。考虑到细胞外DNA是许多炎症表型背后的主要因素,更好地理解细胞外DNA的分子的摄取路径将是重要的。
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被细胞固有线粒体DNA激活
在大多数情况下,线粒体(mt)DNA释放到细胞质中已成为激活cGAS-STING通路的一个重要的触发器。众所周知,病原体会产生各种干扰线粒体完整性的信号,这表明通过cGAS-STING识别mtDNA可以作为一种指示感染存在的重要信号手段。支持这一观点的是,有研究已经发现了,对HSV-1和登革病毒的抗病毒免疫至少在一定程度上依赖于cGAS对mtDNA的识别。
此外,还有研究发现某些结核分枝杆菌菌株通过释放mtDNA来驱动cGAS活性,尽管在这种特殊情况下引发的I型干扰素反应可能有利于病原体而不是宿主。线粒体功能失调和随之而来的mtDNA水平升高,也可能通过细胞因子信号传导的作用伴随无菌炎症过程。例如,标志性的炎症细胞因子白细胞介素1β(IL-1β),它和干扰素α(IFNα)都可能破坏线粒体稳态,并通过mtDNA参与cGAS的活动触发扩大性免疫反应。
可能通过这样正面的调节机制,多种细胞因子信号程序能通过cGAS识别mtDNA导致炎症增强。由于磷酸酶和张力蛋白同源基因诱导的假定激酶1 (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, PTEN, 磷酸酶和张力蛋白同源基因;PTEN Induced Kinase 1, PINK1, PTEN诱导的假定激酶1)和Parkin的突变导致受损的线粒体清除障碍与STING的活性有关,表明线粒体自噬是一个重要的组成型细胞过程,制约着异常免疫激活。
与基因组核DNA相似,mtDNA完整性、复制和修复过程的中断可导致cGAS-STING信号传导。其中研究得最为清楚的例子之一,是转录因子A线粒体(TFAM)耗尽后mtDNA封装成类核缺陷,是不同细胞中cGAS活性的一个显著信号。
此外,线粒体内切酶G缺失或化疗药物治疗引起的mtDNA应激可通过cGAS激活细胞。在这些和其他情况下,mtDNA也可能被线粒体活性氧修饰,这可以使mtDNA对核酸酶3'-核酸修复外切酶1(TREX1)的处理更具抗性,从而具有更强的刺激性。
线粒体解体最显著的细胞事件是细胞凋亡,这是一种基本的细胞死亡非炎症机制。现在已有令人信服的研究结果支持,凋亡的半胱天冬酶一个重要功能是损害cGAS对mtDNA的感知,从而维持凋亡细胞死亡的免疫沉默机制。半胱天冬酶究竟如何发挥这种抗炎功能的过程还没有被完全阐明,但一个潜在的可能性是,这个过程与cGAS的调控剪切及其下游转录因子干扰素调节因子3(IRF3)有关。
与mtDNA介导cGAS激活的重要性相比,mtDNA易位进入胞质的机制是最近才被研究。为了到达胞质,mtDNA必须克服两个障碍——内线粒体膜(IMM)和外线粒体膜(OMM)。在细胞发生凋亡的背景下,位于OMM中的BAX/BAK大孔已被证明可作为mtDNA通过内核膜(INM)破裂突出的通道,进而逃逸到细胞质中。
重要的是,除了细胞凋亡,该过程具有同步化以及完整的线粒体线粒体外膜通透性(MOMP)的特征,细胞还可能经历更有限的MOMP形式,仅影响少数线粒体。这种微小的MOMP可以提供一种解释,那就是MOMP是如何在更细微的(线粒体)应激反应中与cGAS-STING通路连接的。
此外,依赖电压性阴离子通道蛋白1(VDAC1)和VDAC3的寡聚化导致孔在OMM中形成孔,从而使mtDNA片段到达细胞质。IMM的通透性如何尚不完全清楚,但它可能涉及线粒体通透性转换孔(MPTP),该孔跨越IMM并导致不同的细胞应激。
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细胞内在基因组DNA激活
分子独特的疾病相关过程已被确定为细胞固有基因组DNA激活cGAS-STING通路的基础。到目前为止,大多数这些过程的特征是细胞核DNA在细胞质内的积累,以此提供一个简单的外部DNA激活cGAS的机制。然而,cGAS在细胞核内的定位展现了一种可能性,即在疾病条件下,异常的cGAS活性也可能直接来自对细胞核内基因组DNA的感知(框1
1|核内cgAS抑制的机制
长期以来,基因组DNA在细胞核中的分隔一直被认为是保护基因组DNA免受环状GMP-AMP合成酶(cGAS)检测和自动反应的关键机制。然而,一部分cGAS在稳定状态下存在于细胞核中,这意味着存在强有力的抑制机制,限制其在染色质上的催化活性。最近的研究已经展开了分子机制,以不同于纯粹的物理分离的方式,通过关注限制DNA可及性或与核糖体的抑制性接触,使cGAS在完整的染色质DNA上快速沉默。
首先,通过其与DNA普遍结合的能力,屏障-自整合因子(BAF)通过动态置换其与基因组DNA的关系来防止cGAS的活动。在急性核破裂事件中染色质短暂暴露时,以及在cGAS核定位增强后,这一保障措施都是相关的。
第二,cGAS与核小体有很强的抑制关联,核小体能抑制cGAS的催化活性。结构研究表明,与核小体的结合主要是通过一个双向界面实现的,该界面一方面介导cGAS与由H2A-H2B二聚体形成的核小体表面的酸性斑块相互作用,另一方面与核小体DNA相互作用。
