铁死亡自2012年被提出以来,一度成为科研工作者们研究的“新宠”。铁死亡是一种铁依赖性的,区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型的细胞程序性死亡方式,与多种生物学情况密切相关。2022 年 7 月纽约哥伦比亚大学的 Brent R,Stockwell Cell(IF= 66.85)上发表了题为《Ferroptosis turns 10:Emerging mechanisms, physiological functions, and therapeutic applications铁死亡的十年:新兴机制、生理功能,及其治疗应用)》的重磅综述,深度阐述了铁死亡的机制、生物学意义和临床治疗相关性,并讨论了一些重要概念和亟待解决的问题。
铁死亡(ferroptosis)是在十年前被发现的一种独特的细胞死亡方式,由铁依赖的脂质过氧化驱动并因此得名。铁死亡与多种从发育到衰老、免疫与癌症的生物学景况密切相关。这篇综述将在新陈代谢、活性氧生物学和铁生物学的框架体系内探讨这种细胞死亡形式的关键调节因子。并将重点介绍铁死亡领域的重要概念和主要的待解决的问题。以期在未来的十年中,有望在铁死亡的调控机制,以及利用铁死亡促进治疗方面取得进一步突破
铁死亡简介
十年前,我(即本文作者Brent R. Stockwell,下同)的实验室首次引入了铁死亡这一术语,用来描述一种独特的由脂质过氧化驱动的,依赖于铁的受调控的细胞死亡形式(图1)。铁死亡并不同于细胞凋亡等其他形式的细胞死亡方式。其发现可以追溯到我们在 2003 年发现的一类诱导非凋亡形式的细胞死亡的小分子。这类小分子以铁依赖的形式调节细胞死亡,并对分子水平的扰动高度敏感。同时根据Marcus Conrad 等人在 2008 年的发现,控制细胞氧化还原稳态的关键基因参与调控了这种非凋亡形式的细胞死亡。
在引入铁死亡这一概念之前,三个重要的领域相互交错汇集,为我们现在所说的铁死亡领域提供了最底层的理解——(1)细胞代谢机制,(2)活性氧(ROS)的调控,和(3)铁的调节。
首先,对氨基酸和脂质代谢机制的理解为铁死亡的发现提供了基础。1955 年,Harry Eagle 的研究发现氨基酸半胱氨酸(cys)对于小鼠成纤维细胞株 L 和Hela细胞系的存活和生长至关重要;1973 年,Jerry Mitchell 发现对乙酰氨基酚引起的大鼠肝性坏死是谷胱甘肽 (GSH) 和 cys 依赖的。Shiro Bannai 在 1977 年的研究发现(图1),cys 的氧化形式——胱氨酸与GSH耗竭相关的细胞死亡有关,这种细胞死亡可以用维生素E来预防。
同时,众多研究阐明了脂质代谢的关键机制。Michel Eugene Chevreul 于 1823 年报道了脂肪酸的分型,1929 年,乔治夫妇和米尔德雷德·伯尔发现并报道了多不饱和脂肪酸(PUFA,图2),例如大鼠饮食的基本成分亚油酸(18∶2,其中 18 代表脂肪酸中的碳数,2 代表双键的数量)和亚麻酸(18∶3)。1813 年 Nicolas-Louis Vauquelin、1846 年 Theodore-Nicolas Gobley 和 1874 年 Johann Wilhelm Thudichum 的研究发现了磷脂 (PLs),这是细胞膜的关键组成部分。当PUFA是磷脂(如PLs)的一部分的时候,它将成为铁死亡的底物。
其次,研究人员阐明了生物分子氧化损伤的生物学意义。氧化剂过氧化氢由 Louis Jacques Thenard 在 1818 年合成,H2O2 的生物学机制由 Christian Friedrich Schonbein 在 1863 年、Oscar Loew 在 1900 年、Otto Warburg 在 1923 年、Kurt Stern 在 1930 年代和 Gordon Mills 在1965 年逐一解析。1980 年,Shiro Bannai 和 Emi Kitamura 发现了系统 xc-(system xc-)是摄取胱氨酸,一种谷胱甘肽(GSH)合成的前体,的反向转运的蛋白(图 2)。GSH阻止过氧化氢等氧化剂引发的“氧化应激(oxidative stress)”(这是 Helmut Sies 在 1985 年创造的一个术语)。此外,硒也涉及了保护细胞免受氧化应激的关键调控轴。硒由 Jons Jacob Berzelius 于 1818 年发现。1982 年,Fulvio Ursini 及其同事发现了一种硒蛋白,谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4),可作为一种 GSH 依赖的过氧化物酶来对抗细胞膜上脂质的氧化(图2)。然而,在 C57BL/6J * 129S6SvEv 小鼠中,用半胱氨酸取代 GPX4 中的硒代半胱氨酸活性位点残基仅会影响大脑中的特定中间神经元,Marcus Conrad 及其同事在 2018 年报告了这一点。值得注意的是,用半胱氨酸替换 GPX4 活性位点的硒代半胱氨酸会导致 C57BL6 小鼠胚胎致死,这表明 GPX4 中对硒代半胱氨酸的需求存在环境依赖性。
第三,研究人员发现了铁及其代谢的生物学重要性。1713 年 Lemery 和 Geoffroy 在人体中发现了铁,1876 年,Henry John Horstman Fenton 发现铁盐可与过氧化物反应产生羟基自由基,提出了现在以他的名字命名的反应(Fe2+ + HOOH / Fe3+ + OH- + OH.)。1937 年,Vilem Laufberger 成功结晶并发现了一种重要的铁储存蛋白——铁蛋白,它将铁螯合为 Fe(III),以防止芬顿反应。1945 年,Carl Holmberg 和 CarlBertil Laurell 发现了以转铁蛋白 (Tf) 形式进行的铁转运的主要机制。DMT1铁转运蛋白的发现源于发现小鼠对细胞内病原体的抗性由称为“天然抗性相关巨噬细胞蛋白”的NRAMP1的基因控制,而其相关基因称为NRAMP2。Nancy Andrews 发现 NRAMP2,后来更名为 DMT1,是小鼠小红细胞性贫血的遗传原因,也是研究人员在长期寻找的铁转运蛋白。连同铁输出蛋白ferroportin(FPN)的发现,这些研究为我们理解铁在细胞内的稳态奠定了基础。
同时,其他不同于细胞凋亡的潜在细胞死亡机制也被阐明。其中,鉴定出细胞焦亡(pyroptosis)作为一种炎症性的非凋亡的受调控细胞死亡方式;同时及鉴定出程序性坏死(necroptosis)作为一种受调控的坏死(necrosis)方式。同时,2001 年至 2003 年在我的实验室中对 HRASV12进行选择性致死小分子高通量筛选并由此发现了一种新化合物,我们将其命名为 erastin(用于杀灭RAS 突变细胞),它能够诱导非凋亡的细胞死亡,这种诱导效应取决于氧化应激水平和细胞铁的积累。我们进一步进行了更大的筛选,并筛选到了新的化合物,包括 RAS-selective-lethal-3 (RSL3),它们同样诱导非凋亡的、铁依赖的氧化型细胞死亡。2008 年,Marcus Conrad等人的研究报道,GPX4 的遗传缺失诱导了由脂质过氧化驱动的非凋亡的细胞死亡,这种死亡方式可以被α-生育酚抑制,同时过表达系统xc -可以保护细胞免受脂质过氧化诱导的非凋亡的细胞死亡。2012 年,我和包括 Scott Dixon在内的实验室成员,提出了一种铁依赖的受调控的细胞死亡的概念,它不同于细胞凋亡、不受调控的坏死和程序性坏死,我们称之为铁死亡。
