Wnt通路是一条高度保守的传导通路，作为细胞间通讯的重要手段，在众多生物学过程有重要作用，其异常激活或突变更是与肿瘤的发生发展有密切关系。2020年10月23日荷兰乌得勒支大学医学中心分子医学中心的Madelon M. Maurice在Nature Reviews Cancer（IF=69.8）发表了题为《Mutations and mechanisms of WNT pathway tumour suppressors in cancer（癌症中WNT通路抑癌基因的突变及其机制）》的综述长文，详细阐述了WNT肿瘤抑制基因的不同突变亚群与不同癌症类型、临床结果和治疗策略，以及相关最新进展和挑战。
摘要
突变诱导的WNT-β-catenin信号激活在肿瘤中是一个频繁发生的驱动事件。WNT-β-catenin通路的持续激活使癌细胞具有持续自我更新和生长的特性，并与治疗耐药有关。
在健康的成人干细胞中，WNT通路的活性受到核心通路肿瘤抑制因子和负反馈调节因子的控制。小鼠模型的基因失活实验明确地证明了WNT肿瘤抑制基因的功能缺失突变与肿瘤生长的相关性。
然而，在人类肿瘤中出现了一幅复杂得多的图景，错义或截断突变介导了突变蛋白的稳定表达，且具有不同的功能和表型影响。在此，我们总结回顾了WNT肿瘤抑制基因不同突变亚群与不同的癌症类型、临床结局和治疗策略相关的最新进展和挑战。
介绍
大约40年前，第一个WNT基因被发现。这一发现揭示了WNT1是在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)插入后驱动小鼠乳腺肿瘤发生的基因。在接下来的20年里，WNT通路的大多数关键组成部分都被揭开了。同时，这些研究表明了WNT信号在控制胚胎发育和癌症发展中的重要作用。
后来的研究发现，WNT信号是肠道、肝脏、皮肤和许多其他器官中成年干细胞自我更新和指引细胞命运的主要驱动力。在组织的动态平衡过程中，WNT通路的活性受到多种肿瘤抑制因子的严格控制，这些抑制因子要么作为核心成分发挥作用，要么起负反馈作用。WNT肿瘤抑制基因的突变或沉默已被确定可在多种癌症类型中频繁发生。
与这些观察结果一致的是，WNT-β-catenin通路的持续激活被发现可赋予癌细胞自我更新的生长特性，而且与治疗耐药性有关。
大规模的测序结果已经清楚地表明，癌症中的遗传改变有着高度多样化和复杂的特点。虽然癌基因的突变经常表现为可导致蛋白质过度活跃（overactivity）的突变热点，但肿瘤抑制基因的突变通常包括散布在整个基因长度上的缺失和错义突变、无义突变和移码突变，从而使得突变后的功能解释变得复杂。
因此，这些观察到的结果对我们提出了一个挑战，即明确区分passenger突变和driver突变，并预测这些突变是否具有以及如何产生可被癌症治疗策略利用的脆弱性。
此外，靶向单个通路的突变可能会表现出明显的组织或癌症亚型的特异性，或者与在同一肿瘤中那些可解除对替代信号通路管控的突变表现出协同效应，进一步增加了机制的复杂性，并阻碍了对遗传改变如何促进肿瘤生长的理解。
这篇综述重点关注了WNT通路肿瘤抑制基因各种类型的突变如何促进肿瘤发展的最新进展。概述了不同的WNT通路突变如何与组织特异性和疾病临床进展相联系。我们讨论了功能丧失(loss-of-function，LOF)（基因上的突变可导致部分/完全性的基因失活）突变在临床前模型和人类患者中的结局，并描述了对其他类型的衍生突变的研究，及其所揭示的WNT通路肿瘤抑制基因突变驱动肿瘤生长和进展的新机制。
最后，我们强调需要更全面地理解WNT通路诱变事件（mutagenic events）驱动癌变的共同原理，以改进精准癌症药物的应用和设计更有效的治疗方法。
WNT-β-catenin信号
WNT介导的受体激活可以沿着不同的通路传递信号，这些通路大致可分为β-catenin依赖和β-catenin非依赖的信号通路。
在此，我们将重点放在与癌症发生密切相关的β-catenin依赖的通路上。这个信号级联反应中的一个中心事件是：转录共激活因子β-catenin的调节蛋白水解性周转（proteolytic turnover）。
在静息细胞中，细胞内的β-catenin池被一个多亚单位破坏复合物（multisubunit destruction complex）的活性维持在较低水平，该复合物由肿瘤抑制因子AXIN1、APC（adenomatosis polyposis coli）、CK1（casein kinase 1）和GSK3β组成。
这个蛋白复合物捕获并磷酸化β-catenin，然后被E3连接酶SKP1-CUL1-F-box protein (SCF)–β-transducin repeat-containing protein (β-TrCP)泛素化，并被分派到蛋白酶体完成其降解(图1A)。
WNT介导的细胞刺激是由WNT与其受体Frizzled(FZD)和LRP5或LRP6在细胞表面形成的三聚体复合物启动的。受体激活介导效应蛋白Dishevelled (DVL)的募集，进而将AXIN1和其他核心破坏复合物组分募集到质膜上。
总之，这些事件阻止了破坏复合物介导的β-catenin的降解，使其积累并转移到细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子结合因子 (TCF/LEF)家族结合，并驱动WNT靶基因的转录(图1A)。