值得注意的是,在具有Aicardi-Goutières综合征表型患者中发现了LSM11和RNU7-1的突变,这两个基因是调节新组蛋白转录的基因。研究发现,这些基因的缺陷会扰乱连接子组蛋白H1的表达,从而触发cGAS定位异常,以及产生cGAS和干扰素基因刺激因子(STING)依赖的I型干扰素。
总之,这表明不同的机制之间存在着动态的和环境依赖关系--DNA结合的竞争,限制核小体核心粒子和连接子组蛋白的无限制的进入和抑制——这显然是实现核内染色质上cGAS的适当水平调控所必需的。
早期研究认为细胞质中逆转录转座因子的富集是I型干扰素应答的强有力的触发器。研究人员可能认为,在逆转录病毒感染的情况下,对逆转录因子的感应实际上可能代表了cGAS的一个主要功能。逆转录转座子序列占据了人类基因组的相当一部分,但这些序列中的大多数被严重截断,因此被认为是无功能的。
虽然所谓的长散在重复元件-1 (sLong Interspersed Elements-1 , LINE-1,长散在重复元件-1即L1)仍然可以进行逆转录,但各种作用可以抑制L1元件在稳态条件下活细胞内的增殖。然而,由于互补DNA(cDNA)中间体的不合理的积累,内源性逆转录元件在监测策略的不平衡可能触发cGAS活性。
cGAS直接识别明显逆转录转座子活动的研究的最好例子是TREX1的缺失,它通过裂解DNA中间体来自然拮抗这一过程。TREX1的缺乏导致小鼠组织和人神经干细胞中L1元件的积累。在衰老过程中,通过表观遗传改变,逆转录因子上游进一步的去抑制自然发生,这导致了细胞质L1和cGAS-STING依赖的炎症反应。鉴于L1元件的逆转录被认为是发生在细胞核内,这些cDNA中间体是如何准确地输出到细胞质中还有待完全阐明。
另一类明显的细胞固有刺激性DNA产物来自于DNA损伤和有缺陷的复制及修复过程。控制这些过程的一系列基因的突变或缺失,已成为将DNA损伤与cGAS-STING信号激活联系起来的典范。同样地,各种外源性基因毒性处理与细胞内cGAS依赖的I型干扰素反应有关。
然而,重要的是,在DNA积累和随后的cGAS参与的机制存在巨大差异。首先,在某些条件下,游离DNA损伤产物被报道会直接到达胞质,尽管这些产物是如何穿过核膜的仍不清楚。或者,未修复或严重受损的基因组DNA会促进染色体错误分离和微核形成或有丝分裂中染色体桥的产生。一旦断裂,胞质cGAS可以进入微核内受损的染色质,在基因组不稳定的几种情况下导致免疫激活。另外,包膜的染色质片段也可以从衰老细胞的主核中出芽,这被认为是由于核纤层脆性增加所致。
cGAS-STING在疾病环境下的活化
在细胞和生物体水平上对DNA丰度、分离和清除的适当调节,有着内在显著复杂性,使其容易受到干扰。尽管病理过程的诱导剂具有疾病特异性,但有证据表明cGAS-STING通路作为多种病理相关的(超)急性和慢性、低度炎症状况的驱动者,具有相当大的参与性。由于其作为一种普遍存在的、对外部DNA识别敏感的机制,这可能并不令人惊讶。此外,初步证据表明,细胞内运输途径的不平衡会对STING活动产生深远的影响,并导致不恰当的免疫激活。下面我们重点介绍cGAS-STING通路在不同疾病过程中的影响,并在表1中总结了这一方面的其他文献。
表1:cgAS-STIng通路与炎症性疾病的关系
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cGAS-STING在单基因疾病中的意义
罕见的单基因自身炎症性疾病与参与先天免疫或控制先天免疫稳态的基因突变有关。在此,我们简要强调了一些与cGAS-STING驱动的发病机制相关的条件,这意味着有机会在抑制cGAS和STING的基础上进行干预。有关I型干扰素病,尤其是伴发Aicardi-Goutières综合征(AGS, 是一种主要影响大脑、免疫系统和皮肤的遗传疾病)的更全面评论,我们参考了近期关于该主题的优秀评论。
STING的功能获得性突变
罕见的STING1 [以前称为编码跨膜蛋白173的基因(TMEM173)]突变可导致小儿发生一种严重的自身炎症综合征,称为STING相关血管病,并在婴儿期发病(STING-associated vasculopathy with onset in infancy, SAVI, 干扰素基因刺激蛋白相关婴儿期发病血管病变)。
SAVI的特点是反复发热、溃疡性皮肤病变、血管炎和间质性肺病,并且大部分是由STING1中的常染色体显性突变驱动的,尽管最近发现了驱动SAVI发病的常染色体隐性突变。突变残基位于STING上两个独立区域周围,即二聚化界面,更准确地说是连接器螺旋环(N154S、V155M和V147L,均为突变残基)和聚合界面(G207E、R281Q、R284G和R284S)。
从机制上讲,人们认为,引发疾病的替代物会触发配体非依赖的STING激活,这可以通过诱导LBD沿连接器螺旋环自发旋转,或通过促进STING聚合以可能减轻抑制性相互作用这两种方式导致的。在细胞水平上,这些突变导致STING自发运输到高尔基体并激活下游信号传导,从而导致患者原代细胞中I型干扰素特征增加。
在小鼠中,SAVI突变(敲入N153S或V154M;小鼠残留物)的引入会导致肺部疾病、细胞因子的产生、皮肤溃疡和过早死亡。小鼠SAVI模型的一个显着特征是,由于淋巴细胞发育异常和固有T细胞异常,而导致严重的淋巴细胞减少和免疫缺陷的发育。在SAVI患者中也观察到T细胞数量减少和抗增殖作用,尽管这些特征与在小鼠中观察到的其他特征相比,并不那么突出。