我们发现,erastin 通过抑制xc系统摄取胱氨酸,导致 cys 和 GSH 的耗竭,来诱导铁死亡。而RSL3 诱导铁死亡的分子靶标是 GPX4,这一发现与早期报道 GPX4 控制非凋亡形式的氧化性细胞死亡一致,同时也将 GPX4 确定为铁死亡调控的中心(图2)。
铁死亡被定义为一种铁依赖的脂质过氧化介导的细胞死亡形式。这可以在细胞培养中通过铁螯合剂和亲脂性的抗氧化剂是否逆转细胞死亡来鉴定。在人类和动物组织样本中,铁依赖的脂质过氧化标志物的存在可用于识别铁死亡的存在(见下文)。
自 2012 年以来,已在多种生物学系统中鉴定到铁死亡——例如,作为器官损伤的驱动因素,作为一种古老的细胞死亡形式,由内源性修复和保护系统控制,并且作为一种细胞死亡模式,在半胱氨酸缺乏的情况下培养小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 时激活,这同时还取决于Tf 和氨基酸谷氨酰胺的存在。在不同系统中反复观察到的铁死亡揭示了这种细胞死亡发生的普遍性。
在这篇综述中,我提供了一个框架,用以理解大量新兴的,数量在过去十年中呈指数增长的文献(图1)。这些文献都是关于这种铁依赖的过氧化的细胞死亡形式:铁死亡,一个处于新陈代谢、ROS和铁调节机制的生物学的交叉点,而这些领域中的每一个都有助于我们理解铁死亡的机制、生物学意义和临床治疗相关性。我在这个框架内描述了铁死亡调控机制的最新进展,包括控制铁死亡的细胞器,以及铁死亡的正常生理功能。此外,我总结了涉及铁死亡的关键病理背景和铁死亡调控的新兴治疗应用。最后,我阐明了一些助于理解铁死亡的有用概念,以及可能推动未来十年铁死亡研究的关键未解决问题。
图1:铁死亡文献中的主要里程碑和增长情况
图2:铁死亡的机制
铁死亡的机制
在过去十年中,尤其是近几年,我们对铁死亡的调控机制的理解取得了重大进展,这反过来又影响了我们如何概念铁死亡在生物学和医学中的作用。如下所述,许多研究阐明了在铁死亡期间经历氧化并驱动细胞死亡过程的特定脂质、抑制铁死亡的内源性机制、控制铁死亡敏感性的铁代谢调节的关键机制,以及参与铁死亡的细胞器。我在新陈代谢、活性氧生物学和铁调节的交叉点为中心的框架内总结了铁死亡的范式。
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代谢产生的铁死亡的底物和铁死亡的天然抑制剂
为了铁死亡的发生,特定的脂质必须经历过氧化,并且阻止过氧化脂质积累的天然防御机制必须受到损害(图 2)。细胞在正常代谢过程中,一方面产生过氧化脂质的底物和氧化剂,另一方面产生防止脂质过氧化的抑制剂。

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脂代谢:ACSL4和LPCAT3生产铁死亡的脂质底物
铁死亡最终是由特定膜脂的过氧化作用驱动的(图 2)。只有脂质中的特定碳原子易受过氧化作用,因为该反应涉及过氧基 (O-O)取代与碳原子相连的氢原子;因此,脂质发生过氧化的倾向取决于其碳氢键的强度(图 2)。由于在相邻的 C=C 双键之间存在异常弱的 C-H 键,因此PUFA特别容易发生过氧化。因此在最初,人们认为游离 PUFA 可能是铁死亡的驱动因素似乎是合理的。然而发表于2015 年至 2017 年的几篇论文表明,游离脂肪酸不是并铁死亡的驱动因素,而是需要活化PUFA 并将其掺入膜脂(如 PLs)中,以便产生致命性的过氧化物。鉴定驱动细胞死亡的特定脂质,以及促进其生成和掺入细胞膜的酶,一直是过去十年铁死亡研究的重要发现之一。
在以单倍体为主的细胞系KBM7中进行的插入诱变筛选显示,乙酰辅酶 A (CoA) 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (LPCAT3) 的失活使这类细胞对两种不同的 GPX4 抑制剂具有抗性——第一种是GPX4 抑制剂 RSL3,以及另一种名为 ML162 的化合物。此外,铁死亡抗性细胞的CRISPRi筛选分析独立地得出 ACSL4 失活是一种在不同情况下抑制铁死亡的关键机制;此外,在这种情况下,ACSL4 的过表达对铁死亡敏感。鉴于 ACSL4 和 LPCAT3 参与活化和整合 PUFA,如花生四烯酸 (AA),进入膜定位的脂质,说明PUFA 需要存在于其膜结合环境中以表现过氧化后的杀伤力(图2)。因此,尽管系统 xc和GPX4通常作为铁死亡的强抑制因子发挥作用,ACSL4 和 LPCAT3 仍是第一个确定的促铁死亡基因产物,因为它们在促进 PUFA 掺入膜脂中发挥着作用(图 2)。最近的一份报告表明,ACSL4 还积极参与正反馈循环以执行铁死亡:蛋白激酶 Cβ型同工型 2 (PKCbII) 感知初始脂质过氧化事件并磷酸化ACSL4的Thr328位点以驱动ACSL4的激活并促进 PUFA 掺入PL 并驱动随后的细胞死亡。通过信号通路调节ACSL4的水平也是调控铁死亡的一个手段:E-钙粘蛋白通过 Merlin-Hippo-YAP 通路发挥作用,通过调节 ACSL4 的表达以响应细胞间接触来调控细胞对铁死亡的敏感性。因此,ACSL4 可能更类似于caspase-3,细胞凋亡的刽子手,作为细胞死亡的执行者,而不是管家蛋白。
其他 ACSL 酶家族也可以调节铁死亡:一些植物产生的共轭亚麻酸(例如 α-桐酸)需要 ACSL1 才能发挥其促铁死亡活性。此外,单不饱和脂肪酸 (MUFA),如油酸,需要 ACSL3 才能发挥抗铁死亡作用 。推测这些依赖于 ACSL 的铁死亡调节作用需要将脂肪酸掺入膜结合(例如PL)的脂质中。上述这些研究发现已经确定 ACSL 酶家族对铁死亡至关重要,也表明将脂肪酸活化为 CoA 酯是铁死亡的关键调控步骤。
有些研究试图确定驱动铁死亡的特定膜脂类型。如上所述,ACSL4 和 LPCAT3 作为铁死亡的关键驱动因子的发现表明,游离 PUFA 本身并不是铁死亡的驱动因素。与该结论一致的另一个最近的发现是,磷脂酶 A2 组 VI (iPLA2b) 通过从 PL 中去除氧化的 PUFA 尾部来抑制 p53 驱动的铁死亡。因此,氧化的 PUFA 尾部必须保留在膜结合的 PL 的环境中(即膜上),以促进铁死亡的发生;有趣的是,一旦从 PL 上切割下来,氧化的 PUFA 尾巴就不再驱动细胞死亡(图 2)。这突出表明氧化的 PUFA 对细胞没有内在毒性,但特定细胞膜内过氧化PUFA的过度积累是导致铁死亡的事件。iPLA2b(也称为 PLA2G6)的失活或缺乏与帕金森病(PD)和运动障碍以及胎盘滋养细胞过度的铁死亡,并导致胎儿发育不良的风险有关。因此,在至少两种疾病背景下,含氧化 PUFA 的膜脂的积累会导致病理性铁死亡。因此,不应将铁死亡的发生视为一种一般类型的氧化应激,而应将其视为致命的发生于细胞膜的脂质过氧化物的积累。
