【揭穿尹烨这类“水”博不难，无论他说多少，记住讨论的问题，在他说断言之后，要求他提供证据。这时，这类人如果不自曝其丑，就奇怪了】
据尹烨自己公开：“益生菌是华大集团旗下华大营养的主要业务之一”。
因为我在7月26号微信文章批评尹烨推销华大的益生菌是卖假药，28号他在微信公号贴出：“华大到底发表过多少篇菌群文章？”。

我29号傍晚才知道。看了一下，他用事实自证逻辑和科学都很差。让人给他的科研论文做科普，可能愿意的人不多。“指教”他如何回答科学问题，我可以试试。效果是不是对牛弹琴，大家可以拭目以待。
如果尹烨要证明他是卖真药，只需要一篇或两篇论文：他发现了什么细菌，这种细菌给人吃了有什么作用。
结果，尹烨啰啰嗦嗦写了一大堆，列了一堆论文，顾左右而言他，就是没一篇说他发现了什么细菌，对人有什么作用。
当然，实际可能不止他一人，而是一个团队在帮他。但是，水货就是水货，大水货加小水货等于水货（正如0后面加一百个0还是0）。
附件是我给北大本科生的讲课材料，免费让尹烨及其公关团队接受北大本科生的教育：有关生物钟的机理问题，1971年的一篇论文是突破，找到第一个生物钟的遗传突变，1984年两篇论文找到突变所在的基因，1994年一篇论文找到老鼠的第一个影响哺乳动物生物钟的突变，1997年一篇论文找到老鼠生物钟的第一个基因。虽然我的文章很长，但如果从头到尾读一遍，就知道诺奖应该在这五项工作中诞生。事实确实如此。
尹烨教育背景太差，糊弄百姓有本事，说清楚科学就不行了，说尹烨是“自带干粮的国际科学首席民工”，是不尊重民工。因为民工与撒谎无关。
尹烨称：“1999年以来，华大发表或联合发表SCI收录论文3,565篇（与菌群研究相关的有71篇）；其中在Cell/Nature/Science/NEJM期刊及其子刊上发表文章共计451篇（与菌群研究相关的为24篇）。（统计截至2022年4月）
此外，华大还申请了疾病相关微生物标记物、功能益生菌株等相关发明专利300余项，申请进入欧洲、日本、美国、中国香港、澳大利亚等多个国家和地区，已获批140余项。（统计截至2022年6月）”。
华大参与发表论文，是其长期以来作为“自带干粮的国际科研民工”的一个伎俩，花钱给（常常是外国）人打工，为了是给国内各级官员和不懂科学的民众吹牛：华大有科学家。其实研究的科学问题一般（不是百分之百）是其他科学家提出的。华大开机器、提供数据。华大自己的文章基本不解决科学问题、也不解决应用问题，以堆砌数据为己任。
目前华大的头面人物及其公众热衷的人物，无一真科学家，而是假扮科学家。让他们参加北京高中生物的遗传学考试，估计都不会及格。
华大头面人物中，可能有企业家（这一点待定，但现在不予以否认）。
尹烨就是扮演科学家而其实为自带干粮为外国打工的代表之一。

我的批评是：尹烨推销的益生菌对人没有益处。
（如果被证明有用、如果国家药监局批准，推销益生菌的任何企业就不会只是自己号称，而是拿出药监局批号、拿出严格试验的真实结果）。
尹烨28号推出的全部论文，没一篇说过他的益生菌是什么，没有一篇检验过他的益生菌是否有任何生物学作用，更不用说治疗作用。
尹烨在微信文章中自己介绍了一些论文的大概内容，也没有一篇是有关他推销的益生菌的生物学作用，更不用说治疗作用。
尹烨最后列出13篇他认为最得意的文章，也同样没一篇是研究所谓“益生菌"的生物学作用，更不用说治疗作用。
任何人只要用机器翻译这些论文的题目，就一目了然。不会英文的群众以后也要学会怎么不经常被蒙。
其实，尹烨列出的华大论文，就是典型的华大论文，从来不做生物学功能研究，很多是给其他科学家打工（提供测序数据），而从来不做试验、不研究有什么作用，所以无法建立测序数据与生物学功能的关系。

尹烨这篇微信文章与他平时的瞎说是一样的：说了很多，绕了很多圈，可以把不懂科学的群众搞糊涂。而任何一个合格的生物学大学本科生，都可以看穿其问题。
所以，不上课、用交易换到的博士论文，就是“水”。
这种“水”，害苦了尹烨，也害了华大。
而哥本哈根大学，也需要知羞耻。
附

发现生物钟的基因
研究生物学不仅需要重视思考概念，而且需要重视研究途径。
面临的生物学问题或过程，需要选择合适的方法或方法的组合，形成有效的途径，提出解决问题的方案，剖析生物学机理。生物学的研究方法有来自生物学本身（如遗传、生物检定），也有来自物理（如电生理、光学成像、磁学技术）、更多来自化学（如化学分析），还有计算和数学等等。
本章专注讨论遗传筛选为核心研究途径，同时讨论依据功能的分子生物学筛选。
筛选可以有多种，在不同水平（如系统、环路、细胞、分子）、或不同技术进行筛选。最基本的遗传筛选是通过基因突变，找到参与生物学过程的基因，根据基因产物作用的原理，结合人工操纵基因和操纵表达基因的细胞，推论生物学过程的分子和细胞机理。
14.1        行为研究的范式
行为是可以被其他动物和人类研究者所观察到的动物外在动作表现。
行为研究的范式在1960年以前比较简单，以描述现象为主，而机理研究不多。俄国科学家巴甫洛夫（Ivan Pavlov, 1849-1936）发现条件反射。例如：狗见到食物会分泌唾液，而铃声不会诱导狗分泌唾液，但在铃声与食物多次同时出现后，单独出现铃声也可诱导狗分泌唾液，说明声音刺激与食物刺激之间可以建立联系。巴甫洛夫称食物为无条件刺激，铃声为条件刺激，对条件刺激的反应为条件反射。这种简单的行为学实验是20世纪初行为研究的重要进展。
行为既与生理学和神经生物学相关，也是心理学的内容。行为主义开创者John B Watson（1878-1958）于1913年发表《行为学主义者宣言》，提出人和动物的行为由后天经历所塑造。他是美国心理学家和教育家杜威的研究生，后任教于霍普金斯大学。1920年他和助手11个月的男孩Albert做实验，试图说明只需后天就能刺激建立恐惧的情绪反应。Albert本不怕的有毛的动物如大鼠、兔、狗，但听见铁棒噪音会哭。如果在Albert摸到大鼠时让他同时听到铁棒噪音，经过几次训练，Albert不敢摸鼠、甚至哭，而且也怕其他有毛动物（兔、狗） (Watson and Rayner, 1920)。
美国心理学家B. F. Skinner（1904-1990）推广行为主义。他设计了一种新的实验：操作性条件反射。巴甫洛夫的条件反射只看动物的被动的生理反应（分泌唾液）、不看其主动行为（动作）。Skinner用鸽子做实验，在鸽笼装两个钮，鸽子碰一个钮会得到吃的奖赏，触另一钮无奖。一段时间后，鸽子会经常去碰有奖钮，这种条件反射为操作性条件反射，迄今仍为研究学习记忆的重要模型之一。