值得注意的是,在SAVI的N153S小鼠模型中,阻断I型干扰素信号或阻断坏死性凋亡对疾病发病没有影响,而消耗T细胞则可以保护N153S小鼠免于患上肺部疾病。人类的临床表现在多大程度上依赖于I型干扰素信号或T细胞介导的免疫病理学尚不清楚。
在Aicardi-Goutières综合征和DNase II缺乏中DNA驱动的炎症
AGS是一种罕见的遗传疾病,由多种与核酸感应或代谢相关的基因驱动。这种疾病的主要特征是早期出现进行性脑病和皮肤病变(被称为冻疮),而其他特征都是常见的,据报道患者个体之间存在相当大的临床异质性。这些基因子集(称为TREX1,编码三个RNase H2核酸内切酶亚基,RNASEH2ARNASEH2CSAMHD1的基因的突变)与干扰的自身DNA代谢和cGAS-STING途径的组成性激活有关。因此,AGS相关基因缺乏或突变的小鼠已经被研发出,并且来自这些动物的数据表明,cGAS或STING的共同缺失逆转了在小鼠中观察到的这些发病机制。
最近,有研究发现一种I型干扰素信号升高的临床综合征是由DNASE2的亚等位基因突变引起。与AGS不同,该疾病表现为新生儿贫血、肾脏疾病和关节病。Dnase2-/-小鼠在胚胎发育过程中因严重贫血而死亡,如果与干扰素α受体( Ifnar)缺失的小鼠杂交,则会出现关节炎表型。从这个意义上说,小鼠模型虽然更严重,但与患者的特征重叠。
值得注意的是,cGAS或STING的缺失可保护Dnase2-/-小鼠免于发病。重要的是我们要记住,在这些临床前模型和DNA代谢突变的患者之间,在总体疾病的严重程度、疾病发展的变异性和特定器官系统的参与方面,表型结果存在相当大的差异,尤其是在神经系统表型方面,这在小鼠模型中是没有的。尽管如此,这些遗传疾病模型明确支持以下观点:cGAS-STING信号传导驱动自身炎症性疾病特征,并且阻断cGAS或STING的药物可用于治疗这些疾病。
COPA综合征
衣被蛋白I(COPI)对于蛋白质从高尔基体到ER的回收和高尔基体内部的运输至关重要。COPA综合征是一种罕见的早发性常染色体显性疾病,由编码COPI复合物的COPα蛋白亚基的COPA基因错义突变引起;该突变破坏了内质网回收的目标蛋白的结合和分类。在临床上,患者通常表现为炎症性关节炎、间质性肺疾病和肾脏疾病,并在血液中表现出I型干扰素特征,在一定程度上让人联想到SAVI。
最近,四项独立的研究表明,COPA突变引起的缺陷促进了配体非依赖性STING介导的信号传导的激活,并且与COPA功能障碍相关的I型干扰素信号升高可以通过对STING的基因或药物干扰被减少。
在一个小鼠COPA综合征(CopaE241K/+)模型中,通过将这些小鼠与STING缺陷(STINGgt/gt)的小鼠杂交, I型干扰素驱动的炎症被逆转。此外,通过共同删除STING挽救了纯合子CopaE241K/E241K小鼠的胚胎致死率。总之,这些研究表明STING可能在COPA综合征的过度炎症表型中起重要作用。
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cGAS–STING在SLE和其他自身免疫性疾病中
由于I型干扰素和自身核酸均被认为是系统性自身免疫性疾病发病机制中的标志性驱动因素,因此,cGAS-STING信号通路在这些疾病中的参与引起了人们的极大兴趣。系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的慢性系统性自身免疫性疾病,据记录,在一项纳入41名患者的研究中,约15%的患者血清中cGAMP水平升高——这是cGAS通路活性存在的有力指标。
此外,从SLE患者收集的血清显示通过STING放大I型干扰素的诱导,为cGAS-STING如何放大或加速疾病症状提供了一种机制。TREX1的突变可导致单基因形式的皮肤狼疮,TREX1变异体已在大量SLE患者中被报道,尽管这些突变仅发生在一小部分患者中。
从动物模型来看,cGAS-STING信号传导在SLE发病机制中的相关性是可变的,并且很大程度上取决于所研究的小鼠模型。考虑到SLE的许多病理机制,这并不出人意料,而是反映了SLE在人类中的相当大的异质性。早期研究发现,在MRL.Faslpr狼疮小鼠中缺失STING会加重疾病表型。
相比之下,在另一个由狼疮易感基因Fcgr2b缺失驱动的狼疮小鼠模型中,对Sting1缺失的小鼠遭受各种疾病的表现有保护作用,包括自身抗体滴度升高和肾小球肾炎,并显示出总体存活率的提高。
此外,cGAS-STING在多种不同的模型中通过一系列机制促进狼疮样症状从而发挥致病作用。因此,凋亡细胞的胞外清除缺陷、来自濒死中性粒细胞的胞外NETs积累、mtDNA复制缺陷和内源性逆转录因子的失调已被认为易导致SLE的主要疾病特征的发展,并在SLE中呈现出异常cGAS活性似乎合理的机制。
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cGAS-STING在神经退行性病变中的意义
炎症是几种神经退行性疾病的显著标志,包括阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。最近的多项研究将cGAS-STING通路的激活与其中一些神经退行性疾病的发展联系起来。一个最具有说明性的例子是,最近发现了一种将受损的线粒体自噬与cGAS-STING信号激活联系起来的机制,该机制可能与帕金森病的病理学有关。