并非所有含 PUFA 的膜定位脂质都会导致铁死亡。2017的一项研究据报道,特定的 PL,即具有一个花生四烯基 (20∶4) 或一个肾上腺基 (22∶4) PUFA 尾部的磷脂酰乙醇胺 (PEs),与其他 PL 相比与铁死亡的关系更紧密。尽管在本研究中通过 LC-MS/MS 可以检测到 350 种不同的 PL,包括 130 种含氧脂质,但那些有着PE头, 20:4 和 22:4 酰基尾的PL与铁死亡的敏感性关联最强。
PL 具有两个脂肪酰基尾,一个通常衍生自饱和脂肪酸,例如棕榈酸 (C16:0),另一个衍生自任何类型的脂肪酸,例如 MUFA、PUFA 或饱和脂肪酸。然而,可以检测到两个PUFA尾巴的不寻常 PL——这类尾巴与铁死亡高度相关。含有 PUFA 的醚脂,例如缩醛磷脂,也与铁死亡敏感性有关,2-花生四烯酸甘油也是如。因此,几种具有 PUFA 尾巴的不同脂质有助于驱动铁死亡。此外,PUFA 生物合成本身就是一种调节对铁死亡敏感性的手段:能量应激通过激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶 (AMPK) 通过控制乙酰辅酶 A 羧化酶 (ACC) 限制 PUFA 生物合成的作用来抵抗铁死亡。总之,含 PUFA 的位于细胞膜的脂质是铁死亡的驱动因素,其中包括 PL、醚脂质和其他甘油衍生的脂质。
ROS生物学
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GPX4和谷胱甘肽抑制脂质ROS的积累
Erastin 和 RSL3 代表着前两类铁死亡诱导化合物(即一类和二类FIN,ferroptosis inducers),一类通过抑制系统 xc阻止胱氨酸的摄取,另一类通过抑制 GPX4 发挥作用(图 2)。同时,通过其他机制消耗 GSH 也可以使细胞对铁死亡敏感:多药耐药基因 MDR1 通过调控GSH 的产出来提高对铁死亡的敏感性;而 cys 分解代谢酶 cys 双加氧酶 1(CDO1)通过消耗 cys 进而降低GSH 水平,调节细胞对铁死亡的敏感性。最近的一份报告表明,谷氨酸 (Glu)-cys 连接酶(其催化亚基由 Glu-cys 连接酶催化亚基 [GCLC] 编码)不仅通过合成 GSH来抵抗铁死亡,还通过转化Glu为g-谷氨酰肽,从而限制其水平来提升铁死亡抗性,这也表明 Glu 可以促进铁死亡。
GPX4的降解,而不是 GPX4的抑制,可以促进铁死亡。2016 年,我的实验室在半胱天冬酶无关致死 (CIL) 化合物的筛选中发现了一种新的铁死亡诱导化合物:Ferroptosis-Inducer-56 (FIN56) ,它通过介导GPX4的降解发挥作用。筛选中最显著命中的化合物被称为 CIL56。通过优化这种化合物分子骨架的周围结构,最终产生了一种选择性诱导铁死亡而不激活坏死的化合物。这种被称为 FIN56 的化合物不仅可以诱导 GPX4 的降解,还可以通过甲羟戊酸途径发挥作用:通过消耗辅酶 Q10 (CoQ10) 来提高细胞对铁死亡的敏感性。其他控制 GPX4 降解的机制也参与调节对铁死亡的敏感性:例如,伴侣介导的自噬会诱导 GPX4 的降解并有助于铁死亡的发生。
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不依赖于GPX4的脂质ROS积累的调控方式
GPX4 是一种铁死亡的中枢抑制因子。然而,在过去几年中,已经发现了三种不依赖 GPX4 的铁死亡抑制系统。它们分别为铁死亡抑制蛋白 1 (FSP1)/CoQ10、二氢乳清酸脱氢酶 (DHODH) 和 环GTP 水解酶 1 (GCH1)/四氢生物蝶呤 (BH4) ,通过独立于 GPX4的方式来抑制铁死亡。1956 年,CoQ10 首先在牛心脏中被纯化出来,最初被称为维生素Q10 或泛醌,由于其普遍的存在和类似维生素的结构,并在随后的几十年中被证明在电子传递链中发挥至关重要的电子携带作用。GPX4 虽然是抵抗脂质过氧化的主要防御者,CoQ10 仍是防御铁死亡的脂质过氧化的第二种内源性机制。事实上,辅酶Q10 存在于整个细胞的不同类型膜中,而不仅仅是线粒体中。两个研究报告说,以前称为 AIFM2 并更名为 FSP1 的基因产物通过消耗烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH,是细胞还原能力的主要来源) 来再生还原形式的辅酶Q10。还原的 CoQ10 清除脂质过氧化中间体而后被氧化。同时进一步的消耗NADPH,以再生还原形式的辅酶Q10。事实上,NADPH 被发现是预测 NCI60 癌细胞系对铁死亡抗性的生物标志物,据报道,细胞溶质磷酸酶 MESH1 通过其对 NADPH 丰度的影响来控制细胞对铁死亡的敏感性。
在2020 年和 2021 年又报道了另外两个不依赖 GPX4 的,抑制导致铁死亡的脂质过氧化的系统。首先,在 CRISPRa筛选中发现可生产内源代谢物 BH4的GCH1作为铁死亡的抑制因素,这个基因同时在CRISPRi筛选中作为铁死亡的增强因素。GCH1 的表达产物通过两个方面的机制抑制铁死亡:(1)GCH1 产生亲脂性抗氧化剂 BH4,其功能类似于 CoQ10 以防止脂质过氧化,(2)GCH1 介导脂质膜环境的重塑从而增加还原 CoQ10 的丰度,同时消耗铁死亡的诱导因素PUFA-PL。其次,DHODH 被确定为位于线粒体的铁死亡的抑制因子,类似于 FSP1 在线粒体外膜中的功能,通过还原线粒体的 CoQ10 发挥作用。GCH1或DHODH高表达的细胞表现出更强的铁死亡抵抗力,而低表达的细胞则对铁死亡更敏感。
最后,最近的一份研究表明,还有其他的铁死亡抑制机制,独立于 GSH/GPX4、FSP1/DHODH/CoQ10 和 GCH1/BH4。氨基酸氧化酶白细胞介素4诱导因子1(IL4i1) 最初是在 B 细胞中作为响应 IL-4 诱导的基因而发现的,而它产生的代谢物In3Py,同时通过清除自由基、调节铁死亡相关抑制基因的机制来抑制铁死亡。其他内源性代谢物可能通过抑制脂质过氧化所需的自由基中间体或通过控制调节脂质过氧化的基因的表达来类似地抑制铁死亡。
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铁的调节:铁驱动的脂质过氧化
含有 PUFA 的膜脂过氧化是由促进Fenton 反应的不稳定铁池(促进脂质过氧化)和以铁为辅助因子的酶,如花生四烯酸脂氧合酶 (ALOX,能够引发脂质氢过氧化物的形成,这些脂质氢过氧化物是芬顿反应的底物)驱动。15-脂氧合酶可以与 PE 结合蛋白 1 (PEBP1) 复合,将酶的底物从游离 PUFA 特异性的转换为膜PL的PUFA尾。此外,p53 依赖的铁死亡需要 12-脂氧合酶。(同时)细胞色素 P450 氧化还原酶 (POR) 也有助于铁死亡过程中的脂质过氧化,这表明几种以铁为辅助因子的酶具有促进导致铁死亡的脂质过氧化的能力(图 2)。