为了防止过度的信号水平，WNT诱导的反应通常会有许多负反馈调节因子来平衡。WNT靶基因AXIN2(也称为传导素)，其RNA产物通常被用作WNT通路活性的标志，有助于提高胞浆中破坏复合物的活性，并下调β-catenin介导的转录。
此外，膜结合的E3连接酶RNF43（环指蛋白）和ZNRF39（锌和环指蛋白）的诱导表达介导了WNT受体的泛素化，从而驱动了WNT受体的内化和溶酶体的降解，从而降低了细胞对WNTs的敏感性。
此外，最近发现RNF43可发挥二级抑制作用，即通过促进破坏复合物的活性来阻止β-catenin介导的转录，该机制尚未完全了解，但涉及到了RNF43胞浆尾巴与CK1的调节相互作用(图1B)。
然而，在成体干细胞的生态位中（niche），RNF43和ZNRF3的负反馈可被R-响应素(R-spondin, RSPO)家族的分泌蛋白局部抵消。通过与富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体(LGR)家族成员和RNF43或ZNRF3形成复合物，RSPO促进RNF43和ZNRF3从细胞表面清除(图1B)。
此外，RSPO家族成员的一个子集通过涉及与HSPG结合的LGR非依赖机制促进RNF43和ZNRF3的清除。因此，RSPO活性可使WNT受体聚集在细胞表面，并诱导干细胞维持所需的、由高水平β-catenin介导的转录。
WNT抑癌基因突变
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β-catenin激活的驱动途径
WNT通路肿瘤抑制基因突变的主要结果是产生不必要的β-catenin介导的转录，它激活了促进干性（stemness）、增殖和存活的基因程序。过高的β-catenin活性可以通过两条主要的突变驱动途径来实现。
β-catenin破坏复合物的突变是肿瘤中WNT通路激活的典型模式，例如APC、AXIN1和AXIN2的失活突变或β-catenin（由CTNNB1编码）本身的激活突变（activating mutations）。
这些事件通常被认为是驱动WNT非依赖性肿瘤生长的一种状态(图1C)。最近的研究发现，WNT受体丰度的失调是致癌的第二条途径。这种致癌途径是由RNF43和ZNRF3的缺失启动的，从而消除了正常情况下驱动成体干细胞（adult stem cells）中WNT受体内吞的负反馈回路。
值得注意的是，RNF43和ZNRF3缺失的细胞已经失去了对RSPO的需求，从而显示出一种肿瘤细胞的特征——生态位非依赖（niche independency）的生长。
癌细胞避免RNF43和ZNRF3活性的另一种途径是获得性RSPO过表达。因此，这些肿瘤表现出细胞表面过多的WNT受体，它介导配体超敏反应并促进WNT依赖的肿瘤生长(图1C)。
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组织特异性
虽然WNT通路的基因改变发生在大多数癌症类型中，但个别WNT信号成分的突变显示出相当程度的组织特异性。对TCGA的33种癌症类型中单个WNT通路成分的突变频率进行研究，结果表明子宫内膜癌、皮肤癌和胃癌中会发生各种核心成分的突变，而其他癌症类型的选择性更高(图2A)。
在结直肠癌中，散发性肿瘤中积累的APC突变比例最大(67%)，其次是比例较低的RNF43(8%)、CTNNB1(6%)和AXIN2(5%)。相反，肝癌会优先发生CTNNB1(25%)和AXIN1(8%)突变，而胰腺癌倾向于RNF43(6%)的突变，肾上腺皮质癌与ZNRF3(20%)或CTNNB1(15%)突变有关。
值得注意的是，WNT通路突变对癌症发展的贡献可能比TCGA数据库中反映的要大。例如，由于移码突变的calling不完全,已鉴定的RNF43突变数量似乎不足。
此外，WNT通路调节因子可能因为启动子被超甲基化而下调，例如如AXIN1会在很大一部分非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达(43%，29/67)，以及ZNRF3可在BRAF突变的大肠癌中的表达(72%，36/50)。
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肿瘤亚型与预后
虽然WNT抑癌基因突变都集中在增强β-catenin活性上，但新出现的证据表明，WNT通路不同突变的功能后果并不相同。大规模的癌症基因组图谱显示，WNT通路成分的特定突变可能发生在癌症发展的早期或晚期，与特殊的癌症亚型相关，并与临床预后有着不同的相关性。下面,我们讨论对两种主要癌症类型的最新见解。
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结直肠癌
APC基因作为把关基因（gatekeeper gene）的突出作用是在1991年由多个研究小组首次发现的，他们共同证明了APC基因的失活会导致家族性腺瘤性息肉病(FAP)，这是一种以广泛性肠道息肉形成为特征的综合征，具有发展为大肠癌的高度风险。
在散发性肿瘤中同时鉴定出大量的APC突变则证实了这些发现(图2A)。不同发展阶段肿瘤病变的分子特征表明，APC突变发生在早期，且可能是限速事件。
然而，最近的研究表明，先前存在的致癌性KRAS突变，通常在老化的人类结肠中发现，这可能标志着APC突变的首选起始位点。显然，KRAS、TP53、SMAD4和/或PIK3CA的驱动突变与APC突变协同推动腺瘤向癌的逐步发展。