帕金森病是一种使人衰弱的运动障碍,由中脑黑质区产生多巴胺的神经元选择性死亡引起。PARKINPINK1编码的蛋白质有助于清除功能失调的线粒体,它们的错义突变与常见的帕金森病有关。在体内线粒体应激的情况下,发现缺乏ParkinPink1的小鼠会积累mtDNA并显示出血流中细胞因子水平升高,共同删除STING时则可完全消除这种现象。
重要的是,STING的缺失能逆转老年Parkin突变小鼠的运动缺陷和神经元细胞丢失,这些小鼠会出现类似于帕金森病患者的神经元异常。最近,研究发现通过识别mtDNA驱动的cGAS–STING依赖性炎症过程会触发神经病理学过程,这些过程与某些形式的ALS和额颞叶变性(FTLD)相关。
TAR DNA结合蛋白43(TAR DNA binding protein-43, TDP43),一种通常隔离在细胞核中的DNA/RNA结合蛋白,它在胞质和线粒体的积累是许多ALS和FTLD病例的标志。错误定位的线粒体TDP43导致mtDNA通过打开MPTP释放并通过VDAC1泄漏,然后在人和小鼠细胞中以cGAS-STING依赖性方式诱导I型干扰素和炎性细胞因子产生。
此外,来自ALS患者的运动神经元表现出STING依赖的炎性细胞因子上调。在由TDP43过表达驱动的ALS临床前模型中,STING的共同缺失抑制了神经炎症,减缓了疾病的快速进展并防止了疾病早期的死亡。
值得注意的是,在仅删除STING的一个等位基因或通过应用STING的药物抑制剂时,也会观察到神经退行性变的迹象减弱,最近另一份研究C9orf72水平突变(ALS和FTLD最常见的遗传原因)的生物学后果的报告也提出了与ALS相关的炎症和cGAS-STING活性之间的联系。C9orf72缺乏的髓细胞以及C9-ALS-/FTLD患者的细胞显示STING介导的I型干扰素和炎症介质的产生。从机制上来看,C9orf72的表达受损可能阻碍STING的快速降解,这与C9orf72在溶酶体囊泡形成中的调控功能一致。
最后,在亨廷顿病的模型和病例中,或是在由于细胞外蛋白质聚集形成的神经退行性变中,I型干扰素水平的升高和STING的作用也被观察到。未来的工作将需要进一步解剖参与cGAS-STING驱动炎症的细胞类型,并评估干扰cGAS-STING信号轴是否可能仅仅停止和减慢,或者甚至逆转与神经退化相关的分子变化。
总之,这些研究表明,尽管继发于大脑初始退行性变化之后,但cGAS-STING通路在不同类型的神经退行性变中的异常激活是相关的,抑制cGAS或STING可能改善某些疾病状态或减缓疾病进展。
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cGAS–STING原致癌基因作用的意义
由于cGAS-STING通路强大的免疫刺激作用,它是癌症免疫治疗一个有前景的靶点,具有特殊的转化医学吸引力。然而,与它们的肿瘤抑制作用形成鲜明对比的是,在癌症模型中,cGAS和STING也被认为参与了促进肿瘤负荷和更糟糕的疾病结果。
这就提出了一个问题,是什么决定了肿瘤中cGAS-STING活性的这些根本不同的结局?对cGAS-STING激活的动力学和强度的研究为回答这个问题提供了有价值的线索。因此,虽然短暂的激活似乎是有利的,但不利的影响似乎依赖于一种可以促进免疫抑制性肿瘤环境形成的慢性炎症性程序的刺激。例如,持续暴露于具有基因毒性的7,12-二甲基苯并蒽(DMBA),以STING依赖的方式促进肿瘤生长。
同样,STING介导的髓系来源的抑制细胞的募集促进了放疗后MC38(一种商品化的小鼠结肠癌细胞株)结肠癌的生长。STING配体也可以诱导抑制分子的表达,例如,细胞程序性死亡配体1(PDL1)或吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO1),或激活非经典的NF-kB信号,这抵消了I型干扰素的肿瘤抑制作用。STING对T细胞的促凋亡作用可能也有助于有限的肿瘤细胞清除。
除了塑造原发肿瘤部位的免疫细胞组成,cGAS-STING通路还影响其转移行为。事实上,通过激活STING信号,染色体不稳定的肿瘤通过非经典的NF-kB信号上调了与上皮-间质转化和转移相关的基因。此外,在到达未受影响的远端部位时,如大脑,转移性乳腺癌细胞也利用cGAMP转移来操纵免疫细胞,以获得自身的生长优势。虽然这些致瘤效应依赖于cGAS-STING信号,但最近的一份报告表明,核cGAS可以通过抑制同源重组以STING非依赖的方式直接促进不受控制的癌细胞增殖。
总之,这些方面表明了cGAS-STING通路在癌症中的复杂作用。在更晚期的疾病背景下,STING介导的炎症抑制可能允许侵略性癌细胞适应机体环境,克服机体的抗肿瘤作用并最终进一步优势生长和传播,这强调慢性STING信号传递可能是针对该通路的肿瘤治疗必须考虑的关键问题。
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cGAS–STING在衰老和老化中
在衰老过程中,维持组织和细胞内稳态的关键机制损毁,引起大量分子的积累,这些分子可以加剧不同物种(包括人类)老年时所特有的高度炎症状态。这一炎症过程的关键是衰老细胞,其特征之一是失去增殖能力并表现显著的分泌活性,称为衰老相关分泌表型(SASP),可损害组织功能。衰老细胞的缺失可以延长生命值和健康寿命,并改善一些与衰老相关的功能障碍。