通过铁自噬(ferritinophagy)控制铁蛋白的水平并进一步的调节游离铁的丰度能够调控细胞对铁死亡的敏感性,因为铁蛋白的的丰度能够决定不稳定铁池(labile iron pool)的大小。同样的,激酶共济失调毛细血管扩张症 (ATM) 通过调节铁蛋白水平来控制细胞对铁死亡的敏感性。其他控制细胞内游离铁水平的机制也能够影响细胞对铁死亡的敏感性:铁通过 FPN转运出胞或通过 prominin-2 (prom2) 介导的含铁蛋白多泡体 (MVB) 输出;同时外泌体通过耗尽细胞中的不稳定铁池以及诱导脂质过氧化的能力,也可以驱动细胞对铁死亡的抵抗 。
内过氧化物与铁的反应也会引发铁死亡。FINO2 为代表第四类FIN,由 Keith Woerpel 等人于 2016 年通过合成和分析一系列含 1,2-二氧戊环的化合物发现,其诱导铁死亡的方式并不是抑制系统 xc-、消耗 GSH、直接抑制 GPX4 或诱导 GPX4 的降解。因此,FINO2 代表了另一种诱导铁死亡的机制方法。FINO2 将 Fe(II) 氧化为 Fe(III),因而与其他诱导铁死亡的化合物相比,铁螯合剂更有效地抑制了其致死活性。FINO2 处理的细胞检测到的氧化脂质的分布比erastin 处理后更广泛,这表明 FINO2 与 Fe(II) 发生芬顿反应,产生直接引发脂质过氧化的烷氧基自由基。另一种可能是 FINO2 通过氧化非血红素铁辅助因子结合并激活脂氧合酶或其他铁依赖性酶:脂氧合酶的活性形式铁是三价铁。据报道,其他内过氧化物也会诱导一定程度的铁死亡,例如青蒿素及其衍生物。因此,内过氧化物代表了铁死亡诱导化合物的一个来源,这些化合物的作用方式与erastin、RSL3和FIN56等化合物不同,它们会直接破坏能够缓冲脂质过氧化物的铁死亡防御机制。因此在某些情况下,内源性内过氧化物(如前列腺素)可能成为铁死亡的自然触发因素。
Fe(II) 以不稳定铁池的形式存在于细胞中,与包括 GSH 在内的低分子量化合物结合。GSH 的消耗不仅可以使 GPX4 失活,还可以为 Fenton 反应提供游离的 Fe(II),促进脂质过氧化物的传播并最终导致铁死亡。此外,铁蛋白中的铁储存需要暂时性地形成 GSH-铁复合物,该复合物通过伴侣多聚 (rC) 结合蛋白 1 (PCBP1) 将铁传递给铁蛋白。因此,GSH 的消耗促进了不稳定铁的可用性。然而,GSH 耗竭对于铁死亡不是必需的,因为在没有 GSH 耗竭的情况下直接抑制或敲除 Gpx4 足以引发铁死亡。
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整合了代谢、活性氧生物学和铁的调节的抗铁死亡机制
其中至少三种抗铁死亡的主要机制已被确定——抗氧化调节剂 NRF2、转硫途径以及mTOR。NRF2 是抗氧化反应的主要调节因子,主要驱动抑制铁死亡的转录反应;NRF2 介导的保护机制因细胞和组织环境而异——例如,在胰腺癌细胞中,NRF2 通过激活抑制 ALOX5 的微粒体 GSH S-转移酶 1 (MGST1) 来抑制铁死亡。而在肝癌细胞中,NRF2 通过调控铁蛋白来驱动对铁死亡的抵抗。
转硫途径通过从蛋氨酸代谢中产生半胱氨酸来增强对铁死亡的抗性,克服由系统 xc被抑制而产生的半胱氨酸饥饿。2016 年对铁死亡抑制因子的 siRNA 筛选显示,CARS(半胱氨酰-tRNA 合成酶)的敲低最成功的使细胞对铁死亡敏感,它通过激活转硫途径抵抗erastin 诱导的铁死亡。据报道,当在培养基中补充转硫途径代谢物同型半胱氨酸时,会增强细胞的铁死亡,而不介导对铁死亡抵抗。这表明同型半胱氨酸可以独立于作为半胱氨酸的来源发挥作用。
mTOR 通路通过增加 GPX4 蛋白合成和增加甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)介导的脂肪合成来来促进细胞对铁死亡的抵抗。因此,可以通过控制铁的稳态、活性氧的丰度和细胞代谢来产生铁死亡的抗性。
驱动铁死亡的细胞器
铁死亡是通过过氧化脂质的积累来实现的。近年来,研究人员对这些不同亚细胞定位的含有氧化脂质的膜进行了探索,阐明了各种细胞器对铁死亡的贡献(图 3)。
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质膜破裂是铁死亡的晚期事件
质膜的崩坏在铁死亡进展的末期发生,这在各种不同类型的细胞死亡中很常见。ESCRT III 复合物可修复质膜损伤并减缓因铁死亡导致的细胞死亡。此外,已显示铁死亡信号能够在细胞之间传播,同时这种传播不依赖于质膜的破裂。相反,铁死亡信号向邻近细胞的传播可能取决于具有完整质膜包被的氧化脂质的释放,比如通过胞外囊泡;释放的氧化脂质可能会引发邻近细胞的铁死亡。如上所述,FSP1 通过还原定位于质膜的 CoQ10 发挥其铁死亡防御功能,因此认为质膜上的脂质过氧化是铁死亡进展的重要后期步骤。
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内质网是铁死亡过程中脂质过氧化的重要部位
给药后使用受激拉曼散射 (SRS) 显微镜对铁死亡抑制剂,即带有炔标记的 ferrostatin(一种铁死亡抑制剂)类似物的定位进行成像,结果显示这些化合物在溶酶体、线粒体和内质网 (ER) 中积累。然而,这些化合物在溶酶体和线粒体中的积累并不影响它们诱导铁死亡的能力,表明抑制 ER 中的脂质过氧化足以阻止铁死亡发生。而那些能够调控脂质过氧化来调节铁死亡的化合物主要定位于 ER,表明 ER 是铁死亡过程中脂质过氧化的最关键部位(图 3)。尽管 PUFA 也可以定位于脂滴,但脂滴中 PUFA 的存在并不会导致铁死亡。
细胞中ER 的体积大小可能是铁死亡敏感性的关键决定因素。与这个观点一致的,研究观察到ER 的粘度在铁死亡期间增加,这个现象可能是由于氧化 PUFA-PL 的聚集,并会导致 ER 膜变硬。
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线粒体作为半胱氨酸饥饿诱导的铁死亡的引发者和放大器
几项研究表明,线粒体可以作为半胱氨酸饥饿和谷胱甘肽耗尽介导的铁死亡的引发者或放大器。例如,线粒体 DHODH 和线粒体 CoQ10 抑制以这种方式触发的铁死亡的能力突出了线粒体的这一功能。同时,抑制位于线粒体的电子传递链也可以减轻由 cys 饥饿引起的铁死亡,直接对线粒体功能进行耗竭的结果也是如此。电子传递链的作用可能是由于电子泄漏从而产生超氧化物和 H2O2,然后它们与 Fe(II) 反应以驱动 Fenton 反应和脂质过氧化。
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过氧化物酶体通过醚脂的过氧化作用驱动铁死亡
一次研究中,通过 CRISPR 筛选发现涉及过氧化物酶体功能的基因能够调节铁死亡,提示过氧化物酶体醚脂质(例如缩醛磷脂)是铁死亡的驱动因素。虽然过氧化物酶体 ROS 在铁死亡过程中没有被直接检测到,但是过氧化物酶体中产生的 H2O2 可能会引发脂质过氧化,这一过程可能需要过氧化物酶体 Fe(II) 的参与。