奥地利的Konrad Lorenz （1903-1989）和Karl von Frisch（1886-1982）、荷兰的Nikolaas Tinbergen（1907-1988）研究动物行为。von Frisch研究蜜蜂的行为有多个发现，如蜜蜂有识别偏振光的能力。更为一般所知的发现是蜜蜂舞蹈：蜜蜂发现食物后，飞回蜂巢通过舞蹈的模式告诉其他蜜蜂食物的远近和角度、食物的多少。Tinbergen和Lorenz研究动物的本能行为。本能的行为是天生行为。本能并不一定是幼年表现，比如生殖行为无需教导、也无需观察而在一定年龄后才表现。Tinbergen和Lorenz发现动物的刻板动作，如在交配后，公鹅有一套特定动作；而有些特征可刺激鱼视之为敌而攻击。Lorenz还发现行为的印迹（imprinting）。他用灰腿鹅做实验，出生最初期小鹅看见什么动就跟着什么，如果小鹅见到的移动物体只是Lorenz本人，那么以后这些鹅视Lorenz为母亲，他走到哪里，它们跟到哪里，甚至长大后碰见真鹅，它们犹豫再三还是跟着Lorenz本人。印迹只能在特定时期产生，称为临界期。1951年Tinbergen总结研究行为的四个方面，两个为近端原因（proximate causes）：发育（行为如何在个体发育过程中形成），机理（个体行为的原理）。两个终极原因（ultimate causes）：进化，和功能（如打架是为了抢食物、或争配偶）。迄今为止，大多数行为的研究在四个方面都不是很深入。甚至还有停留在描述的程度行为研究。如2009年von Bayern等的论文，描述乌鸦如何被迫用小石头帮助自己获得嘴够不着的食物。
14.2        生物钟
生物钟的研究属于行为研究的范畴。通过观察行为是了解生物钟现象的途径，也是检测生物钟的简便方法。
生物钟是生物节律的俗称，人们熟知多种：动物的昼行夜伏、植物的春华秋实…。常见的近24小时昼夜节律(circadian rhythm)是典型的生物钟之一。生物钟的现象看似简单，其实不尽然。例如：每天早上并非太阳出来在先、向日葵指向东方在后，而是相反。而理解生物钟的本质就更不容易。
生物节律与其他节律一样，有振荡的幅度、周期、相位。节律是生物钟的外在表现，生物钟是内在的定时机理。生物钟本身是自我维持的生理和行为节律发生器（pacemaker），可以受外界环境因素（zeitgebers）所影响、可以同步化。
生物有多种节律，不同的生物有着不同的节律，同一生物也有多种节律。有些动物每年一个周期的冬眠、有些植物每年一个周期的长叶落叶，动物还有更快的周期如呼吸和心跳…，而人们熟知的节律是昼夜节律。不仅大家熟悉的睡眠有昼夜节律，一些其他行为和有些生理指标也有昼夜节律。
公元四世纪，Androsthenes知道罗望子树树叶的运动有昼夜差别(McClung, 2006)。意大利的Santorio Santorio（1561-1636）前后30年记录自己从早到晚的摄食量、排泄量和体重变化，发现有昼夜规律。但他们未能区分外界影响的节律与生物自主的节律。1729年，法国天文学家Jacques Ortous de Mairan（1678-1771）用含羞草做材料，观察其叶片和花的变化。含羞草放置在全暗处一段时间，叶片仍然有张有合，不依赖阳光，但他当时没敢提出植物的昼夜节律是内在的（de Mairan，1729；Szymanski，1918）。达尔文也研究过植物的节律，并提出昼夜节律的可遗传性（Darwin and Darwin，1880）。现在通过红外照相机可以看到年轻的向日葵朝向东方早于日出，所以也有内在节律所驱动的环节，虽然白天向日葵还有趋光性的环节（Atamian et al., 2016）。昼夜节律并不依赖于地球自转：放到太空，节律照常（Sulzman et al., 1984）。
Aschoff和Wever (1976)总结人的昼夜节律，德国大学生待在二战留下的堡垒中，灯光恒定、食物恒定、温度恒定、声音控制。在外界环境线索缺乏的情况下，人们仍然保持昼夜节律，只是在十几天后相位滞后。
现在知道，从简单的单细胞细菌蓝绿藻到多细胞的人，很多生物有节律。昼夜节律周期接近24小时（常见22至25小时）。节律的相位由最后一次环境线索（如光、或温度等）所确定。在缺乏环境线索时可以继续维持，在环境噪音中，节律也照常运行。在一定范围内，节律周期并不随温度的改变而剧烈改变，有温度补偿机制，这不同于一般生化反应：如温度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。
地球上生物生长的能量来自太阳，太阳的光照过强也会对生物的大分子造成破坏，因此地球上的生物有要应对阳光强度周期性变化的要求。
蓝绿藻有昼夜节律，把生物钟正常的与周期异常的蓝绿藻在一起长期培养，发现最后生物钟正常的细菌占了绝大多数，由此可见生物钟对生物体有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。
通过研究正常拟南芥及周期缩短或延长的拟南芥突变种，发现从固碳量、生长、存活来看，周期与环境设定昼夜周期相吻合的拟南芥最适合，即：短周期突变株在20小时昼夜环境下生活得更好；而长周期突变株在28小时的模拟环境下更好（Dodd et al., 2005）。这些观察，反应了只有当内外源周期保持一致时才最有利于植物生长。
观察到周期正常有利于植物，不等于能够解释为什么，所以我们仍然是知其然、不知其所以然。
14.3 生物钟研究的新人和新途径
怎么研究生物钟？
能看到动物、植物的变化，是外在表现，可以看到钟的长针、短针运动的轨迹，不等于理解了指挥它们运动的机械装置。而生物钟的核心在于振荡发生器。
早期科学家用电生理研究生物钟，用电极记录细胞电活动，曾观察到哺乳类脑内特定部位视交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的电活动有昼夜周期。在鸟类发现松果体很重要（Gaston and Menaker，1968；Zimmerman and Menaker，1979）。一系列研究表明SCN为哺乳类动物的主钟（master clock）、松果体为鸟类的主钟。损毁主钟导致动物失去昼夜节律（Moore and Eichler，1972；Stephan and Zucker，1972）；将主钟加回损毁后的动物可恢复昼夜节律（Lehman et al., 1987）；在捣毁后，移植其他动物的主钟，新节律与移植物来源的动物节律一样，例如，如果移植物来自周期22小时的动物，那么接受移植的动物周期也是22小时，而如果移植物来自周期20小时的动物，接受移植的动物也获得20小时的周期（Ralph et al., 1990）。