此外,将衰老细胞移植到幼龄小鼠体内会加速一些与衰老相关表型的形成,这就强调了衰老细胞在调节衰老特征方面的关键作用。我们和其他研究小组发现,异常的cGAS-STING活性是一种跨多种类型衰老细胞的保守模式,这对几种SASP成分的分泌至关重要。
从机制上来讲,cGAS被发现在胞质染色质上富集,这些染色质可以在衰老细胞内积累,代表了在这种情况下cGAS的真正激活因子(见上文)。作为潜在的来源,细胞质DNA片段可能来自于微核破裂或染色质突出,这是慢性DNA损伤破坏核膜完整性的结果,这两者都是衰老细胞的特征。
另外,最近的一份报告提出,细胞内积累的逆转录转座元件可以在体细胞组织衰老过程中被重新激活,从而驱动cGAS依赖的I型干扰素反应。引人注目的是,使用核苷逆转录酶抑制剂拉米夫定抑制逆转录转座子转录,可以抑制自然衰老的小鼠和早衰症模型中多种组织的炎症发生迹象。
鉴于衰老细胞在其他疾病如骨关节炎和动脉硬化中被广泛关注,进一步研究炎症性衰老和cGAS-STING之间的关系是有必要的。与年龄相关的线粒体功能下降也是衰老的一个标志。有趣的是,T细胞中缺失TFAM(一个在多种情况下激活cGAS-STING活性的明星触发器)足以通过促进体内促衰老的炎症环境,来引发一种加速衰老的表型和多病症。
鉴于这些进展,人们很容易做出这样的推测,即异常的cGAS-STING信号可能促进它的促炎特性带来的功能衰退和与衰老相关的功能障碍。
cGAS-STING的靶向治疗
上述结果讨论了cGAS-STING参与许多病理,以及迄今为止不尽人意或未满足的治疗方案,预示着它作为药物靶点的巨大潜力。选择性靶向cGAS或STING的首个药物类化合物的出现为开发首个临床候选药物打开了大门。在这里,我们讨论了新兴的基于小分子的策略来靶向治疗疾病模型中的cGAS-STING信号。针对cGAS和STING的特异性试剂的化学结构分别见表2和表3。图4提供了它们作用机理的概述。关于人类STING等位基因变异的考虑因素见框2。
表2:所述cgAS抑制剂的化合物结构
表3:所述STIng抑制剂的化合物结构
图4:cgAS和STIng抑制剂的作用机制
2|与药物靶向相关的人类STING等位变异
在人类群体中可以发现STING1(以前称为TMEM173)的几个等位基因变体,其中一些似乎是编码功能改变的干扰素基因刺激物(STING)的蛋白质。与STING1编码的主要等位基因(称为STING R232)相比,次要的等位基因变体含有单个或多个氨基酸的变化;这些变体是STING R232H、STING HAQ(R71H、G230A、R293Q)、STING AQ(G230A、R293Q)和STING Q293。STING R232H和STING R293Q对2′3′环状GMP-AMP(cGAMP)都有反应性,但对3′3′细菌环状二核苷酸(CDNs)没有反应。
有趣的是,STING R293Q的缺陷被G230A残基的额外改变所缓解。据推测,G230A的替换改变了STING的覆盖区的构象,该区域与c-di- GMP结合,从而提高了相互作用的稳定性。关于HAQ等位基因变体的功能,存在争议,一些研究显示细胞对CDN的反应性普遍下降,而另一些研究则报告没有显著差异。值得注意的是,不同等位基因变异的等位频率在很大程度上受到人口种族的影响。因此,R232/R232在欧洲人中最常见,但在美国人中不到50%,而R232/HAQ是东亚人的优势等位基因。
总的来说,编码CDN-敏感缺陷STING变异的等位基因在10%的欧洲人和多达30%的东亚人中出现。有趣的是,非洲人群中没有HAQ/HAQ,而在它们其中可以找到非常特殊的等位基因如AQ/AQ和Q293。STING1中这种异质性的存在,强调了同时考虑自然发生的STING变异对于疾病和药理药物设计的重要性。该图描述了与cGAMP结合的人类STING配体结合域的结构(PDB: 4KSY)。
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cGAS抑制剂
鉴于cGAS对晶体学的适应性,许多报道都详细介绍了基于cGAS抑制剂结构的设计。以这种方式发现的大多数cGAS拮抗剂都与活性位点结合,从而与ATP或GTP底物或cGAMP产物竞争。文献中描述的另一类主要的cGAS拮抗剂与DNA竞争性结合cGAS,从而干扰了cGAS的初始激活步骤。以下部分将简要介绍这些cGAS抑制剂。
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催化部位抑制剂
PF-06928125
Hall等人对辉瑞片段库与截断的cGAS结构进行了核磁共振饱和转移差谱技术筛选1H NMR,核磁共振氢谱)。和表面等离子体共振(SPR)和荧光偏振(FP)试验一致,他们鉴定出了一个Kd为171 μM(SPR)的四唑罗[1,5-a]嘧啶片段。
X 射线单晶衍射技术[3.1埃米分辨率结构(Å,埃米,是晶体学、原子物理、超显微结构等常用的长度单位)]证实,该化合物与cGAS的活性位点结合,该活性位点通常被ATP或cGAMP的腺苷碱占据。利用这一信息和其他已发表的晶体结构,该团队修改了该片段的核心,并在活性位点内创建了另外的相互作用点,以识别吡唑嘧啶PF-06928125,在SPR测定该片段的Kd为0.2 μM,FP测定的Kd为4.9 μM。