除了WNT、表皮生长因子、TGF-β或PI3K信号通路的改变提供选择性生长优势外，这些癌细胞还具有染色体不稳定性(CIN)的特征。虽然这一常规的突变事件序列解释了相当大一部分大肠癌的遗传学基础，但随着癌症基因组测序的进展，更多的突变基因被揭示出来，从而揭示了大肠癌的异质性。
通过大规模测序发现，结直肠癌(n = 3,962)患者被细分为四个共同的分子亚型(CMS)，每个亚型都具有不同的生物学特征：CMS1(14%)，伴有微卫星不稳定性和免疫激活的高度突变亚群；CMS2(37%)，具有明显的WNT和MYC活性的典型上皮亚群；CMS3(13%)，明显代谢紊乱的上皮亚群；和CMS4(23%)，表现为显著的TGF-β激活。
值得注意的是，结直肠癌中的WNT通路突变分离到了不同的CMS(图2B)。虽然APC突变在CMS2中广泛存在，并与CIN一致，但RNF43和ZNRF3突变以及RSPO家族成员基因融合在MSI连锁的高突变CMS1亚组肿瘤中被发现显著富集。因此，WNT通路突变的类型与肿瘤的生物学背景之间存在关系。
特别是，RNF43突变和ZNRF3突变与大肠癌发展的锯齿状途径（serrated pathway）有关，而锯齿状息肉起源于富含激活BRAF突变和错配修复(MMR)基因突变的癌前锯齿状息肉。与APC突变相反，RNF43突变的获得被认为是推动腺瘤向癌症发展的晚期事件。
值得注意的是，与抗癌基因突变的肿瘤不同，BRAF突变的微卫星相关肿瘤不表现出显著的核β-catenin积聚。因此，这些发现表明，与APC突变相比，RNF43突变通常与WNT通路激活水平较低有关。
最近的研究表明，RNF43突变在印戒细胞癌中也很丰富，印戒细胞癌是一种罕见的早发性大肠癌，表现出侵袭性行为，并与不良预后相关。与APC突变型肿瘤不同的是，这些印戒细胞肿瘤不表现出明显的EGF或PI3K通路的激活，常规WNT靶基因的仅表现为低表达水平，这些结果进一步强调了不同的致病机制。
引人关注的是，APC和RNF43突变也与结肠内不同的原发肿瘤位置相关。APC突变主要见于左侧大肠癌，而RNF43突变主要见于右侧大肠癌。与上述RNF43突变特征相一致的是，右侧肿瘤通常含有BRAF突变，并显示MSI连锁的超突变（hypermutation）。
然而，即使校正了MSI状态，RNF43突变也与右侧大肠癌相关，这个结果进一步支持了WNT通路改变的区域性（regional）偏好。这种偏好的分子基础尚不清楚，可能的原因是左右侧大肠对致癌性WNT信号水平的要求不同，而在左侧大肠癌中，WNT信号水平通常更高。
事实上，生理性的WNT信号水平在健康的肠道也表现出区域差异，这可能与成人结肠的发育过程有关，左侧和右侧区域分别来自胚胎后肠和中肠。重要的是，原发肿瘤的不同部位与预后不同相关。左侧肿瘤大多转移到肝脏和肺，切除和化疗是潜在的治疗方法，而右侧肿瘤会导致腹膜转移，仍然难以治疗，预后较差。
总之，APC和RNF43中的驱动突变代表了具有不同特征的CRC子集。表1概述了APC突变型和RNF43突变型CRC亚集的生物学和分子特征。
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肝细胞癌
肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因。肝细胞癌约占肝癌患者的90%，其特点是WNT-β-catenin信号经常过度激活。肝细胞癌中WNT通路最显著的基因改变包括CTNNB1的激活突变(28-40%)和AXIN1的LOF突变(11%)。
与其肿瘤抑制作用相一致的是，AXIN1突变经常与杂合性缺失(LOH)相关。由于很大一部分人肝细胞是多倍体的，这可能会保护这些细胞免受抑癌基因丢失的影响，因此很容易推测AXIN1突变可能是在二倍体状态下获得的。
与大肠癌的APC突变相反，CTNNB1和AXIN1突变通常不出现在肝脏的癌前病变中，而是与肿瘤发展的后期有关。一致的是，WNT通路的激活只有在HCC的晚期才明显，因此被认为是肝癌发生的晚期步骤。
值得注意的是，CTNNB1和AXIN1突变与不同的肝癌亚型相关，表现出不同的临床和病理特征。CTNNB1突变直接介导β-catenin的稳定和核积聚，与“非增殖性”肝癌相关，包括染色体稳定的肿瘤，表现出分化的标志，并倾向于保留肝细胞样标志。
这些肿瘤表现出典型的WNT激活基因表达特征，通常与较好的预后相关。相比之下，AXIN1突变仅限于临床侵袭性肝癌，这类“增殖性”肿瘤的特点是分化差、细胞周期标记物和CIN过度表达。此外，与CTNNB1突变相比，AXIN1突变的HCC肿瘤表现出不同转录程序的激活。
综上所述，虽然CTNNB1和AXIN1的突变在抑制β-catenin更新/周转（turnover）方面的作用是一致的，但它们在肝癌发生中的作用明显不同。这种差异的分子基础仍未解决。
突变的分子机制
在传统的观点中，突变诱导的肿瘤抑制基因的双等位基因失活会导致驱动细胞生存和增殖的信号通路发生不适当激活。因此，通常采用基因敲除的方法来研究肿瘤抑制因子的作用。
然而，随着人类癌症基因组测序的进步，出现了一幅复杂得多的图景。抑癌基因的突变是高度异质性的，导致了一系列活性未知的错误蛋白质，这些蛋白质没有被基因敲除模型很好地捕捉到（captured）。