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溶酶体是铁的储存库,可以引发铁死亡
Ferrostatins 在溶酶体中积累,但它们的溶酶体定位并不能帮助它们抑制由erastin 或RSL3 诱导的铁死亡。因此,在这种情况下,溶酶体通常不会导致铁死亡。然而,溶酶体是铁的储存库,具有潜在诱发铁死亡的能力。事实上,将 FINO2 型内过氧化物重新定位到溶酶体可以引发铁死亡,尽管仍然需要通过 ER 的参与(图 3)。此外,溶酶体蛋白皂苷的敲除导致脂褐质积累,从而介导溶酶体铁和 ROS的积累,以及随后的神经元铁死亡。
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高尔基体应激可以促进铁死亡
在某些情况下,用 brefeldin A 等药物触发的高尔基体应激会引发铁死亡。此外,Tf 受体蛋白 1 (TfR1) 通过内体循环将细胞内定位从高尔基体的转移到质膜;这种重新定位可以作为不依赖于ROS的铁死亡标志物,还可以作为杀死细胞的开关,通过额外摄取负载铁的Tf来进一步增强铁死亡。
总之,内质网是驱动脂质过氧化的中心枢纽,而脂质过氧化通过铁死亡促进细胞死亡。这是合乎逻辑的,因为大量的脂质和多不饱和脂肪酸的代谢发生在 ER 中。然而,其他细胞器,如线粒体、溶酶体、过氧化物酶体和高尔基体,可以通过启动脂质过氧化或增强 ROS 的产生来启动铁死亡或增强细胞对铁死亡的敏感性。最终,脂质过氧化物扩散到质膜,它们在那里引发质膜的破裂(图 3)。ROS和脂质过氧化物如何在细胞器之间运输并促进铁死亡很大程度上仍未得到探索。此外,脂质过氧化物最终如何破坏细胞膜并导致细胞死亡的机制仍然未知。尽管如此,我们知道在自然界中,由脂质过氧化驱动的铁死亡已在许多正常生理环境中被利用,如下一节所述。
图3:细胞器和器官在铁死亡中的作用
铁死亡的生理学功能
当我们在 2012 年首次提出铁死亡这一概念时,我们就发现它与 Glu 的毒性有关,但是铁死亡是否参与正常的生理学过程尚不清楚——最近的数据表明,铁死亡确实涉及了许多生理过程。
寻找涉及铁死亡的生物过程的一个关键步骤是发现了检测铁死亡的标记物(图 5)。鉴于铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化驱动的,因此在铁死亡期间检测这种脂质过氧化是必要的(图 5)。此外,线粒体在铁死亡期间通常表现出萎缩、致密的形态(因此可以通过检测线粒体来判断铁死亡)。还可以检测特定的基因表达变化:例如铁死亡的细胞中TfR1 的上调及其重定位于质膜(图 5)。通过使用这些标记,已经发现了这种古老的细胞死亡方式的许多自然生理功能。
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肿瘤抑制和免疫功能
许多肿瘤抑制因子通过诱导铁死亡发挥其部分肿瘤抑制功能(图 4)。肿瘤最常突变的抑癌基因 p53 通过抑制溶质载体家族 7 成员 11 (SLC7A11,是编码系统 xc 组件的两个基因之一) 的表达驱动癌细胞的铁死亡。p53 还激活 ALOX12,一个位于 17p 染色体的一个基因,该基因经常在肿瘤中丢失,来促进脂质过氧化。p53能够在叔丁基过氧化氢(脂质过氧化的引发剂)存在下介导ALOX12 依赖性细胞死亡,该细胞死亡可被 ferrostatin-1 抑制并引起铁死亡标记基因 Ptgs2 的表达,表明这种细胞死亡是铁死亡的变体,虽然这种死亡方式对铁的依赖性仍有待检测。此外,在非洲裔人群中发现的密码子 47 (S47) 处的 p53 变体改变了 p53 诱导细胞死亡和抑制肿瘤形成的能力。这种变异会导致 GSH 和 CoA 积累,以及铁的积累和感染风险增加,但对疟疾毒素 hemozoin 具有抗性,这或许可以解释其在疟疾感染高风险地区的选择性。
在小鼠中敲除表观遗传调节因子 MLL4(通常在皮肤的皮肤鳞状细胞癌中发生突变)能够导致皮肤癌前病变的发展。这些小鼠皮肤中 MLL4 的缺失驱动了的转录水平的铁死亡抑制,包括增加 SLC7A11、GPX4 和硬脂酰辅酶 A 去饱和酶 1 (SCD1) 的表达、降低促进铁死亡的脂氧合酶 ALOX12、ALOX12B 和 ALOXE3的表达,这些基因的表达变化都增强了细胞对铁死亡的抵抗(图 4)。同样地,泛素羧基末端水解酶 (BAP1) 和 NFS1通过调节铁死亡调控网络发挥肿瘤抑制作用(图 4)。
肿瘤细胞从细胞外环境摄取地 PUFA 会抑制肿瘤生长:与富含 MUFA 的饮食相比,富含 PUFA 的饮食会减缓小鼠 HCT116 异种移植肿瘤的生长。因此,饮食中的多不饱和脂肪酸可以通过这种机制自然地抑制肿瘤(图 4)。另一方面,肿瘤微环境中的胆固醇会导致 CD8+ T 细胞上的 CD36 表达增加,并导致这些细胞摄取 PUFA 并发生铁死亡。因此,过量的胆固醇积累可能会通过减少CD8+T细胞的肿瘤浸润来促进肿瘤形成(图 4)。
据报道,CD8+ T 细胞通过诱导肿瘤细胞的铁死亡发挥其抑制肿瘤的作用。这种诱导活性是由活化的 CD8+T细胞分泌干扰素 γ (IFNg) 介导的,并以此通过下调 SLC7A11 导致肿瘤细胞的铁死亡。此外,IFNg 还上调 ACSL4,这有助于铁死亡底物PL-PUFA的合成。添加外源性AA(一种 PUFA,上文有提及),连同 IFNg的介导,足以诱导肿瘤的铁死亡。此外,在肿瘤微环境中检测到过量的 AA,表明源自 CD8+ T 细胞的 AA + IFNg 可能是第一个确定的天然铁死亡触发因素(图 4)。缺乏其他已知的铁死亡生理型诱导剂可能仅仅只是反映了我们知识的空白,也或许是在组织中引发铁死亡的后果是破坏性的,使铁死亡成为除肿瘤抑制之外别无用武之处。
暴露于感染或疫苗后的持久免疫反应需要生发中心衍生的成熟、高亲和力浆细胞和记忆 B 细胞。滤泡 CD4+ 辅助 T 细胞 (Tfh) 促进产生这种持久的免疫 B 细胞反应。这些 Tfh 细胞的活性必须在正常条件下受到严格调节,以防止自身免疫或病原体的再次感染。Tfh 细胞的数量受 GPX4 控制的细胞死亡调节,通过补充硒提高 GPX4 丰度可增加接种流感疫苗后的抗体反应。然而,其他一些研究表明补充硒的益处有限;因此需要进一步验证硒和 GPX4 在调节 Tfh 细胞数量中的作用。
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发育和衰老
最近的一项研究报告了一种抗体 (HNEJ-1) 的产生,该抗体能够识别被脂质过氧化的终产物 4-羟基-2-壬烯醛 (HNE) 修饰的蛋白质,以此证明它可以识别铁死亡细胞。从 E9.5 到 2.5 岁的不同年龄的大鼠的许多组织和细胞中都表现出这种铁死亡标记,其中包括 E13.5 的有核红细胞;抑制铁死亡也导致红细胞去核的延迟。衰老加速小鼠易发 8(SAMP8) 小鼠品系中的铁死亡标志物也增加,其自然地表现出加速的衰老特征。因此,铁死亡可能与红细胞生成的正常过程以及许多器官的衰老过程有关(图 4)。