遗传学从孟德尔经摩尔根到1960年代初主要研究遗传的原理，揭示个体和群体的遗传规律。而1960年代末开始，遗传学作为重要的工具，成为研究生物现象的途径。通过突变观察到基因异常导致的表型，推论基因正常的功能，了解生物学机理。将遗传学作为研究途径的早期代表为美国生物学家Leland Hartwell（1939-），他率先筛选酵母细胞分裂的遗传突变，推论参与细胞分裂的基因，推动理解细胞周期的分子机理，也有助于理解癌症。通过异常现象了解正常规律，通过个别例外发现普适原理，是遗传学作为研究途径的特征。用遗传筛选研究生物现象，所谓正向遗传学，随机筛选影响特定生物现象的突变，无需假设机理。这是遗传筛选的优点，但当时倾向于认为遗传筛选有很大的缺点：很多行为恐怕不是单个或几个基因所决定的，复杂的行为需要有很多基因参与，用遗传筛选对单个和少数基因参与的过程有效，对更多基因参与的行为可能效果很差。影响行为的基因也可能影响其他生理过程，从而难以区分是否参与特定行为的基因。有些看起来影响行为的基因，其作用可能很间接，如先影响发育后导致行为变化。即使在已经多次证明遗传筛选很有效的今天，对于特定筛选的怀疑仍然存在。
纽约出生的波兰犹太移民后裔本哲（Seymour Benzer，1921-2007）在大学年物理专业，1945年至1953年任教于普度大学物理系，先研究过当时的热门：锗（Benzer, 1946）。1948年他开始通过参加暑期课程、访问实验室来学习生物。1953年转到生物系任教，在分子生物学有两个很重要的工作：他证明遗传突变就是DNA碱基序列的变化（Benzer, 1955）；他提出基因的顺反子定义（Benzer, 1959）。1960年代，几位分子生物学的开创者一道转行研究神经生物学。他们包括英国科学家、DNA双螺旋共同发现者Francis Crick（1916-2004），南非出生的犹太裔英国科学家、mRNA发现者Sydney Brenner（1927-），和本哲等。他们认为，分子生物学的重要问题已解决、框架已建立，只有细节给后辈，而他们应该找下一个重要的领域。他们都选了神经生物学：Crick决定研究意识；Brenner决定需要新的模式生物研究神经生物学，他挑选了秀丽线虫，开发了线虫的遗传学，带出一批学生用线虫研究了发育生物学和神经生物学，于2002年因为研究线虫获奖。本哲学习神经生物学后，决定用果蝇研究行为。1967年，本哲转到加州理工学院，并开始发表果蝇行为的遗传学研究论文（Benzer，1967）。
本哲自1967年至2007年一直研究果蝇的行为。研究神经生物学的初期，不仅同事笑他（研究脑袋愚蠢的果蝇，是不是研究者脑袋有毛病），Jerry Hirsch （1922-2008）曾认为不能用单基因解释、也就难以通过遗传筛选的方法研究果蝇行为，只能同时改变很多基因进行代间选择来推断。而本哲认为果蝇的行为可以用突变单个基因的前馈遗传学来进行研究。1970年代，他们曾发生激烈争论，Hirsch甚至给本哲所在加州理工学院的每一个教授写信称本哲的研究是伪科学。“聪明”的、想成功的人很多并不乐意做本哲的学生。早期他们的学生要么不求功利、要么不懂生物、要么……。其后四十年的实践证明，本哲和他的学生们研究的很多方面都领先世界，包括学习记忆、性行为、离子通道、眼发育、人类神经退行性疾病的果蝇模型等。
14.4        偷懒是创新之母
1971年和1972年出现三篇用遗传学研究生物钟的文章：影响果蝇生物钟的基因突变（Konopka and Benzer，1971）、影响真菌（红色面包霉）生物钟的基因突变（Feldman and Wasar，1971）、影响绿藻生物钟的基因突变（Bruce，1972）。
早在1935年就知道果蝇有生物节律（Kalmus，1935）。因为果蝇的研究者多，其研究工具多于真菌和绿藻，加上研究果蝇生物钟的科学家前赴后继，最终研究果蝇对生物钟的理解起到的推动作用最大。在本哲用遗传研究行为的总体框架中，具体提出用果蝇筛选生物钟基因突变的是研究生Ronald Konopka（1947-2015）（Rosbash，2015）。
遗传筛选的实验设计是：建立检测表型的方法，用致变剂诱导特定生物的不同基因发生突变，检测不同突变种的表型。具体到果蝇的生物钟，就应该是建立检测生物钟的方法，用化学诱变剂诱导不同基因突变，然后一只一只检测果蝇，以便发现改变了昼夜节律的突变种。
1970年代初无人知道果蝇有约两万个基因，化学分子诱发随机突变，只做两万只果蝇不够，其中部分突变在相同基因，所以应该加几倍到几百倍，才可能大部分基因都突变过一次。因行为有漂移，一个基因的突变种，不能仅检测一只果蝇，应该检测几只到几十只。果蝇是二倍体，每个基因有两套，一套坏了可以被另一个等位基因所代偿，所以最好不要做子一代（F1）的筛选，而最好是F2代，传代后再筛选，而F2代只有四分之一是同一基因突变的纯合子那么需要筛选的数量应一两百万，才能保证对果蝇所有基因进行了一遍筛选（所谓全基因组筛选）。
检测果蝇昼夜节律的标准方法，是将单只果蝇放到透明的管中，管子只容一只果蝇来回走动。一束光射过小管的中央，凡是果蝇走过管中央，计算机就记录果蝇运动了一次。以此检测果蝇活动的变化，发现确实有昼夜规律。但如果需要筛选检测很多果蝇，工作量就比较大。
Konopka和Benzer用了两个偷工减料方法来加快速度。其一是他们决定不筛选昼夜节律，而筛另一节律：果蝇羽化。果蝇受精卵成为胚胎，发育成为幼虫，三次蜕皮后成为蛹，蛹经羽化成为成虫。
昼夜活动节律是果蝇成虫每天经历一次、几十天周而复始的循环。而果蝇一生仅羽化一次。正常果蝇羽化一般在黎明前，最迟也在上午。上世纪三十年代至五十年代的研究明确提出羽化为独立于温度的生物钟所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物钟与成虫每天活动的生物钟是否有关，当时并不清楚。
Konopka觉得羽化作为筛选方法很容易操作。用单只果蝇做经典的昼夜活动规律检测比较慢。如果用羽化作为筛选方法，就很便当：化学诱变处理得到各种突变的果蝇后，Konopka每天上午不来上班，午后到实验室把所有羽化的果蝇倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影响节律的突变种，因为它们的羽化时间不同于“正常”（野生型）果蝇。这样的方法大大简化了检测、加速了筛选。