此外，这种异质性给明确区分passenger突变和driver突变以及理解潜在的致癌机制带来了挑战。此外，除了丧失生长抑制能力外，突变的抑癌基因还可能获得促进肿瘤发生的新功能。
在这里，我们讨论了在癌症中，关于病人来源的突变如何改变WNT通路肿瘤抑制功能的最新见解和发现。
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“破坏复合物”的突变
大肠癌中的APC截断突变产生“恰到好处”WNT信号水平
APC的肿瘤抑制活性主要依赖于它与β-catenin和AXIN的相互作用，这些作用是通过位于其内在无序区的羧基末端中间的多个短重复序列来实现的(方框1)。
虽然大肠癌通常携带双等位APC突变，但APC功能通常不会完全失活。在绝大多数情况下，基因的5’端受到无义或移码突变的打击，这些突变介导了过早截断的APC蛋白变体的表达(图2C)。
值得注意的是，影响两个APC等位基因的突变是相互依赖的（interdependent）。在FAP患者中，胚系突变导致去除了所有β-catenin结合的20个氨基酸重复(20R)，紧随其后的是保留至少一个20R的体细胞二次突变。相反，当生殖系变异保留一个或多个20R时，第二次打击将失去所有20R，要么是上游截断，要么是等位基因丢失。
这些发现导致了“恰到好处”的信号模型，在该模型中，两个APC等位基因都被选择来保持足够的β-catenin调节活性，以产生肿瘤生长的最佳信号窗口。与这一假设一致的是，由于蛋白质的递增缩短而导致的APC调控重复序列的渐进性丢失可对应于小鼠胚胎干细胞、人类CRC细胞和果蝇胚胎中WNT信号的逐步增强。
各种证据表明，在密码子从1286到1581的“突变簇区”(mutation cluster region，MCR)内，截短的APC变体最适合产生对肿瘤生长最有利的特定水平的WNT信号。在FAP患者中，单等位或双等位APC MCR截短与最严重的息肉病相关，而截断突变向氨基末端或C末端移动对应着较弱的疾病程度。
此外，在散发性大肠癌中，76%的APC突变病例携带至少一个包含MCR截短的等位基因。
最后，临床前的FAP小鼠模型还显示，最严重的肠息肉发生在携带Apc 1322T/+杂合子MCR截短的小鼠中，其次是常用的APC多发性肠道肿瘤(Apc Min/+)小鼠，其形式较短，在密码子850处截短。在1572或1638密码子上观察到了更长的、亚效等位（hypomorphic，是指只失去了部分的基因功能）APC截断，保留了更多的β-catenin调节域(图3A)。
值得注意的是，在这些小鼠模型中，息肉主要发生在小肠，而在FAP和散发性大肠癌患者中，大肠是息肉形成的首选部位。这种差异的分子基础仍有待解决，但可能与人和小鼠肠道之间生理性WNT信号梯度的差异有关。
MCR区截短的APC的哪些分子特征可以实现特定水平的β-catenin介导的转录？首先，丢失所有三个AXIN蛋白结合的丝氨酸-丙氨酸-蛋氨酸-脯氨酸Ser-Ala-Met-Pro（SAMP）重复序列似乎是β-catenin破坏复合物失活的关键决定因素。尽管缺少这些常规的AXIN蛋白结合位点，SAMP缺失的APC截断体仍然与AXIN形成复合物，这可能是通过使用位于Armadillo重复(ARM)结构域内的替代结合位点(方框1)。
第二个条件是通过组合的双等位APC截断，保留最多三个β-catenin结合的20R。虽然剩下的这些20R仍然促进β-catenin的磷酸化，但它们并不促进在缺乏APC的细胞中β-catenin的破坏（destruction）。相反，这些20R被认为是通过介导保留细胞质的β-catenin而赋予剩余的调节活性。
最后，如肠道类器官所示，失去与第二个20R(20R2)相邻的保守的catenin抑制域(CID；或“sequence B”)(方框1)是驱动WNT通路活性高基础水平的额外要求。潜在的作用机制需要进一步研究，但似乎涉及与α-catenin相互作用的丧失，这一丧失阻止了APC与磷酸化的β-catenin的稳定相互作用。
此外，缺失CID的APC与E3连接酶β-TrCP的结合减弱可能进一步阻碍β-catenin的泛素化和蛋白水解。
此外，CID的缺失（removal）可能会促进泛素特异性加工蛋白酶7(USP7)的募集，从而通过去泛素化进一步提高β-catenin的稳定性。因此，MCR-截短的APC平衡了β-catenin降解的损失和剩余的调节活性，以产生最佳β-catenin介导的转录量来驱动肿瘤生长。
不太流行（less prevalent）的截断APC形式的相关事件
MCR下游的APC截短对WNT信号的影响较小，在人类癌症中发生的频率较低，研究也较少。然而，有几条证据表明，这些变异也起到了致瘤驱动作用。小鼠表达在CID后截短的亚效等位APC后表现出较轻的肠息肉，但却获得了肠外组织中的多个肿瘤(例如，在乳房、肝脏和骨骼中)(图3A)。
一致的是，TCGA数据库中保留CID的APC截短体的比例在大肠癌中最低（约占557例APC突变病例的10%），但在其他恶性肿瘤中却有所增加，如胃腺癌(33例中的40%)和子宫内膜样癌(58例中的40%)，这表明这些癌症类型可能有着（select）较低的WNT信号水平(图3B，C)。
值得注意的是，突变体APC的剩余抑制活性是浓度依赖性的，并可能受到蛋白质稳定性变化的进一步调节。与此相一致的是，部分性地降低APC蛋白水平可以使结肠细胞对WNT刺激敏感。