铁死亡的在衰老和发育中的作用横跨不同的界别、不同的物种。例如,据报道,线虫C. elegans的衰老与铁水平的升高、GSH 的消耗以及对铁死亡的敏感性的增加有关。铁死亡还与稻瘟病真菌病原体 Magnaporthe Oryzae 的发育性的细胞死亡有关,并被发现是其感染阶段所必需的。
图4:铁死亡的生理功能
图5:铁死亡的标志物
涉及铁死亡的病理过程
除了上述涉及铁死亡的正常生理功能外,铁死亡还与许多病理过程有关。应该指出的是,触发铁死亡的特定细胞层面和分子层面的病理生理机制以及触发铁死亡导致的病理后遗症的机制在许多情况下是未知的。
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铁过载疾病
鉴于铁在驱动脂质过氧化中的关键作用,许多涉及铁过载的疾病与铁死亡有关也就不足为奇了。遗传性血色素沉着病是一种铁过载疾病,它是由调节铁代谢基因的遗传突变引起的。最近的一份研究说明,喂食高铁饮食的小鼠和具有遗传性血色素沉着症相关突变的小鼠会出现带有铁死亡标志的肝损伤,而这种情况可以通过施加 ferrostatin-1 抑制铁死亡逆转;此外,即使在遗传性血色素沉着病模型的小鼠中,低铁饮食也能够逆转铁死亡标志物的产生。这些发现再次强调了饮食变化会影响组织细胞对铁死亡的敏感性。
脑损伤也和铁过载有关。可以通过注射 FeCl3 到大鼠的躯体感觉皮质,这会导致癫痫发作和认知功能降低,来模拟脑损伤。Ferrostatin-1 挽救了这些由铁过载导致的影响,表明这种脑损伤模型涉及到过度的脂质过氧化和可能的铁死亡。
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Sedaghatian 型脊柱干骺端发育不良 (SSMD)
SSMD是一种罕见的新生儿疾病,表现为严重的呼吸窘迫、干骺端软骨发育不良和其他发育问题。已经报道了四个 SSMD 相关的 GPX4 截断突变,这类突变与 GPX4 蛋白的完全丧失和新生儿出生后不久的死亡有关。最近,发现了丧失部分功能的点突变的GPX4 (R152H),这种点突变会导致酶活性受损,但不会完全丧失功能。与上述 SSMD 相关的 GPX4 突变不同,尽管发育受到了影响,具有该突变体的新生儿仍可以生存(图 3)。该突变还通过防止 GPX4 上的两个赖氨酸残基被泛素化以防止降解以此稳定 GPX4 蛋白。
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器官损伤
在过去的十年中,已经报道了多种铁死亡在器官损伤期间被激活的模型。最近发现,5 μm 微塑料可诱导小鼠肝脏细胞的铁死亡,相同地,2.5 μm 颗粒物(PM2.5)可诱导小鼠肺细胞的铁死亡;还发现铁死亡会导致肾脏修复缺陷和炎性近端肾小管细胞的形成。此外,脓毒血症期间发生的血管渗漏可导致多个器官损伤,这与铁死亡相关基因表达、代谢组学变化和铁死亡特征的标志物有关。镰状细胞病导致的器官损伤与红细胞的溶解以及血红素在血浆中的积累有关。据报道,镰状细胞病模型小鼠的血清血红素和铁死亡以及心肌病的心脏标志物升高,而抑制铁死亡可以减轻标志物水平。其他涉及血红素渗漏到器官的疾病也可能涉及到铁死亡,而这可能是铁死亡病理性诱导的常见机制。
最近的一项研究报告说,多器官功能障碍综合征 (MODS) ,在重症监护病房 (ICU) 的危重患者中很常见,也涉及铁死亡。176 名危重成年患者血浆中游离铁和丙二醛(脂质过氧化的标志物)的水平与患者序贯器官衰竭评估(SOFA)评分呈正相关。此外,给小鼠服用硫酸铁会导致多器官损伤,并提高肾脏、肝脏、肌肉、心脏和血浆中的损伤标志物,而铁死亡抑制剂/因子(如维生素 E、GPX4)和捕获自由基的抗氧化剂(ferrostatin 类化合物)可减轻这种损伤。因此,抑制铁死亡可能是预防重症监护环境中患者发生多器官损伤的可行策略。
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视网膜变性
视网膜色素上皮细胞在视网膜疾病(例如与年龄相关的黄斑变性)发展期间经历变性和死亡。普鲁士蓝纳米颗粒可以通过减少亚铁离子的可用性来抑制这些细胞的死亡,这表明其细胞死亡机制可能涉及铁死亡。当全反式视黄醛的清除机制受损时,感光细胞会发生死亡,而对铁死亡的抑制会阻止它们的死亡。因此,视网膜疾病可能涉及铁死亡的发生。
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神经退行性疾病
大量研究表明铁死亡与多种神经退行性疾病有关,包括亨廷顿病 (HD)、阿尔茨海默病 (AD)、PD 和肌萎缩侧索硬化症 (ALS) 。最新的研究扩展了这些发现:GPX4 在 ALS 患者和小鼠模型的已经坏死失去功能的脊髓中被耗尽;而G93A SOD1 模型中 GPX4 的过表达可以延长脊髓神经的存活期并延迟疾病发作;以及,通过CuII(atsm)抑制铁死亡 ,是一种临床及临床前有效的 ALS 治疗方法。
Glu 的毒性可能涉及铁死亡。2001 年,引入了术语氧化性死亡(oxytosis)来描述因 Glu 引发的神经元中的氧化性细胞死亡,其中的机制涉及到蛋白质合成、真核翻译起始因子 2 亚基 1 (eIF2a)、ROS 产生、环磷酸鸟苷 (cGMP) 门控通道和钙流入,以及脂氧合酶和 GSH 耗竭。控制氧化性死亡的机制与控制各种在细胞类型和组织中存在的铁死亡的机制有多大程度的重叠仍不清楚。虽然两者都涉及系统 xc- 的抑制和 GSH的消耗 ,但氧化性死亡涉及到的过量的钙流入、cGMP 门控通道和 eIF2a的参与,以及线粒体肿胀和 DNA 片段化等特征在铁死亡中未观察到。为了确定氧化性死亡和铁死亡之间的关系,需要一套明确的标志物、检测方法和试剂来诱导和抑制氧化性死亡和铁死亡,以便对这些细胞死亡模式之间的异同进行系统的平行比较;而这种平行比较对于其他细胞死亡模式也很有价值。因此,仍不清楚Glu 毒性在多大程度上涉及氧化性死亡、铁死亡和/或其他死亡机制。
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传染性疾病
铁死亡与细胞对感染因子的反应有关。许多病毒能够影响宿主铁的代谢和转运、活性氧的产生和抗氧化防御系统。丙型肝炎是肝病的主要原因,丙型肝炎病毒复制受到宿主细胞中铁死亡的激活的限制,特别是在脂肪酸去饱和酶 2 (FADS2) 的控制下的铁死亡。FADS2 参与亚油酸 (18∶2) 、α-亚麻酸 (18∶3) 、AA (20∶4) 和二十二碳六烯酸 (22∶6)等不饱和脂肪酸的合成。这些去饱和程度更高的多不饱和脂肪酸通过其对过氧化反应的敏感性促进细胞的铁死亡。使用 RNAi敲除 FADS2 可增强丙型肝炎病毒 (HCV) 的复制,这与抑制铁死亡有利于 HCV 复制的结论一致。因此,在 HCV 感染的情况下,铁死亡能够抑制病毒复制。