Konopka和Benzer偷懒的另外一个方面是遗传学捷径。他们用了附着X染色体。附着X是果蝇的一种突变。其发现者是摩尔根的妻子Lilian Morgan。她本是独立的科学家，但与摩尔根结婚后暂停工作十几年，生儿育女后重返实验室。她五十多岁独立发现含附着X的果蝇（Morgan，1922）。这一突变对果蝇研究很有用处：化学诱变雄性果蝇，使其X染色体突变，然后与附着X的雌性果蝇交配，获得的F1存活的后代中，所有雄性都携带来自F0雄性的突变、而且只要F0有表型就必定F1也有表型，F1代所有雌性都不含突变。这样，只要挑雄果蝇就可以，而雌雄很容易从外表区分，只要获得生物钟突变之后，以后无需每一代检测生物钟来追寻、保持突变种。
如果不用附着X的雌性，在F1代的雄性有三分之二果蝇不含突变，F1的雌性含F0的突变、但若是隐形突变就不会有表型。那么每一代需要通过检测生物钟来鉴定生物钟的突变，保持生物钟的突变，需要的工作量就大很多。如果不研究X染色体，而研究其他染色体的突变，工作量就更大。
Konopka和Benzer用了附着X，交配和筛选简单，加快了筛选速度。做先驱是有好处的：可以选的路径和方法有自由度，先选容易的。容易的方法如果被穷尽了，后面的人只好用麻烦的方法。先驱的危险是定错了方向、选错了课题。
偷懒，依赖人脑想办法的偷懒，（有时）是创新之母。
14.5 生物钟研究的突破
对一个研究生来说，用如此简单的方法，可以筛选几万只、几十万只、几百万只果蝇。但Konopka只筛选了不到两百种品系的果蝇就得到第一个失去周期突变品系，继续筛选约一千九百种品系的果蝇再得到两个突变品系（分别是周期缩短和周期延长）。
用羽化筛到突变品系后，更重要的是用检测个体运动的方法看昼夜活动是否变化，结果发现确实突变果蝇运动的昼夜节律也有异常。有趣的是，他们发现的三种品系的突变果蝇在表型上并不相同：一种是无节律，一种节律缩短到19小时，一种节律变慢到28小时。他们交配突变果蝇以确立三种突变在染色体图谱的大概位置，结果发现很近，他们进一步进行本哲发明的顺反检测，试图确立它们是否同一基因，他们根据得到的结果推测三种突变可能是同一个基因的不同突变。他们把这个基因命名为Period（Per），无节律的为Per0（per zero）、短节律的为Pers（per short）、长节律的为Perl（per long）。这里需要说明，他们进行的顺反检测并不严格，只做了反位（trans）的检测没做顺位（cis）的检测，所以只从1971年的文章不能完全断定三个突变是否同一基因，虽然支持这一可能。
他们筛选的果蝇数量不多，却得到了一个基因的三种不同方向的突变，因此特别有运气。
各种筛选和检测生物钟的方法，都有可能在一些非生物钟关键的基因导致的突变而有所影响。同一个基因可以出现三个方向的突变，不仅是运气，而且对于这个基因的功能也提供了很好的支持：很难设想不参与驱动生物钟的基因可以导致三个不同方向的突变表型。如果三个突变确为一个基因的三种突变，那么Per基因很可能是生物钟的关键基因之一。
德国物理学家转美国生物学家的Max Delbrück（1906-1981）是本哲在加州理工学院的同事。本哲于1940年代末跟他学了生物、1969年因为开创噬菌体研究获诺奖。他不信Konopka和本哲找到了生物钟的基因：
Delbrück: “No, that’s impossible ”
Benzer: “But Max, he’s already done it!”
Delbrück: “No, that is impossible.”
14.6 克隆per基因：竞争的好处
1971年，因为技术缺乏，不可能得到per基因的DNA（“克隆基因”）。重组DNA技术于1973年才发明，而克隆果蝇DNA的技术还要等到1978年斯坦福大学的David Hogness（1925-2019）和加州理工学院的Tom Maniatis（1943）等人的工作推动下才能进行。等到所有技术都成熟以后才开始研究是明显的事情，但也很容易成为跟风；不等到技术成熟，就开始研究才是开拓。但这种领先有很大的风险，如果领先几十年，可能开拓者一生也看不到下一步，也就不很确定自己的开拓是有效，是否误导大家走进了死胡同。
1980年代是基因克隆的烽火连天时代。针对果蝇的per基因，两个团队竞争克隆：洛克菲勒大学的杨迈克（Michael Young，1949-）；Brandeis大学的霍尔（Jeffrey Hall，1945-）与罗斯巴希（Michael Rosbash，1944-）。杨迈克本科的时候跟德克萨斯大学的Burke Judd从事研究，Judd的兴趣是研究果蝇染色体上基因的分布，特别是研究了X染色体上一小段上有多少基因。杨迈克的研究生课题就继续研究X染色体的基因，他读到Konopka和Benzer的文章后，意识到Per基因应该就在他们研究的区段。杨迈克就要来Konopka的果蝇，通过实验证明自己不久前发现的一个突变T(1,4)JC43也是Per基因的突变，因为这一突变是染色体移位，以后将有助于在克隆DNA过程中定位Per基因的边界。他在做博士后期间跟斯坦福大学的David Hogness，学习克隆DNA技术。杨迈克到洛克菲勒任教后，试图克隆两个果蝇的基因：与耶鲁大学的希腊裔生物学家Spiros Artavanis-Tsakonas（1946-）竞争克隆Notch基因；Per基因。
霍尔跟本哲做博士后而研究果蝇，到Brandeis大学后继续研究果蝇，包括参与果蝇的性行为的fruitless基因。罗斯巴希多年用酵母研究mRNA剪接机理，实验室搬到霍尔同一大楼后，两实验室开始合作克隆Per基因。
1984年，杨迈克和霍尔—罗斯巴希两个团队都拿到Per基因附近的基因组DNA（Bargiello and Young，1984；Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984）。这段DNA产生两个不同长度的mRNA：分别为4.5kb（千碱基对）和0.9kb，而且对应两个基因。霍尔—罗斯巴希组观察到0.9kb之mRNA的含量有昼夜变化（Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984），认为相应的DNA为Per基因。杨迈克认为4.5kb对应Per基因。后来两个团队都确认4.5kb是Per基因（Bargiello et al., 1984； Hamblen et al., 1986; Lorenz et al., 1989）。将编码4.5kb mRNA的DNA转入果蝇，可以使Per突变种果蝇的昼夜节律恢复正常。改变导入的Per基因表达的相位可改变果蝇昼夜节律的相位（Edery et al., 1994）。
在两个团队的竞争过程中，一个团队出现错误（霍尔—罗斯巴希组最初错认了Per基因），被另一团队所纠正，是竞争对科学的好处。
两组科学家都确定了Per基因在最初三种影响生物钟突变株的DNA变化：Per0所含碱基变化导致蛋白质合成提前终止，Pers、Perl分别是两个不同部位的单碱基变化（Baylies et al., 1987; Yu et al., 1987a）。