此外，与其他途径的驱动突变之间的协同作用可能会改变WNT的剂量效应和组织偏好，就比如，亚效等位Apc 1572T小鼠在导入Smad4突变后可获得显著的肠息肉表型。
最后，值得注意的是，APC突变可能会激活癌症中的其他驱动途径，如Hippo–Yes-相关蛋白(YAP)信号和CIN。虽然这些事件超出了本综述的范围，但它们显然将促进APC突变驱动的癌症发展。
APC2活性在APC突变肿瘤中的角色
APC突变所导致的严重性可由其功能同源物APC2的表达来平衡，APC2有着与APC相似的结构，但缺少与β-catenin结合的15个氨基酸重复(15R)区域(方框1)。虽然APC2本身具有弱的β-catenin下调活性，但它的效率可通过与APC的异源二聚作用而提高。
事实上，APC2与MCR截短的APC结合可促进结直肠癌细胞中β-catenin降解的残留水平。虽然这种活性不能完全补偿APC功能的丧失，但很大一部分(43-95%，29/66和97/102)的大肠癌表现出APC2启动子的超甲基化，这表明由于APC2表达缺失而获得的较高水平的β-catenin活性可能为肿瘤提供了生长优势。
WNT通路的APC2依赖调控表现出组织特异性。例如，小鼠乳腺上皮中缺失Apc或Apc2并不会影响组织稳态，而同时缺失Apc和Apc2会导致稳定的β-catenin水平过高，从而导致乳腺肿瘤的形成。因此，与结肠相比，APC2似乎可以补偿乳腺组织中APC的丢失。因此，APC2在其他组织中的表达是否以及如何平衡WNT信号阈值需要我们进一步研究。
AXIN1功能缺失的后果

所有癌症类型的突变谱显示，24%(57/240)的病例发生AXIN1深度删失(图2C)。由于AXIN1在破坏复合物组装中的关键组织作用(方框1)，我们设想AXIN1的缺失将诱导细胞中非依赖于WNT的β-catenin激活。
事实上，Axin删失与线虫和果蝇中明显的WNT介导的表型相一致，并诱导小鼠胚胎死亡。
为了研究AXIN1缺失在体细胞中的潜在癌症驱动作用，鉴于AXIN1突变在肝癌中的普遍存在，我们建立了条件干扰Axin1表达的小鼠模型来评估AXIN1突变对肝脏动态平衡的影响。
足龄（adult）鼠肝脏中Axin1的缺失可导致肝细胞增殖量急剧增加，在12 月大时，40-55%(27/67和5/9)的小鼠出现了组织学上类似于人类肝癌的肝癌。与Apc缺失或激活Ctnnb1突变相反，Axin1缺失的肝细胞和肿瘤中常规WNT靶基因的表达没有或仅有微弱的增加。
然而，Axin1缺失诱导的基因特征与通常发现AXIN1突变的预后不良的“增殖性”肝细胞癌亚类有很大的相似之处。特征性的特点包括Notch和YAP信号水平的增强以及对胎儿基因表达的强烈诱导。
对在其他细胞类型和组织中AXIN1缺失的后果的评估依然有限。在WNT和RSPO停用（withdrawal）条件下，对人小肠类器官进行CRISPR基因敲除筛选可促进APC或AXIN1删失的类器官发生选择性生长。
此外，长期用有效的WNT分泌抑制剂处理WNT超敏、RSPO3过表达的CRC株，可诱导获得AXIN1双等位基因移码缺失的抗性克隆的生长。因此，这些结果证实了AXIN1的缺失介导了肠道器官中WNT信号水平的增加。此外，负反馈调节因子AXIN2的诱导显然不足以抵消这些细胞中WNT信号的整体增加。
最后，虽然AXIN1突变只在一小部分大肠癌中被检测到(3%，19/549)，但AXIN1的缺失可能通过其他机制发生。例如，E3泛素连接酶RNF146的转录上调后，可通过泛素化介导的AXIN1降解和β-catenin介导的转录激活来促进大肠癌的增殖和存活。RNF146在6%(13/205)的大肠癌病例中存在过表达，且与预后不良相关。
类似地，RNF146过表达可通过增强WNT-β-catenin信号在很大一部分NSCLC中促进增殖和侵袭。由于RNF146能够降解两个AXIN类似物，这种E3连接酶的上调可能比AXIN1或AXIN2的单个突变更有效。
AXIN2突变的后果
尽管AXIN2介导的负反馈似乎不足以完全补偿AXIN1的丢失，AXIN2的体细胞突变在各种癌症类型中还是很普遍的(图2A)。此外，人类AXIN2生殖系突变与肺癌、乳腺癌和大肠癌的易感性有关。对AXIN2变异体驱动肿瘤发生的作用模式的评估也仍然有限。
例如，一个反复（recurring）截短的AXIN2突变体在细胞系中异位表达时会表现出部分的功能缺失。鉴于AXIN2突变与其他WNT通路突变在癌症中普遍共存，AXIN2 LOF所导致的微弱通路活性可能与这些突变协同作用，提高信号水平或产生耐药性。进一步研究AXIN2突变的分子机制以及它们与其他基因改变的协同性，才能更好地理解这些突变如何促进肿瘤的发生和发展。
AXIN1 错义突变的机制：不止是功能缺失
尽管通过对AXIN1缺失的研究获得了不少有用的信息，但人类癌症中，发生在AXIN1上最多的基因改变形式是错义突变(图2C)，而这些错义突变散布在整个基因长度上，使得对它们的功能预测变得复杂。
最近，对发生在N端RGS结构域的错义突变进行深入地分析结果显示，突变的AXIN1蛋白可能获得驱动肿瘤生长的新功能特性(方框1)。从机制上讲，错义驱动突变被发现在结构上破坏了RGS结构域的稳定，并介导了小规模聚集体的形成，这些聚集体重新连接了AXIN1的相互作用关系（AXIN1 interactome），以促进基础WNT通路的激活(图4)。