严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARSCoV-2) 可能在感染期间激活铁死亡。COVID-19 患者的血清铁蛋白水平较高,表明器官组织暴露于一个更高水平的铁环境中。叙利亚金仓鼠感染 SARS-CoV-2 会出现和人类相似的 COVID-19 的病征,例如急性肺损伤、炎症和低氧血症。在对该模型的研究中发现了铁死亡典型的脂质变化,以及铁死亡标志物 TfR1 的表达。然而在这个仓鼠模型中,还不清楚铁死亡是像 HCV 模型那样有助于限制感染,还是导致炎症,抑或是不导致显著后果的感染后副产物(图 3)。
斑马鱼中的海分枝杆菌感染受到血红素加氧酶 1 (HMOX1,该酶可调节血红素和铁的可用性) 的抑制,这一现象可通过施加铁死亡抑制剂ferrostatin-1逆转,这表明铁死亡促进了感染。与此一致的,被结核分枝杆菌 (Mtb) 感染的巨噬细胞会诱导铁死亡;同时,在小鼠中抑制铁死亡,Mtb 的感染会受到限制。因此,铁死亡促进了 Mtb 的感染(图 3)。
铜绿假单胞菌是常见于住院患者和囊性纤维化患者的感染菌。铜绿假单胞菌通过分泌脂氧合酶 (pLoxA) 诱导宿主肺组织细胞的铁死亡,这与较差的临床转归相关。与 Mtb 的情况一样,铁死亡也会增强铜绿假单胞菌的感染(图 3)。
铁死亡诱导剂也可能适用于一些感染的协同治疗。例如,锥虫对由 GPX4 同源的锥虫还原蛋白丢失引起的铁死亡敏感。如果可以找到与宿主的 GPX4 相比足够的治疗空窗剂量,则锥虫还原蛋白抑制剂可能对治疗锥虫感染有效(图 3)。
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自身免疫病
研究人员已经在自身免疫性疾病模型中检测到铁死亡的激活。系统性红斑狼疮 (SLE) 是一种自身免疫性疾病,在研究中发现与铁死亡在中性粒细胞中的激活有关。SLE 患者的中性粒细胞计数较低,是因为SLE 患者的血清能够通过由 CaMKIV-CREMa 介导的 GPX4 下调,诱发铁死亡,以此促进中性粒细胞的死亡。此外,特异性敲除中性粒细胞 GPX4 的小鼠具有 SLE 的特征。因此,中性粒细胞中铁死亡的激活可能通过释放自身抗原的形式,促进了自身免疫性疾病的发展。同样地,由 15-脂氧合酶驱动的人气道上皮细胞中的铁死亡与线粒体 DNA 的释放和随之而来的哮喘恶化有关。哮喘涉及免疫反应的过度激活,这可能由释放免疫原性线粒体 DNA 的气道上皮细胞中的铁死亡所触发或恶化。当铁死亡发生在中性粒细胞或气道上皮细胞中时,会导致免疫过度的激活,并进一步发展成自身免疫性疾病(图 3)。
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肿瘤发生
铁死亡作为一种肿瘤抑制机制发挥作用,因此铁死亡的丧失可以驱动肿瘤的发生。最近的研究发现,硒蛋白是癌症风险的预测因子,同时硒的丰度在肿瘤组织中升高,这表明 GPX4 的丰度和活性与肿瘤发生的相关性。因此,在某些情况下,使铁死亡更难被激活的遗传和环境因素可能会驱动肿瘤发生。
最后,淋巴环境可以保护侵袭性黑色素瘤细胞逃避铁死亡,从而增加肿瘤细胞的转移扩散。直接通过血道转移的肿瘤细胞会发生铁死亡,但由于淋巴环境内的高水平油酸(以及其他MUFA)水平的特性,通过淋巴系统的转移可以保护转移性肿瘤细胞逃避铁死亡。
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对环境热应激的反应
随着持续的气候变化推动全球气温升高,热应激可能成为一个越来越普遍的农业问题。热应激已被证明会在许多生物体中诱导铁死亡,包括植物拟南芥和光合蓝细菌 Synechocystis sp。
铁死亡的治疗应用
鉴于近来大量的研究表明上述多种疾病与铁死亡有关,因此有机会通过调控铁死亡来治疗这些疾病。除了开发可以有效的通过特定机制选择性调节铁死亡的化合物和生物制剂外,扩展可靠的用于检测铁死亡和其他细胞死亡方式的工具也很重要。目前,检测脂质过氧化的丰度是识别铁死亡进展一种方法(图 5);检测脂质过氧化的方法包括使用硫代巴比妥酸反应物质 (TBARS) 测定法、通过 LC-MS/MS 直接检测异前列腺素或脂质过氧化产物、C11-BODIPY 荧光探针检测脂质氧化物水平、以及通过抗体检测脂质过氧化的产物或产物的加合物,例如抗 HNE FerAb 抗体、HNEJ-1 抗体和抗丙二醛 (MDA) 加合物 1F83 抗体。
我的实验室最近的研究报告,Tf 受体 TfR1 的丰度及其膜定位增加可以作为铁死亡的标志物,可以用新发现的 3F3-FMA 抗体以及其他抗 TfR1 抗体来检测。然后,我们发现 TfR1 染色结果可以与机器学习相结合,以区分经历铁死亡的细胞和经历凋亡的细胞。CHAC1、PTGS2、SLC7A11 和ACSL4 等几个基因在铁死亡发生的过程中上调,而RGS4在铁死亡过程中被下调;这些基因的表达改变可以通过 qPCR 检测并作为铁死亡的指标(图 5)。
尽管这些标志物将铁死亡与细胞凋亡和程序性坏死区分开来,某些应激条件仍可以激活其中一些标志物而不激活铁死亡(图 5)。因此,检测多个标志物对于明确识别铁死亡很重要——而脂质过氧化和 TfR1 动员的标志物是检测铁死亡的潜在手段,这同时还能排除其他的应激条件。尽管如此,伴随着学界对铁死亡及其与相关生物过程关系的理解加深,检测铁死亡的明确标准仍在不断发展。
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铁死亡诱导剂
作为一种细胞死亡方式,铁死亡可以潜在地用于消除存在问题的细胞类型,例如癌细胞、炎症细胞或活化的成纤维细胞。确定适合诱导铁死亡的细胞类型以及每种特定的诱导机制是否也会诱导其他类型细胞铁死亡是至关重要的。
已经确定了四种诱导铁死亡的机制:(1) 抑制系统 xc-(I型FIN),(2) 抑制/降解/失活 GPX4(II型FIN),(3) 消耗还原型辅酶 Q10(III型FIN),和 (4) 通过过氧化物、铁或多不饱和脂肪酸过载的方式诱导脂质过氧化(IV型FIN)。
几条证据表明抑制系统 xc是诱导铁死亡的有效机制——这种逆向转运蛋白有着多种结构不同的小分子抑制剂,如erastin、柳氮磺胺吡啶和 Glu,它们通过抑制系统 xc- 并因此诱导铁死亡(图 2);此外,系统 xc的底物胞外胱氨酸的耗竭也能够直接导致铁死亡。类似地,GPX4 的基因失活或小分子介导的抑制或降解会在许多细胞类型中诱导铁死亡。通过甲羟戊酸途径抑制 CoQ10 的生物合成或使 CoQ10 的还原酶(如 AIFM2/FSP1 或 DHODH)失活,能够在不存在 GPX4 的环境中诱导铁死亡。最后,用过量的铁、PUFA 或过氧化物(如 tBOOH 或 FINO2)处理会诱导细胞的铁死亡。与其他细胞死亡机制相比,所有这四种机制对于铁死亡的诱导都具有相当的特异性,因为它们的致死作用大部分或完全被铁死亡特异性抑制剂抑制,同时其他细胞死亡类型的标志物没有被激活。
在许多情况下,铁死亡诱导剂可能是有益的,例如传染病和纤维化。而铁死亡诱导剂研究最多的应用是消除各种类型的癌细胞。铁死亡诱导剂,例如 GPX4 抑制剂和系统 xc- 抑制剂,已显示出临床应用前景。例如,在治疗特定的肿瘤类型方面:弥漫性大 B 细胞淋巴瘤的异种移植瘤对系统 xc- 抑制剂咪唑酮埃拉汀 (IKE) 的治疗很敏感 ,同时它上调了异种移植肿瘤中的铁死亡标志物。在小鼠遗传型胰腺癌模型中敲除 SLC7A11 提供了显著的预防益处,而不会诱导除铁死亡以外的其他类型细胞死亡的标志物产生。