霍尔—罗斯巴希组的俞强还发现，缺失Per蛋白质特定一段区域，昼夜活动节律不受影响，只影响求偶时果蝇翅膀有节律的歌唱（Yu et al., 1987b）。霍尔实验室在1980年发现果蝇求偶时的翅膀振荡有节律（Kyriacou and Hall，1980），不过其后有争议至今（Stern, 2014; Kyriacou et al., 2017; Stern et al., 2017）。
14.7 Per的功能：竞争的坏处
克隆到基因令人鼓舞。
但是，得到基因不一定就能懂得机理。例如，单纯测序人类基因组只是工具，而不是美国总统等政治人物与羞耻感较弱的科技工作者齐称测序人类基因组就揭示了人类奥秘，其实单纯测序不可能自动解开人类奥秘，所以今天对人类的奥秘还远不清楚。通过表型找到基因，是了解功能的重要一步，优于单纯测序。不过，拿到了Per基因的DNA，并不知道它所编码产生的蛋白质的功能，也不能立即推导出生物钟的机理。其实有些基因被发现很长时间后，人们都不能理解其机理。例如，患“莱－尼” （Lesch-Nyhan）综合征的病人是很特殊的疾病：病人自残。而其基因已知多年，它编码的HGPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）是核酸代谢的一个酶，但人类迄今并不理解为什么缺HGPRT的病人会自残。
两个组都看到Per蛋白质有部分序列是重复的，杨迈克实验室还以为果蝇Per重复序列与小鼠的序列相似（Shin et al., 1985），后来发现并非如此。要推导出一个基因所编码蛋白质的功能，如果其预计的氨基酸序列与其他某种已知蛋白质有相似性，那么功能可能类似，从而提供研究的着力点。1986年，两个课题组都发表文章称Per蛋白质是蛋白多糖（Jackson et al., 1986; Reddy et al., 1986）。这次两个课题组都错了，竞争的课题组对成一样是合理的，而错成一样是咄咄怪事。
 1987年，杨迈克课题组与爱因斯坦医学院的David Spray实验室合作发表文章（Bargiello et al., 1987），称Per影响了细胞间交流（提示Per可能起缝隙连接相关的功能，比如缝隙蛋白），这一结果很可能是从猜测Per是蛋白多糖——可能是膜蛋白——也就有可能是缝隙蛋白而推论。但是，Per突变影响缝隙连接的结果不能重复，1992年杨迈克和Spray发表道歉、收回1987年的文章(Saez et al., 1992)。霍尔—罗斯巴希组于1993年也发表文章认为Per不参与细胞间连接（Flint et al., 1993）。
从1984至1987，在激烈竞争的过程中，两个课题组都错了两次：各自分别错了一次，同时错了一次。
14.8        Per mRNA的研究：仔细不是坏事
克隆了基因，研究很自然的下一步包括检测基因表达。
检测基因表达可以通过检测mRNA的表达或蛋白质。一般来说，一个动物的绝大多数细胞含同样的DNA，而含有不同的mRNA和蛋白质。霍尔—罗斯巴希组、杨迈克组都检测Per mRNA和Per蛋白质表达在什么时间和空间（James et al., 1986；Saez and Young, 1988；Liu et al., 1988；Siwicki et al., 1988；Zerr et al., 1990；Liu et al., 1992），其中检测蛋白质需要费了很大的劲制造识别Per蛋白质的抗体。他们发现Per蛋白质既可以存在于细胞核、也可以存在于细胞质（Saez and Young，1988；Siwicki et al., 1988；Liu et al., 1992）。
既然Per基因参与昼夜节律，那么其mRNA或蛋白质是否也有昼夜周期？不难检测mRNA含量，但最初未观察到Per mRNA的昼夜变化。1990年，从果蝇头部提取RNA，发现了Per mRNA有昼夜周期性变化。此前没有观察到变化的一种可能是做实验的人技术不好、或不仔细，另一可能是细节：传说最初在全身检测PermRNA，有可能身体其他部分（如腹部）所含RNA量大而不变掩盖了头部mRNA随昼夜周期的变化。为什么需要专门研究头部的Per?这与昼夜节律的关键部分存在于身体什么部位有关。在得到Per基因突变后，曾有实验在不同突变型的果蝇之间进行局部区域组织细胞的移植，以确定哪个部位起决定性作用：从pers果蝇取得脑组织，移植到per0果蝇腹腔中，发现per0变成了pers，显示脑是确定节律的部位（Handler and Konopka，1979）。1983年，离开加州理工学院在Clarkson大学的Konopka等再用遗传嵌合体（genetic mosaics）做实验：让果蝇部分区域的细胞含突变的per（如pers），而其余部分仍然正常，结果发现如果脑含pers，果蝇的生物钟就变短（Konopka et al., 1980）。所以，移植实验和嵌合体实验皆支持Per基因在脑中控制全身的昼夜节律。
1990年，霍尔—罗斯巴希组的博士后Paul Hardin从果蝇头部取样，24小时中每个小时取一些果蝇的头制备mRNA，再检测Per mRNA，发现它呈昼夜变化（Hardin，Hall，Rosbash，1990）。
在pers中，Per mRNA昼夜周期也缩短。他们提出简单的模型：Per基因转录PermRNA、翻译产生Per蛋白质的过程存在负反馈，其mRNA或蛋白质产生后，可以影响Per基因自身的转录。他们当时不能排除Per调节昼夜节律这一行为之后，行为再通过更复杂的反馈作用于Per基因转录。这里需要用Occam剃刀原则，既首先用最简单的解释，最简单的不能解释才用更复杂的解释。这一简单解释提供了生物钟机制的理论突破，是迄今为止仍被公认的“转录-翻译负反馈环路（transcription-translation feedback loop, TTFL）”的基础。
不久，霍尔—罗斯巴希组又用抗体检测发现Per蛋白质的表达也有昼夜节律，这种节律的长短也被Per基因所调节，因为pers中，Per的蛋白质昼夜周期也缩短（Zerr et al., 1990）。mRNA的昼夜节律与蛋白质昼夜节律之间有一定的间隔，既相位不同。几年之后知道不仅Per蛋白质含量变化，而且其亚细胞定位变化：昼夜周期中，Per蛋白质进入细胞核的时间有昼夜周期变化（Curtin et al., 1995）。
14.9 基因转录调控