虽然在生化检测中显示该化合物与cGAS结合,但在细胞实验找那个显示PF-06928125缺乏抑制活性。作者推测,由于细胞内ATP和GTP水平较高,抑制该片段的活性位点可能需要更有效的化合物。此外,他们提出,对核心进行额外的改变,用具有更高的pKa、更低的极性表面积和更少的氢键的基序来取代羧酸,可以提高最终的细胞效能。
RU.521
Vincent等人使用重组小鼠cGAS(m-cGAS)和快速质谱系统(RF-MS)进行了高通量筛选,以量化ATP、GTP和cGAMP的水平。通过对123,306种化合物的筛选,鉴定出了4种化合物,它们在硅片过滤器筛选假阳性化合物(PAINS)基序和反筛选去除DNA嵌入剂中都保留了下来。其中一个靶点(RU.365)通过dsDNA与cGAS结合的2.13 Å分辨率晶体结构,证实了该化合物占据了cGAS的活性位点。
随后通过以结构为导向的类似物化学合成鉴定了RU.521,通过等温滴定量热法测得Kd为36 nM。在细胞实验中(IC50 = 0.70 μM,IC50:半抑制浓度),该合物也是该系列中最有效的化合物,这通过测定dsDNA诱导的cGAS信号通路在RAW巨噬细胞中的抑制作用而获得。
与其他先天免疫信号通路相比,RU.521对cGAS的抑制作用是选择性的,它被证明可以降低Trex1-/-小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中干扰素β1(Ifnb1)mRNA的表达水平,表明该化合物在组成型激活体系中具有有效的潜力。
G150
Lama等人最近发现了一类新的活性位点靶向cGAS抑制剂。在这篇研究中,研究小组使用了一种新的基于发光的分析系统,使它们能够筛选h-cGAS。研究人员对281,348个化合物进行了筛选,筛选方法与鉴定RU.521相似。该筛选确定了两种主要的化学型(J和G),其中以吡啶吲哚三环核心的化学型G为起点,最终得到G150(RF-MS h-cGAS的IC50=0.0102 μM)。
通过IFNB1mRNA示值,G150在人单核细胞白血病(THP-1)细胞中的IC50为1.96 μM,在原代人巨噬细胞中的IC50为0.62 μM。在一系列检测其他先天免疫感应通路抑制的实验中,G150也未显示脱靶效应。G150和许多其它类似物的X射线结构证实了它们与cGAS活性位点的结合。然而,作者指出,他们还不能基于此信息对所有构效关系(SARs)进行合理化的解释,还需要做更多的工作来设计和开发下一代抑制剂。
化合物S3
Zhao等人破解了一个与PF-06928125结合的h-cGAS结构的1.8Å分辨率的晶体结构,然后他们利用这个晶体结构对ChemDiv数据库中大约150万种化合物进行了虚拟筛选。对59个用于生物测试的化合物进行热漂移实验,命中了4个阳性结果。这些命中的共晶体结构揭示了它们结合cGAS活性位点的方式与虚拟筛选的对接模型具有很好的相关性。
然而,随后在PP偶联检测cGAS催化活性的方法中对这些化合物的评估表明,它们并不抑制cGAS的酶活性。相反,在PP偶联试验中筛检初始虚拟筛选匹配时,他们发现最初的59个匹配之一的IC50为29.9 μM,尽管它在热漂移实验中没有任何活性。
对这种化合物进行了相似性的扩大搜索,结合对接评估,确定了21种新的化合物可供选择。经过努力,他们鉴定出了化合物S3,它在PP偶联试验中的IC50为4.9 μM(在这个实验中,PF-06928125的IC50为2.1 μM,RU.521的IC50为5.7 μM)。作者比较了化合物S3与PF-06928125和RU.521的结合模式,并推荐虚拟筛选方法作为一种补充方法,以确定cGAS抑制剂的新起点。
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破坏DNA结合的抑制剂
抗疟疾药物
虽然抑制cGAS的活性位点是许多研究团队所追求的方法,但可能还有另一种策略是破坏cGAS与dsDNA的结合,因为dsDNA是cGAS的激活触发器。An等人报道了一系列可作为SLE的潜在治疗手段的抗疟药物(如羟氯喹和奎纳克林),这些药物通过选择性阻断cGAS-dsDNA的相互作用来抑制干扰素β(IFNβ)的生成。他们继续阐述了第二代分子X6的开发过程,该分子在体外和体内活性都有所提高。
研究表明,这些分子可以通过在DNA的小槽内嵌入和结合带正电的氨基侧链与DNA相互作用。因此,作者和其他研究人员假设这些分子通过与dsDNA结合,阻止cGAS-dsDNA复合物的形成,从而间接抑制cGAS的活性。
苏拉明
Wang等人筛选了一个小的具有268种化合物文库,并确定苏拉明为cGAS活性的抑制剂。一系列实验表明苏拉明可能通过在dsDNA-结合位点整合,破坏cGAS-dsDNA复合物的形成来抑制cGAS活性。作者还报道了他们观察到的cGAS抑制具有选择性,对Toll样受体1/2或Toll样受体4(Toll样受体,Toll-like receptors, TLR)通路没有影响。
虽然苏拉明分子是高度带电的,但它已被证明具有细胞活性。本文提出的一种可能的作用机制是苏拉明的阴离子硫酸盐具有类似磷酸盐的作用,并能结合到cGAS上的正电荷区。
抑制性寡脱氧核苷酸
A151是一个抑制型寡脱氧核苷酸,含有4个TTAGGG重复序列(5’-tt agg gtt agg gtt agg gtt agg g-3’)。最初的报道描述了它对TLR9信号和黑色素瘤 2 (AIM2)的抑制作用。