此外，在AXIN1的内源性位点上，RGS区域错义突变的插入促进了果蝇体内肿瘤的生长，证实了其癌症驱动因子的活性。通过引入抑制聚集（aggregation）和挽救致瘤效应（rescued tumorigenic effects）的次级突变（secondary mutations），验证了聚集作为潜在机制的作用。因此，这些发现表明抑癌基因的错义突变可能通过不可预见的机制促进肿瘤生长。
然而，大多数其他错义突变的关联性仍不清楚。鉴于AXIN1作为中枢蛋白（hub protein）的作用以及其自我聚合的能力，可以预见突变对这些功能的多种干扰模式。机械论式的观察（mechanistic insight）将有助于根据它们的作用模式对大量已报道的突变进行分类。此外，由于破坏复合物的活性取决于APC和AXIN1蛋白的绝对水平和比例，因此在内源性水平上评估突变的AXIN1对分子和细胞的影响有着至关重要的作用。
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WNT受体调节基因的突变
RNF43和ZNRF3的功能缺失突变
小鼠的基因缺失实验表明，RNF43和ZNRF3的肿瘤抑制作用在肠道中是多余的，而这两个基因的同时失活是肿瘤生长所必需的。与这些发现一致的是，结直肠癌中通常存在RNF43突变，并伴随着ZNRF3的下调，这可能是由于突变或表观遗传机制所致。
然而，在不同的细胞和组织中模拟RNF43和ZNRF3缺失则表现出了背景依赖效应（context-dependent effects），即其中一个旁系同源物（paralogues）可能比另一个占优势。例如，小鼠Rnf43的缺失会导致WNT信号不正确，并导致胰腺和胃的增生性生长，而Znrf3的缺失则会导致肾上腺皮质肿瘤的形成。
值得注意的是，RNF43 LOF突变的WNT超敏性结直肠癌亚群常表现出WNT通路的负反馈调节因子发生表观遗传的下调，包括AXIN2，以及NOTOM和WNT抑制因子——WIF1，它们抵消了WNT的活性。
因此，这种改变可能进一步增强RNF43和ZNRF3突变细胞中WNT反应的持续时间和强度，并促进肿瘤的进展。
在人类癌症中，RNF43的突变类型以截断和错义突变为主，而ZNRF3更常受到错义突变和缺失的影响(图2C)。对不同RNF43突变的功能分析表明，可以通过不同的机制导致功能缺失(图5A-D)。
首先，发生在RNF43的E3连接酶RING区域上游的截短突变将导致蛋白质表达的缺失或表达非功能蛋白(图5B)。一个突出的例子是RNF43 R117Afs*41突变，它占大肠癌RNF43突变的8-12%(4/51和6/50)，占子宫内膜癌RNF43突变的4%(2/58)。
第二，细胞外区域的错义突变，如在胰腺癌中所报道的，可以介导RNF43在内质网(ER)中的滞留，进而可能是通过错误折叠和ER质量控制介导其发生滞留和清除。由于它们不能到达质膜，所以这些突变体不能下调WNT受体。
此外，内质网捕获的RNF43突变体可能具有明显的负活性（negative activity），因此与发生基因缺失相比其具有更强的致瘤能力(图5C)。
第三种机制包括通过无义介导的mRNA衰变(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)耗尽突变的RNF43，这可能是在获得未成熟终止密码子(premature termination codons，PTC)之后诱导的(图5D)。为了证明这一发现，抑制NMD后稳定了CRC细胞系中几个截短的RNF43变异体的mRNA。
然而，NMD的作用一直存在争议，特别是RNF43的G659Vfs*41热点突变，该突变在结直肠癌、子宫内膜和微卫星高度不稳定的胃癌亚群中非常普遍。由于RNF43 G659Vfs*41蛋白在过表达分析中显示出完整的功能，NMD介导的mRNA耗竭被认为是一种作用模式。
事实上，患者来源或者或基因工程的人结肠类器官中的RNF43 G659Vfs*41与失活的ZNRF3相结合后获得了RSPO非依赖的生长特性，这一结果表明了功能缺失（LOF）的效应。此外，与NMD易感性一致，携带G659Vfs*的人类肿瘤中RNF43 mRNA表达水平降低。
然而这一发现最近受到了挑战，因为一项研究发现RNF43 G659Vfs* 的mRNA仍可稳定表达。此外，该突变体在大肠癌细胞系中的缺失仍然诱导了WNT-β-catenin信号的上调，表明该突变体导致的功能缺失并不完全。虽然这些差异的原因尚不清楚，但突变背景和组织特性可能起到一定作用。
RNF43截短突变在癌症中的癌基因角色
根据NMD的规则，发生在RNF43的倒数第二个外显子中心的无义或移码突变很有可能逃脱NMD。由于目前对RNF43的了解在很大程度上依赖于基因敲除策略，研究者们对这些截短的RNF43变体如何干扰WNT信号和肿瘤发生仍然知之甚少。
最近的一项研究揭示了一类截短的RNF43变体可通过与LOF不同的机制促进肿瘤发生。这些失去了胞液尾端处一半远端的RNF43突变体(图5A)完全保留了下调WNT受体的能力，但诱导了WNT非依赖性的β-catenin介导的转录(图5E)。
C末端的缺失被发现干扰了RNF43的第二个抑制作用，该作用涉及结合和调节β-catenin破坏复合物的活性。特别是，激酶CK1被鉴定为一个动态调节的互作伙伴，它可对RNF43尾端进行磷酸化修饰，促进其在β-catenin下调中的作用(图1B，5A)。