1990年，研究果蝇生物钟的Hardin等提出Per蛋白质可能调节基因转录，依据间接证据。如果这一假设正确，那么Per蛋白质就是基因的转录调节因子。而1980年代有很多转录因子的研究进展，为研究Per和生物钟的机理提供很好的借鉴。1991年和1992年，其他途径的研究发现促进对Per的理解。果蝇的single minded（sim）基因控制果蝇胚胎腹侧中线的神经细胞发育（Nambu et al., 1990）。研究环境致癌物二恶英(dioxin)的两个实验室发现编码其受体Ah R的基因（Hoffman et al., 1991；Burbach et al., 1992）。序列比对发现Per、Ah R和Sim三个蛋白质有相似的区域，称为PAS区域。
从AhR是转录因子可以提示Per和SIM也是转录调节因子，但Per与AhR的相似只在PAS区域而缺AhR所含专门结合DNA并调节基因转录的bHLH区域，所以Per是否调节基因转录并不确定，如果调节，并不清楚是如何调节。1993年，罗斯巴希实验室的黄佐实证明，PAS区域是蛋白质—蛋白质相互作用区域，一个蛋白质所含的PAS可以结合另一蛋白质的PAS区域（Huang et al.，1993）。
进一步研究提出，具有bHLH和PAS区域的蛋白质可能是转录激活因子，而只有PAS、缺bHLH的Per蛋白质不能激活转录但可能抑制转录（Lindebro et al.，1995）。Hardin自己独立实验室后，证明Per蛋白质调控Per基因转录，依赖于Per基因在蛋白质编码区域之上游（分子生物学称为5’端）的DNA序列（Hao et al., 1997）。以后有更多证据表明，Per参与调节多个基因的转录。
14.10 更多参与果蝇生物钟的基因
影响生物钟不可能只有一个基因。
1971年发现第一个影响果蝇生物钟的基因Per。1983年，Jackson发表了影响果蝇生物钟的其他基因（Jackson，1983），但无果而终。1990年，霍尔—罗斯巴希组发表“新”的果蝇昼夜节律基因“钟” （Clock）（Dushay et al., 1990），不过他们于1992年发现这不是新的基因而仅为Per基因的另一突变（Dushay et al., 1992），辛勤努力化为一江春水。
1991年Konopka 等发表第二个影响果蝇生物钟的新基因Andante（Konopka et al.，1991）。注意这一基因的人不多，到2003年它才被Tufts大学的Jackson实验室所克隆（Akten et al., 2003）。
1991年洛克菲勒大学杨迈克实验室的博士后Amita Sehgal等在会议上报道她们筛选影响果蝇生物钟的新基因（Sehgal et al., 1991）。
1994年，杨迈克实验室报道他们发现了Timeless基因（“无时间”，简称Tim）：Seghal等通过筛选七千多个位于第二号和第三号染色体的突变种，找到第三个影响果蝇生物钟的新基因（Seghal et al., 1994）。他们用了转座子插入诱导突变，以利克隆基因。她们用于检测生物钟的首先也是羽化时间，而后用活动的昼夜节律核实。杨迈克实验室很快克隆到Tim基因（Myers et al., 1995）。虽然预计的Tim蛋白质序列看不出它是怎么作用的蛋白质，但因为它可以结合Per，那么估计也是转录因子。
Sehgal等还发现Tim的RNA表达量也呈昼夜节律，Tim的突变也影响Per的RNA昼夜变化（Sehgal et al., 1995）。杨迈克实验室的研究生Leslie Vosshall发现Tim影响Per蛋白质出入细胞核（Vosshall et al., 1994）。Weitz实验室发现Tim蛋白质与Per蛋白质可以直接相互结合（Gekakis et al., 1995）。罗斯巴希实验室的研究生曾红葵发现Tim与Per两个蛋白质的相互作用有昼夜节律，而光可以调节Tim蛋白质的稳定性，从而提供了光对生物钟的调节的分子机理（Zeng et al., 1996）。
多种生物，从细菌、植物到包括人在内的动物，都有节律、有昼夜节律（Herzog，2007）。存在于多种生物的生物钟，是否用同样的分子？是否用同样的机理？红色面包霉的生物钟基因Frequency（frq，“频率” ）于1989年被克隆，当时以为它与Per有部分序列相似（McClung et al.，1989），后来发现不相似。控制有些细菌生物钟的基因也纷纷被克隆（如，Liu et al., 1995；Ishiura et al., 1998）。1995年，调节植物（如拟南芥）生物钟的基因突变被发现（Millar et al., 1995）。1998年，调节植物生物钟的基因被克隆（Wang and Tobin, 1998；Schaffer et al., 1998）。
那么：哺乳类的生物钟，用什么基因？
14.11 千呼万唤始出来：哺乳动物的生物钟基因
调节哺乳动物生物钟的第一个基因tau的突变种于1988年被偶然发现（Ralph and Menaker，1988），但克隆这一基因需要等到2000年（Lowrey et al., 2000），它编码一个蛋白激酶（CKIe）。
果蝇的Per基因在1984年被克隆后，长期有人（如麻省大学伍斯特校区的Steven Reppert）试图在高等动物中找到Per基因，但费九牛二虎之力而无果。曾找到了蚕的Per基因（Reppert et al., 1994），但它居然没有帮助找哺乳类的Per。一般来说，一个基因在低等动物中发现后，在高等动物中比较容易找到，有多种方法可以通过DNA序列相似性找到。找不到有几种可能：Per在高等动物不存在，例如果蝇可能与高等动物的生物钟不同，也可以是果蝇和高等动物生物钟大体类似但其中有分子不同（如果蝇用Per但高等动物不用）；另一可能是研究者技术上的问题，在高等动物存在Per，但未被找到。从1984年到1997年都找不到哺乳动物的Per的情况下，人们担心哺乳类无Per基因，可能果蝇和高等动物有不同的生物钟。
时代呼唤英雄，找到哺乳类生物钟基因的英雄。在美国芝加哥北郊西北大学工作的日裔科学家高桥（Joseph S Takahashi,1951-）决定不再依赖容易的方法，而用老鼠做遗传筛选。
用老鼠做研究比果蝇要贵很多。如果通过筛选找基因，经费的问题使绝大多数人望而却步，所以很少科学家用老鼠进行随机基因突变后的筛选。为了在一定范围省时间和经费，高桥实验室不筛选纯合体突变种，而筛杂合体。不过筛杂合体虽省了工作量，但也降低了突变检出率。即使这样，筛一遍所有基因突变也需要超过十万只老鼠。有个笑话：做这种实验，需要在老鼠身上开销豪华旅馆的经费。1994年世界上没实验室敢做这类研究，担心用完了经费还找不到影响老鼠生物钟的基因。
高桥带领实验室决定筛选，这是发愤图强、还是铤而走险?