在最近的一份报告中,Steinhagen等人证明A151也可以通过与dsDNA结合域的相互作用作为cGAS的竞争性抑制剂。A151在DNA结合区域内的确切结合位点尚不清楚,但作者确定这种结合具有序列特异性和主链特异性。在本研究中,A151也能够抑制TREX1-缺陷细胞的I型干扰素应答,这增加了该方法治疗dsDNA驱动的自身免疫性疾病的可能性。
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作用机制未确定的化合物
Padilla-Salinas等人也以Hall等人研究的晶体结构为出发点来进行虚拟筛选。他们尤其瞄准了靠近dsDNA接触面的h-cGAS中Lys347和Lys394(在小鼠cGAS中为Lys335/Lys382)附近潜在的可靶向的口袋,目的是开发cGAS二聚体本身的蛋白质-蛋白质界面抑制剂。
他们利用已报道m-cGAS的共晶体结构,对Maybridge(53,000种化合物)和Enamine(170万种化合物)(Maybridge和Enamine为虚拟筛选常用化合物数据库)进行了一次虚拟筛选,确定了10种符合他们的筛选标准的化合物。在KinaseGlo(一种激酶发光检测试剂盒) cGAS体外实验中,只有一种化合物抑制了h-cGAS(1,3,5-三嗪Z918),其IC50为100 μM。他们开始致力于合成这个核心,并通过一系列优化,确定CU-76是一种有效的cGAS抑制剂(IC50=0.24μM)。
通过使用一系列类似于在RU.251和G150工作中描述的测定方法,研究人员确定了这些化合物对cCAS比其他信号途径具有选择性。作者无法获得CU-76与cGAS结合的晶体结构,尽管他们确认它并不像原假设那样破坏cGAS-dsDNA复合物的形成。因此,目前尚不清楚CU-76是与活性位点结合还是通过另一种机制抑制cGAS。
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STING抑制剂
到目前为止,文献报道了两种鉴定STING抑制剂的主要方法。首先是设计占据环二核苷酸(CDN)结合位点的分子,从而充当STING激活剂的竞争性拮抗剂。第二种方法是识别与STING蛋白跨膜结构域附近的Cys88或Cys91残基结合的抑制剂,这两种方法都受到棕榈酰化的影响。在下面的部分我们简要描述这些方法和代表性的STING抑制剂。
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针对CDN结合位点的STING拮抗剂
四氢异喹啉类
生物物理和X 射线单晶衍射晶体数据表明,STINGC端结构域是对称的二聚体,配体结合位点位于两个单体的界面上。Siu等人利用CDN-结合区域的对称特性设计小分子拮抗剂,可以在较大的CDN-结合位点结合两个相同的分子。利用基于质谱分析的配体筛选技术,他们发现了一个低亲和力的匹配物(化合物1,HAQ STING IC50=7.5μM)。
X射线单晶衍射结构测定表明,两个分子占据了CDN位点,而STING采用无活性的开放构象。这个团队确定了几个关键的极性和疏水性接触点,既包括占据结合位点的两个分子之间,也包括蛋白质本身。通过对这些接触点的SAR研究,包括对酸的pKa的修饰,确定了化合物18(HAQ STING IC50=0.08μM)。该分子以类似的方式与STING结合(每个STING二聚体有两个分子),并抑制cGMAP诱导IFNβ分泌,其在THP-1细胞中的IC50为11μM。
AstinC
Li等人从环肽文库的报告基因筛选中鉴定出天然产物astin C。使用生物素化的astin C和人STING进行拉下实验,证明astin C与CDN位点具有竞争性结合。此外,添加过量未标记的游离astin C(10倍)可消除生物素化astin C与STING的结合。
另外的机制研究显示,astin C阻断了将IRF3招募到STING信号转导体,从而阻止了该通路的下游信号传递。在体外,astin C抑制Trex1-/- BMDMs中I型干扰素在表达。研究人员还探索了astin C的体内活性,astin C以C-HP-β-CD包络物的形式对Trex1−/−小鼠进行给药,能强效抑制Ifnb、C-X-C基序趋化因子10基因(Cxcl10)、Isg15Isg56Tnf mRNA在小鼠心脏、肌肉、胃和舌内的表达,显示STING体内的调节作用。
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靶向STING棕榈酰化位点
硝基呋喃类(C-176和C-178)
我们从基于细胞[胚肾细胞(HEK293T细胞)表达小鼠STING]的筛选中鉴定了一系列硝基呋喃衍生物。利用蛋白质质谱分析和丙氨酸扫描,我们证明了这些抑制剂特异性地和不可逆地结合STING的Cys91,而不是附近的Cys88,这两者在由CDN刺激活化STING后都是棕榈酰化的。使用基于叠氮化物的可点击的C-176探针(C-176-AZ)和基于凝胶的蛋白质分析方法,我们发现C-176对含有高反应性半胱氨酸残基的一组蛋白质具有很强的STING选择性。
此外,C-176预处理小鼠显著降低了STING激动剂介导的血清中I型干扰素和IL-6水平的升高。另外,C-176处理Trex1−/−小鼠导致血清中I型干扰素水平显著降低,并强烈抑制心脏的炎症参数。