截断后，RNF43与破坏复合物的相互作用受到错误调节，导致AXIN1和CK1被捕获在质膜上，同时稳定β-catenin和靶基因转录(图5E)。此外，在人类原代结肠类器官中引入RNF43截短突变后，在没有ZNRF3突变的情况下，β-catenin介导的生长程序仍然被激活，从而证实了它们的主要致癌活性。
与APC或RNF43 LOF突变不同，致癌的RNF43突变可导致衰老样生长的停滞状态，并且它们只在TP53缺失的结肠类器官中表达。这些发现表明，像许多传统的癌基因一样，这些截短的RNF43变异体可诱导致癌性的压力，并可能代表肿瘤形成过程中的晚期事件。
事实上，携带致癌性RNF43突变的患者肿瘤中，其衰老相关的通路也存在突变。与LOF突变的另一个重要区别是，癌基因RNF43变异体的表达使人对基于抗WNT的治疗产生耐药性。因此，更好地了解患者中RNF43突变的促瘤机制将有助于病人的分类和预测治疗效果。
精准医疗的机会
WNT-β-catenin在人类肿瘤生长信号转导中的关键作用引起了人们对这一通路治疗靶向策略的极大兴趣。甚至在携带APC突变的晚期肠癌小鼠中，APC表达的恢复也推动了肿瘤细胞的分化和正常组织内稳态的恢复，这一结果进一步强化了人们的期望。
尽管科学家们已经发现了许多WNT通路拮抗剂和抑制性小分子，但这些药物都没有获得临床批准。开发临床靶向药物的一个主要挑战是抑制癌细胞中的WNT信号，同时避免由于成人干细胞稳态的改变而对健康组织产生靶向毒性。有关对目前正在进行临床评估试验中的WNT通路抑制剂的综合评价，我们请读者参考最近的其他综述。
下面，我们将讨论Wnt-β-catenin通路肿瘤抑制因子在癌细胞中变化的最新研究进展，这些进展揭示了药物治疗的局限性，促进了对具有创新性治疗潜力药物的发现。此外，我们强调如何积累对患者衍生突变作用机制的理解，从而改善对应用精准医学的患者进行分层。
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靶向破坏复合物活性
在癌细胞中提高β-catenin破坏复合物的活性是一个挑战，因为它的主要成分APC和AXIN的关键蛋白质-蛋白质相互作用元件经常缺失。
然而，最近关于在此类功能缺失（LOF）事件之后驱动WNT信号的最新进展揭示了一些针对性的漏洞。在携带APC截短的肿瘤中观察到，残存的破坏复合体活性为提高癌细胞中β-catenin的周转提供了机会。
小分子XAV939可促进有APC突变的CRC细胞系中AXIN的稳定，被认为是一种有效的破坏复合物活性增强剂。从机制上讲，XAV939可以抑制TNKS1和TNKS2（Tankyrase），从而阻止AXIN1和AXIN2的PAR化以及随后的RNF146介导的泛素化和蛋白酶体降解。
用XAV939处理除了可以促进AXIN的稳定性外，还通过与AXIN1和AXIN2发生共聚来提高TNKS1和TNKS2的水平，这可能通过非催化的支架作用进一步导致对WNT通路的抑制作用。
尽管有这些令人振奋的发现，对截短的APC长度与TNKS抑制剂敏感性之间关系的后续研究还是发现了相互矛盾的结果。特别的是，携带APC MCR截短(保留一个或两个20R)的细胞株在体外显示出对TNKS抑制剂的耐药性，而在小鼠模型中，与更短的APC截短相比，携带这种APC突变的肿瘤对体内治疗显示出更高的敏感性。
潜在的原因是，这种差异可能是由于WNT通路AXIN2和APC2的负调控因子表达水平的差异，这两个调控因子都可以被TNKS抑制剂所稳定。或者，就像突变的KRAS所显示的那样，对TNKS抑制的耐药性可能是通过与其他癌症通路共发生的致癌因素所促进的。
另一个令人担忧的问题是，抑制肿瘤所必需的高剂量单药TNKS抑制剂治疗会引起肠道毒性、体重减轻和死亡。然而，较低剂量的TNKS抑制剂在联合治疗方案中的表现出良好的抗肿瘤效果。
因此，阐明细胞环境如何影响TNKS抑制剂的有效性，以及它们与其他靶向药物联合使用的价值，对于确定治疗应用的最佳策略有着至关重要的作用。
最近还发现了另一个在APC截断时出现的潜在漏洞。APC CID结构域发生缺失的大肠癌细胞中，USP7介导的β-catenin去泛素化上调被认为是WNT信号异常的主要驱动因素。因此，用USP7抑制剂治疗可以抑制APC突变的CRC细胞系和肠道器官中WNT的激活，并抑制体内肿瘤的生长。
然而，这些发现受到了最近一项研究的挑战，在这项研究中，USP7抑制剂通过抑制AXIN蛋白稳定，从而被确定为WNT-β-catenin信号的积极调节者。这些研究结果之间存在差异的分子基础仍然不清楚，需要仔细比较细胞系和所使用的不同类别的USP7抑制剂。
在筛选可共同调节β-catenin和RAS蛋白稳定性的化合物的过程中，发现了一种可增强破坏复合物活性的小分子。这种化合物称为KYA1797，它与AXIN1 RGS结构域结合在靠近APC结合位点的表面。KYA1797-AXIN1通过一种尚未完全了解的机制，增加GSK3β的活性，促进β-catenin和RAS的降解。
根据这些发现，后续工作表明β-catenin与RAS可发生直接相互作用，而且β-catenin的降解先于GSK3β依赖的RAS降解。KYA1797通过降解RAS和β-catenin癌基因，抑制携带APC和KRAS突变的小鼠大肠癌的生长。
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靶向WNT依赖的癌症
关于RNF43和ZNRF3突变促成了对WNT依赖的生长状态的发现，为识别对WNT抑制剂或受体阻断抗体治疗敏感的癌症亚群打开了可能性。