他们的勇气为运气所迎接。
他们到1994年共筛选了304只小鼠，第25只就是影响生物钟的突变体，他们将突变相应的基因命名为“钟” （Clock）（Vitaterna et al., 1994）。鼠生物钟的正常周期是23.7小时，Clock突变杂合鼠昼夜节律为24.8，需要灵敏和可靠的检测才能发现不大的变化。从杂合体检测出小的、但可靠的变化后，高桥实验室很容易通过交配小鼠而获得Clock基因突变的纯合体，再检测发现：完全丧失昼夜节律。1997年，高桥实验室发表两篇论文，报道他们克隆了小鼠Clock基因的DNA（King et al., 1997；Antoch et el., 1997）。
从基因序列可以推测Clock蛋白质不仅含蛋白质相互作用的PAS区域，且有直接结合DNA的bHLH区域（King et al., 1997），从而容易理解它如何调节基因转录。Clock基因本身也表达于SCN。
人、鸡、蛙、鱼、蜥蜴也有Clock基因（King et al., 1997），因此Clock是普适于生物钟的基因，很可能是生物钟的机理也是普适。
1997年，两个实验室找到老鼠和人的Per （Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美国华人科学家在研究其他问题的时候，发现一个基因与Per序列相似（Sun et al., 1997）。以前没找到的原因是哺乳类与果蝇的Per基因在整个基因的相似性不很高，而局部序列相似性高。用整体去找很难，而用局部片段的困难在于以前并不知道用哪段才好。
哺乳类有三个Per基因：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表达在SCN（Shearman et al., 1997），其表达随昼夜节律变化而变化，这一节律受Clock基因的调节(Jin et al., 1999)。
1998年，霍尔—罗斯巴希组通过遗传筛选，在果蝇找到Jrk基因，测序后显示它就是果蝇的Clock基因（Allada et al., 1998）。
Steve Kay实验室发现Clock蛋白可以激活带有Per基因启动子片段E-box驱动的荧光素报告基因的表达，这一激活能被Per自身所抑制，从而较好地实现负反馈环路的闭合（Darlington et al., 1998）。
首先在果蝇发现的Per基因终于在哺乳类找到了，而首先在老鼠发现的基因Clock也在果蝇中发现了，所以：从昆虫到哺乳类，生物钟的基因高度保守。基因水平的保守，提示机理的相似。
钻研果蝇生物钟的科学家们就不用再担心是自己怪癖，而确实是探讨和揭示动物普遍适用的机理。
14.12 遗传筛选对生物钟研究的重要性
在生物钟的基因研究过程中，果蝇一马当先，科学家从中发现了Per（Konopka and Benzer，1971）、Andante（Konopka et al.，1991）、Tim（Sehgal et al., 1991, 1994）。
用果蝇研究生物钟，在速度、价格、工作量上都优于哺乳类。用细菌、真菌、植物研究生物钟，也可以有这些优势，但（研究了以后才知道）它们的生物钟基因不同于动物的，研究它们不能揭示哺乳类的生物钟机理。
当然，在从各种生物得到答案之前，人们无法预料生物钟的机理保守的范围。但事后可以总结果蝇对于生物钟研究的重要性。并非所有低等生物的研究都适用于高等生物，有些相通、有些不同。例如：细胞周期的原理从酵母到人都保守，而性别决定的机理从果蝇到人类并不保守。虽然研究低等生物特有的生物学原理也有科学意义，但人偏于关注对高等生物适用的分子和规律。
在发现Per、Andante、Tim等基因之后，科学家们还多次用果蝇继续筛选影响生物钟的基因。霍尔实验室用荧光素接在Per基因位点，用酶活性间接报告Per的转录情况（Brandes et al., 1996；Stanewsky et al., 1997； Plautz et al., 1997）。他们筛选了5137株影响荧光素表达的果蝇突变种，发现chryptochrome（cry）基因参与果蝇生物钟（Stanewsky et al., 1998）。用果蝇的遗传研究发现Cry的作用在于介导外界的光调节身体内在的生物钟（Stanewsky et al., 1998）。生物钟在无外界环境影响的情况下，可以自行运转。在外界环境作用下，生物钟与外界相配合。虽然其他如声音、温度、进食也可影响生物钟，外界的光当然是调节生物钟的关键因素之一，Cry功能的发现解决了一个重要的问题。这里也可以看到，遗传筛选不仅为了找到基因，而且有时可能从基因编码的蛋白质推测出分子机理。Cry本身的mRNA表达也有昼夜节律，它也调节Per和Tim表达与光的关系（Emery et al., 1998；Stanewsky et al., 1998）。果蝇有4套染色体。罗斯巴希-霍尔合作筛选第三号染色体，用化学诱变得到遗传突变种，筛选了6千多种以后，发现Jrk基因（Allada et al., 1998）。他们发现的影响果蝇节律的Cycle基因，也有小鼠的类似基因Bmal（Rutila et al., 1998）。所以，通用多个基因证明从昆虫到哺乳类用同样的分子调节生物钟。杨迈克实验室在果蝇的第2和第3号染色体筛选了多于1万5千种突变，发现了他们命名为Doubletime的基因，而它编码了酪蛋白激酶e（CKIe）（Price et al., 1998）。它可以调节Per蛋白质的稳定性。高桥实验室于2000年克隆了金仓鼠的tau基因，发现原来也是CKIe（Lowrey et al., 2000）。开始研究蛋白激酶导致磷酸化、磷酸化调节蛋白质稳定性。到2001年，已知多个基因在果蝇和小鼠都调节生物钟：包括果蝇的一个Per和小鼠的三个Per基因、果蝇的一个Cry和小鼠的两个Cry、果蝇的Jrk和小鼠的Clock和Npas2、果蝇的Cycle和小鼠的Bmal1、果蝇的Doubletime和小鼠的CKId和CKIe基因（Reppert and Weaver, 2001）。
14.13 筛选生物钟相关基因的其他途径
在完全不理解分子机理的情况下，用遗传筛选生物钟相关的基因是很有效的方法，未尝不可称之为“盲筛”。盲筛的优点在于无需事先知道机理，而通过遗传得到突变、在通过克隆DNA得到序列、序列特征揭示所编码蛋白质、所编码蛋白质如果与现有蛋白质有序列相似性可以提示功能，有了功能很有可能再揭示机理。这是一些人所谓的“遗传学的令人敬畏的力量” （the awesome power of genetics）。这一途径被用于多个重要问题的研究，生物钟是早期的研究对象之一。
当然，遗传学并非唯一途径。早在1995年，哈佛医学院Weitz实验室的Gekakis等通过Per蛋白质寻找与Per直接相互作用的蛋白质，找到Tim蛋白质，发现Tim与Per两个蛋白质直接结合（Gekakis et al., 1995）。寻找相互作用的蛋白质，理论上可以用生物化学的途径，也可以用当时诞生不久的酵母双杂交（Y2H）方法，在酵母细胞中，构建分子探针，寻找文库中与之相互结合的蛋白质。Weitz用Y2H发现Tim与同期杨迈克实验室用果蝇遗传筛选发现Tim有异曲同工之妙。
因为Per（和Tim）的RNA有昼夜节律，提示也可以专门找其RNA有昼夜节律的基因，其中也会有参与生物钟的基因（例如：Abruzzi et al., 2017），而不都是生物钟的结果。后来知道蛋白激酶参与生物钟，也就可以专门找其磷酸化有昼夜变化的蛋白质，发现之后进行基因突变以检测是否参与生物钟。