一组围绕C-176和C-178设计的类似物揭示了硝基和呋喃基团两者对化合物的活性是必不可少的。化合物C-176和C-178对小鼠STING具有特异性;然而,在苯环的4位引入丁基和己烷基(分别为C-170和C-171)显示出对人和小鼠的STING均有活性
吲哚尿素酶(H-151)
我们利用表达人STING的HEK293T细胞对一个有30, 000成员的文库进行了第二次筛选,鉴定出了3-乙酰氨基吲哚衍生物H-151。我们证明,H-151对人和小鼠STING均有活性,这是通过在多种细胞实验中I型干扰素反应降低、TBK1磷酸化被抑制和STING Cys91棕榈酰化被抑制证明的。
与前文讨论的硝基呋喃相似,蛋白质质谱分析表明H-151也与Cys91形成共价键。当H-151经腹腔注射小鼠,再经STING激动剂刺激后,显示系统性细胞因子反应被明显抑制。另外,对表达生物发光的IFNβ报告基因的Trex1−/−小鼠进行给药,1周后显示IFNβ报告因子水平降低。我们对以H-151为例的吲哚系列共价灭活STING的机制进行了推测。
硝基脂肪酸
Hansen等人表明硝基脂肪酸是在HSV感染后形成的。他们发现,内源性硝基脂肪酸(NO2-FA),如硝基亚油酸(NO2-cLA和硝基油酸(NO2-OA)通过迈克尔加成反应加成到脂肪酸的硝基烯烃共价修饰STING。基于细胞对NO2-FA的研究显示,NO2-FA处理的THP-1细胞和BMDMs感染单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)后I型干扰素降低。作者表明,NO2-OA不仅使His16发生烷基化,还以非选择性的方式使Cys88和Cys91发生烷基化。对来自SAVI患者的成纤维细胞的进一步研究(均带有功能获得性STING-N154S改变)表明,NO2-OA处理几乎完全抑制了pTBK1的上调。
丙烯酰胺类
Vinogradova等人使用基于化学蛋白质组学活性的蛋白质图谱绘制了T细胞中与亲电子小分子库反应的3,000个半胱氨酸。质谱分析表明,丙烯酰胺BPK-21和BPK-25与STING的Cys91以及其它免疫相关蛋白的半胱氨酸形成加合物。此外,该研究还表明BPK-25能抑制外周血单核细胞中cGAMP介导的STING。作者展示了这些丙烯酰胺与STING的Cys91结合的模型。
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机制未知的抑制剂
Huffman等人最近的一份报告详细介绍了丁烯酸内酯异二聚体库合成的机制研究。该团队对25万个化合物进行了基于细胞的表型筛选,以寻找cGAS-STING通路的抑制剂,最终鉴定出4个以丁烯酸内酯异二聚体为靶点的化合物,包括化合物13。化合物13处理THP-1细胞后给予dsDNA刺激,显示CXCL10 mRNA水平降低,这表明I型干扰素的诱导减少。虽然化合物13已经被证明可以调节cGAS-STING通路,但其确切的作用机制尚不清楚。
前景和未来的展望
在过去的几年里,人们对cGAS-STING通路的兴趣和知识日益增加,正如我们在前文所说的那样,它是先天免疫一个核心的危险感知机制。尽管还有很多有待了解,但有力的证据表明,在广泛的炎症性疾病背景下,对外部DNA的感知驱动了cGAS-STING信号的激活,从而使阻断这一途径的治疗效果合理化。
毫无疑问,我们需要继续努力,仔细验证从动物模型到人类疾病的临床意义,为cGAS-STING通路在疾病发病机制中的致病作用提供更精确的知识。这些活动将与固体生物标记物的进展,以及使用条件小鼠模型或选择性药物类化合物,分别在小鼠体内或体外人体样本中监测和抑制cGAS-STING通路活性的进展同步进行。
关于第一个方面,测量cGAMP的水平和Ser366 STING磷酸化是通路特异性的读长,可以作为有用的、反应性的临床生物标志物,忠实地反映cGAS-STING通路的参与。至于第二个方面,通过筛选的方法已经产生了首批具有药物类属性的化合物,通过干预疾病过程的不同阶段,使我们能够跟踪它们在原发的人类样本中的疗效,这将对遗传研究的补充具有巨大价值。
同时,现有的化学物质可以作为开发临床候选药物的有价值的基础。该途径的一个独特之处在于,它提供了两种可以连续作用的靶向候选药物——至少就DNA启动信号的转导而言是这样的。在提高疗效或安全性方面,一种药物的靶向治疗是否优于另一种药物仍不清楚。
未来一个关键方面将是更好地了解疗效所需的最低抑制水平。该信号通路的显著降低可能会增加人体对感染的敏感性,从而引发不良反应。这可能与需要重复或连续治疗方案的慢性疾病的治疗尤其相关。
尽管如此,直接靶向cGAS-STING比更多非特异性和广泛作用的抗细胞因子抗体或靶向关键信号分子的化合物[如蛋白酪氨酸激酶(JAK)抑制剂或TBK1抑制剂)具有潜在的好处,因为它保留了完整重要的代偿先天免疫识别通路,最关键的是TLR,视黄酸诱导基因蛋白(RIG)样受体和炎症小体通路。
此外,从基础生物学和临床前疾病模型来看,cGAS-STING通路的激活是以一种高度合作的方式发生的。因此,部分阻断该通路而不是完全阻断似乎足以产生抗炎作用。同时,在明显感染的情况下cGAS-STING仍具有活性。如果能够达到这样的平衡,那么cGAS-STING在炎症中的广泛性和重要性就不再是一种不利因素,它可以因此成为被广泛应用的治疗靶点,这可能会变成它最强大的优势。
END
丨舀米盅盅
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