阻断WNT自分泌和旁分泌信号的一个非常有效的方法是通过靶向Porcupine(PORCN)来抑制所有活性WNT的产生，PORCN是一种驻留在内质网的O-酰基转移酶，介导WNT棕榈酰化，这是WNT生物合成的关键步骤。
事实上，临床前的数据显示，PORCN抑制剂有效地抑制了WNT驱动的携带工程性Rnf43和Znrf3突变的小鼠肠道肿瘤模型，以及患者来源的RNF43突变结直肠癌和胰腺导管腺癌(PDAC)类器官（organoids）的生长。
为了利用这一脆弱性，正在进行的临床试验可使用RNF43突变作为PORCN抑制剂治疗大肠癌和PDAC患者的预测性生物标志物。尽管临床前研究结果的前景被看好，但对PORCN抑制剂的不良反应已有报道，包括骨质丢失和关节功能障碍，这可能限制了可用于临床的药物剂量。
然而，最近的研究表明，PORCN抑制剂可以在较低剂量时与其他药物通过组合策略发挥作用，以提供更好的抗肿瘤效果。特别值得注意的是，PORCN和PI3K抑制剂的双重处理可通过抑制细胞增殖和葡萄糖代谢，有效地抑制PDAC异种移植瘤的生长。
因此，评估PORCN抑制剂与其他靶向药物的协同作用似乎是治疗WNT敏感性肿瘤的一种有效策略。此外，根据最近的研究，完善RNF43突变患者的分层可以提高PORCN抑制剂的疗效。要做到这一点，需要解决RNF43突变作为passenger或driver在分类上的差异。
此外，携带可促进WNT非依赖性生长的RNF43突变，或预测对PORCN抑制具有耐药性的其他共存突变的患者，需要被排除在外。最后，在RNF43和ZNRF3表现出冗余（redundancy）的组织中，ZNRF3的表达状态将有助于确认WNT依赖（WNT- addicted）性的肿瘤。
由于PORCN抑制剂影响所有WNT介导的通路，人们正在开发更多的选择性策略来减轻毒性。例如，全基因组CRISPR筛查发现FZD5是携带RNF43突变的PDAC细胞系生存所必需的主要WNT受体。一致的是，FZD5抑制性抗体在体外和体内均能阻断RNF43突变型PDAC细胞系的生长。
此外，FZD5靶向抑制了RNF43突变的CRC类器官的存活，而携带APC突变的类器官没有受到影响。
最后，通过单链抗体选择性阻断WNT3与LRP6受体的结合，抑制了携带Rnf43和Znrf3突变小鼠肠道器官的过度增殖，促进了其终末分化。因此，通过拮抗特定受体或WNT来更有选择性地靶向WNT信号，有望克服与PORCN抑制剂治疗相关的一些限制。
最后，可靶向的WNT依赖性肿瘤的范围可能比目前预期的更广。出人意料的是，Vantictumab(OMP-18R5)在体外和体内都抑制了携带APC突变的胃癌肿瘤组织的生长。Vantictumab是几种FZD的抑制剂，已经在晚期胰腺癌、肺癌和乳腺癌的Ib期临床试验中进行了评估。
携带下游WNT通路突变的其他人类癌症类型的生存在多大程度上仍然依赖WNT受体活性，这一点还有待研究。此外，WNT通路外的突变也可能产生WNT超敏性（WNT- hypersensitive）肿瘤，正如胃癌中TP53和CDH1(编码E-cadherin)的共突变所表现的那样。因此，可能有一个未被探索到的癌症亚群可以从WNT抑制策略中受益。
结论和展望
了解肿瘤发生的分子机制是实施精准肿瘤医学的必要步骤。尽管在细胞和生物体中使用基因删除的方法对WNT肿瘤抑制基因失活进行建模已经产生了丰富的结果信息，但这些模型只代表了在人类癌症基因组中已发现的突变谱中的有限部分(图2C)。
此外，由于突变的分散分布以及编码蛋白中存在较大的固有无序区域，目前对WNT通路肿瘤抑制基因驱动突变的预测算法并不是最优的(方框1)。
正如这篇综述中给出的例子所说明的那样，需要对不同类别的抑癌基因突变的功能影响进行更全面的实验评估，以区分驱动突变和乘客（passenger）突变，定义共同的机制规则，了解组织特异性，并改进治疗决策的指导。在基因组编辑和类器官作为肿瘤生长和转移可靠模型方面的最新研究进展，将对解决这些问题提供重要价值。
成功应用WNT阻滞剂或受体阻滞剂的一个直接挑战是对WNT敏感性癌症亚群的可靠识别。符合条件的患者可能会根据确认的RNF43 LOF突变和特定组织中伴随的ZNRF3 LOF进行分层。
此外，更全面地寻找额外的预测标记物来表征WNT依赖的生长是值得进一步探索的，并可能有助于扩大可靶向性治疗的患者亚群。此外，需要深入分析和理解表观遗传沉默和负反馈调节基因转录缺失如何促进WNT驱动的癌症发展和进展，以识别和扩大临床上可进行治疗的（clinically actionable）患者亚群。
同样重要的是，需要探索对WNT阻断或受体阻断治疗具有抗性的突变和通路。除了一组特定的截短RNF43的突变外，APC和AXIN1的下游通路突变被认为是潜在的逃逸途径，尽管这种影响可能取决于突变发生的位置和组织环境。使用患者来源的肿瘤类器官进行体外药物筛选可以加速可靠标志物的鉴定。
最后，我们目前关注的是单个WNT肿瘤抑制基因突变的分子后果，但很明显，突变背景、肿瘤异质性以及与其他主要癌症通路的相互作用都值得进一步研究。希望通过将对分子的研究与来自早期临床试验的信息相结合，将针对WNT信号的研究转化为有效的治疗方法。
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撰文丨农民工
排版丨苡白
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