除了 GPX4 和系统 xc- 之外,还有其他靶点可用于诱导肿瘤细胞中的铁死亡。胰腺癌细胞的铁死亡抗性还依赖于天冬氨酸氨基转氨酶 GOT1,而 GOT1 的敲低会使细胞对铁死亡敏感。此外,肺肿瘤的球状培养模型的生存依赖于 NRF2 对铁死亡的抑制。
除了在淋巴瘤和胰腺癌等特定肿瘤环境中的应用外,铁死亡诱导剂在放射治疗和免疫治疗方面同样有益。辐射可诱导癌细胞的铁死亡,而铁死亡的诱导剂可单独或与免疫疗法联合用作放射增敏剂。发生上皮-间质转化的侵袭性癌症更容易发生铁死亡,而对诱导细胞凋亡的化疗药物的抗性与对铁死亡敏感性的增加有关。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 B-raf (BRAF) 的扩增是其中一种将药物敏感性从 BRAF 转移到铁死亡的一种机制。
使用预测性生物标志物有助于确定特定环境的铁死亡诱导剂的有效性。据报道,许多生物标志物可用于筛选可能对铁死亡诱导的抗癌疗法产生最佳反应的患者,例如低水平的转硫代谢物、低水平的 NADPH, 对光动力诱导脂质过氧化的敏感性、PI3K/mTOR 通路活性缺失、Hippo/YAP 通路突变、PUFA 生物合成基因 ELOVL5 和 FADS1的表达水平、MDM2/MDMX 通路的扩增以及癌细胞的透明细胞形态。总之,研究人员正在探索铁死亡诱导剂消除特定细胞群(例如特定肿瘤类型)的能力,这同时需要进一步的临床前研究来验证这一概念。
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铁死亡的抑制剂
有几个关键的调控点可以有效和选择性地抑制铁死亡。铁死亡的过程是由特定脂质的过氧化驱动的,直接阻断这种过氧化过程是关键的调控点。通过补充硒上调 GPX4 丰度是干预铁死亡的间接手段。通过控制铁死亡脂质底物的生成以及ACSL4是另一种调控点;控制铁的可用性是第三种调控点。
在铁死亡被发现的早期,就已经发现了这种死亡方式的第一类抑制剂的几种潜在用途:发现 ferrostatin-1 和 liproxstatin 作为活性氧自由基的捕获剂来抑制脂质过氧化的传播并在以下模型中有效:Glu 毒性模型 、HD、室性早发性白质软化、肾损伤和肝损伤。
除了 ferrostatins 和 liproxstatins 之外,还发现了其他铁死亡抑制剂。据报道,降胆固醇药物普罗布考及其类似物可抑制铁死亡并在 Glu 毒性模型中发挥功效。值得注意的是,necrostatin-1 (nec-1) 是一种抑制坏死性凋亡的 RIPK1 抑制剂,在高浓度下具有能够抑制铁死亡的脱靶效应,因此必须谨慎使用。给予硒可抑制中风期间的铁死亡。此外,线粒体靶向氮氧化物 XJB-5-131 可抑制细胞凋亡和铁死亡,是创伤性脑损伤和 HD 模型的有效治疗方法。
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通过饮食控制铁死亡
许多研究表明,饮食因素可以促进或抑制铁死亡。例如,摄入过多的多不饱和脂肪酸会促进发生在秀丽隐杆线虫的铁死亡。而膳食维生素 E 可以缓解 GPX4 缺失带来的影响。如上所述,摄入硒和铁的水平也会影响对机体铁死亡的敏感性。这些发现表明,模式生物的饮食可能是影响铁死亡敏感性的重要变量,应谨慎控制。此外,有可能创造优化的饮食方案来控制动物和人类的铁死亡。
结论和未来方向
总结上述研究的意义,理解铁死亡的六个关键方面对于充分了解这种细胞死亡形式的调控机制有着重要意义(图 6)。第一,铁死亡并不是 ROS 普遍性生成的同义词;事实上,有可能在没有铁死亡的情况下产生 ROS,并且铁死亡通常涉及特定脂质的氧化,而不是 ROS 的普遍性积累。
第二,需要寻找在各种情况下促进铁死亡的特定脂质。显而易见的,被氧化的脂质具有不同的促进铁死亡的能力,而另一些脂质,如 MUFA,能够抑制铁死亡。
第三,铁还有除了诱导铁死亡之外的许多作用,因此铁的积累并不是铁死亡的同义词。此外,铁的氧化状态对其促进铁死亡的能力很重要——Fe(II) 促进铁死亡,而 Fe(III) 除了以活性形式存在于脂氧合酶的活性位点外,通常是惰性的并储存在铁蛋白中。因此,确定铁的氧化还原状态以及每种状态是否在特定情况下对铁死亡有特殊贡献是很重要的。
第四,铁死亡在多大程度上是一种坏死性死亡仍不确定;铁死亡与细胞凋亡、细胞焦亡、程序性坏死和不受调节的坏死明显不同。然而,铁死亡是否可以归类为坏死性死亡的一种,需要更好的定义坏死性死亡这一术语和明确其相关功能。
第五,铁死亡在不同情况下与炎症和/或免疫原性的关联程度仍不清楚。许多研究表明,铁死亡会导致炎症并具有免疫原性,但铁死亡在这方面的普遍性及其与细胞焦亡、坏死性凋亡或细胞凋亡在免疫相关作用方面的比较仍不明了。
最后的,新陈代谢、铁代谢的调控和 ROS 防御系统共同控制细胞对铁死亡的敏感性。因此,扰乱新陈代谢、铁的稳态和活性氧水平是调节细胞对铁死亡敏感性的关键手段。铁死亡领域正在迅速的加速发展,部分得益于代谢、铁代谢的调节和 ROS 生物学这三个领域的新见解、发现和方法的交叉融合的协同作用。这三个领域都可以深入了解铁死亡的不同方面——代谢解释了铁死亡的关键底物是如何产生和重塑的;铁的调节揭示了如何控制 Fe(II) 的可用性;而 ROS 生物学揭示了针对脂质过氧化的内源性防御如何发挥作用(图 6)。
图6:铁死亡的关键概念
尽管如此,我们对铁死亡的理解仍然不完整。至少有三个未解决的关键问题可能会在未来十年推动铁死亡的进展。
一、铁死亡的执行机制是什么?如上所述,铁死亡是由特定细胞器(例如 ER)中特定的含 PUFA 脂质的过氧化作用驱动的。这导致细胞死亡的方式、位置和时间本身是未知的。
二、确定铁死亡的不同触发因素将阐明这种细胞死亡形式在生理和病理水平发生的机制和背景。显而易见的,Glu、铁的过载、SLC7A11 的抑制、GPX4 的耗竭和 PUFA 的摄取可以作为铁死亡的触发因素。定义铁死亡的全部触发因素及其发生的环境将极大地丰富我们从生物学和医学角度对铁死亡的理解。
三、选择性调控铁死亡的机制和方法仍然难以捉摸。这种在特定组织、细胞和/或疾病环境中的选择性激活或抑制对将铁死亡的基础知识转化为治疗方法至关重要。例如,系统性地靶向 GPX4 可能会导致毒性,例如肾损伤和神经毒性,或其他器官损伤。然而,选择性靶向持久性肿瘤细胞的方法具有影响力,并可能提供一个治疗安全窗口。有多种方法,例如通过药物递送载体、优化其生物学分布和药代动力学、以及对靶点和机制的选择能够提高不同情况下对铁死亡的特异性调节。阐明这些机制和策略可能对于利用铁死亡的基础知识来获得治疗上的收益至关重要。这些悬而未决问题的解决不仅仅在能铁死亡领域,还能在日益多样化的生物学领域产生重要的新见解。
铁死亡十周年
END
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