当技术发展，如分子生物学的RNAi（RNA干扰）技术等之后，也自然可以用新技术研究老问题。2009年，美国圣地亚哥加州大学Steve Kay实验室的博士后张二荃用RNAi筛选生物钟的基因。他利用当时已知多种细胞有生物钟，而设计在体外培养的人类细胞用Per基因插入荧光素基因，通过荧光素基因的表达周期显示生物钟。在这样的细胞中，引入不同的RNAi，张二荃因此找到影响人类生物钟的基因（Zhang et al., 2009）。有了CRISPR-CAS9技术后，也可以用于生物钟研究。
从1971年的果蝇筛选到2009年人的筛选，研究的时间跨度很大，但基因并没有找全。果蝇的筛选就没有筛完，而是每次都有局限，哺乳动物的筛选更没有完。如果以后有更多、更好的途径和方法，包括已用过但未充分使用的方法，再发现影响生物钟的基因，不会令人惊讶。
14.14生物钟的分子和细胞机理
发现基因固然重要。但生物学基础研究的目的是阐明机理。
综合多年的研究结果，可以看到，Per调节基因转录，是分子机理的突破。简而言之，Clock和Cycle蛋白质组成复合体，直接刺激一些下游靶基因的转录，这些靶基因进一步控制生物钟。而Per和Tim蛋白复合体抑制Clock和Cycle的作用。Per基因和Tim基因本身还是Clock和Cycle的靶基因，从而组成转录负反馈环。Per蛋白质的稳定性被磷酸化所调节，也就被Doubletime或CK1和等蛋白激酶和去除磷酸化的蛋白磷酸酶所调节（Wijnen and Young，2006；Benito et al., 2007）。Per和Clock蛋白质可以被糖基化修饰，并因此被调节。Cry介导光调节Tim/Per的稳定性。在Clock/Cycle和Per/Tim参与的主要转录环之外，还有其他转录环，有其他基因如pdp1、vri、RORa和REV-ERBa参与转录调控。
Per和Tim蛋白质不仅有稳定性的问题，还有亚细胞定位问题：在细胞浆、还是细胞核。作为转录调节因子，它们只有在进入细胞核才能见到基因调节的机器，调节基因转录（Siepka et al., 2007；Dubowy and Sehgal，2017）。Per和Tim的mRNA在白天逐渐升高，到傍晚达最高峰。两个蛋白质的合成晚于其mRNA几小时后逐渐积累，先在细胞浆，午夜进入细胞核。Tim蛋白质既在细胞浆内稳定Per蛋白质，也促进Per进入细胞核（Meyer, Saez and Young，2006）。
有趣的是，虽然细菌、真菌、和植物分别由其他分子组成生物钟，其分子也是通过正反馈和负反馈来实现振荡。外界的光或其它因素通过一定方式影响它们的生物钟也用了转录调控、和磷酸化调节等（综述见Wijnen and Young，2006）。植物的生物钟也用了细胞浆和细胞质定位的调节（Wang and Tobin，1998；Mas，2008）。从细菌到人不同生物的生物钟虽然分子不同，但原理有共同性。
在细胞层面，动物体内绝大多数细胞（甚至所有细胞）都有生物钟（Emery et al., 1997；Giebultowicz and Hege，1997；Plautz et al., 1997）。果蝇的翅膀切下后依然可以观察到其中的生物钟影响(Plautz et al., 1997)，人的细胞体外培养也表现出代谢上的节律（Balsalobe et al., 1998）。
在果蝇脑内大约150个表达Per和Tim基因的神经细胞组成主钟。Konopka和Benzer在1971年的文章就指出，突变基因起作用的解剖部位很重要。也就是说如果能够找到这些细胞，就可能找到主生物钟。一般推测果蝇脑含约10万个神经细胞，而其中150个细胞是主生物钟，推测是依据Per和Tim的功能和基因表达部位（Konopka and Benzer,1971；Vosshall and Young, 1995；Kaneko，Helfrich-Forster, Hall，1997；Panda，Hogenesch and Kay，2002；Helfrich-Forster, 2005）。它们包括：背侧的神经元DN1、DN2、DN3，侧后神经元LPNs，侧面偏背神经元LNd、侧面偏腹小神经元sLNvs、侧面偏腹大神经元lLNvs。其中lLNvs神经元全部含PDF神经肽，而5个sLNvs中4个含PDF（Nitabach and Taghert，2008）。PDF在生物钟也起重要作用（Renn et al., 1999）。这些细胞的功能也不一样，含PDF的sLNvs细胞为控制果蝇早上活动的早晨细胞，而LNd和不含PDF的sLNvs细胞为控制果蝇傍晚活动的傍晚细胞。
人的主钟SCN含约5万个细胞，小鼠SCN含约两万个细胞。哺乳动物主钟内部也有分工和协调。SCN的神经细胞分离的状态下，分别有节律但不同步，而它们在一起时节律同步，有神经肽等分子参与，有神经网络。
14.15 人的生物钟相关基因
科学较晚理解人的生物钟，而其中遗传和基因分析也起了突破性的作用。
用8753对成年双胞胎的研究表明：人的昼夜节律有很强的遗传性（Koskenvuo et al., 2007）。
1999年，通过人类遗传学分析发现三家生物钟节律加快的家系，称为（家族性睡眠相位提前综合征，FASPS），表现为常染色体显性遗传（Jones et al., 1999）。2001年，当时在Utah大学的Ptáček和Fu两个实验室合作发现，人的Per2基因（hPer2）与人的生物钟相关。他们研究的一家FASPS，每天早上4点半醒，晚上7点半睡，相位比一般人提前4小时。Ptáček和Fu的遗传分析发现，该家系成员凡有hPer2编码的特定位点变化者发生相位提前，凡这个位点正常者无相位提前问题（Toh et al., 2001）。基因变化对应于蛋白质序列的662位氨基酸，正常是丝氨酸（简称S）。因为S可以被磷酸化，他们当时以为S662是由CKId所磷酸化（Toh et al., 2001）。2005年在Ptáček和Fu实验室工作的徐璎发现CKId基因突变也能在人和小鼠导致相位提前（Xu et al., 2005）。
还有其他基因参与人的生物钟（He et al., 2009）。杨迈克实验室于2017年发现人的Cry1基因突变可以导致生物钟相位推迟（晚睡晚起）（Patke et al., 2017）。
14.16 结语
生物钟遗传研究确实有运气，但也有勇气。
运气，外在而缥缈；勇气，内生而实在。在用遗传学研究生物钟的过程中，事先难以预料能否取得突破，事后分析发现勇气足以成功、而运气是锦上添花，虽然花开的特别灿烂。生物钟的研究有几次看上去非常有运气，但仔细分析发现勇气更重要。在看不清前途时默默探索，在一个小领域内长期耕耘；遇困难出差错恐在所难免，碰运气获机遇也时有所得。粗看似乎运气重要，细看可见勇气更重要：勇于做前人没做过、旁人没想过、伟人不相信的工作。
Konopka和Benzer从两千一百多品系果蝇中筛到三只突变果蝇，竟然是同一个基因的三个影响完全不一样的突变。遗传学研究的历史上可能只有这一次，生物学历史可能也只有这一次。如果没有这样的突变，可能还有些人会比较犹豫生物钟能否用遗传学进行研究，因当时很容易设想一些在果蝇生物钟筛选方法中有表型，但不一定反映生物钟核心机构的基因。表型能否可靠并直接地帮助遗传学家研究核心问题，是非常重要的问题。果蝇生物钟的表型，几十年后的今天看来非常可靠，但当初并不清楚。正如今天问：从果蝇检测的睡眠，是否真是睡眠？很多人，包括研究果蝇的科学家，今天也不敢清晰地回答这一问题。
高桥实验室在老鼠的筛选过程中，第25只老鼠就是影响生物钟的突变，也有很大的运气。如果没这样的运气，就要花很多的时间，很多研究，缺乏资源就难以支撑足够力量。一般人预计成本后就不敢做这样的研究。具有讽刺意味的是，后来高桥得到很大经费专门筛选小鼠，却很不成功，钱的作用有时很奇怪。
我们可以事后诸葛亮，总结多个实验以后而意识到：实际上只要做足够的筛选，例如筛两万只果蝇，一定能找到生物钟的突变。虽难以得到一个基因的三种不同方向的突变，但同样可能带来突破。多次筛选果蝇生物钟突变种，只有两次比较倒霉，一次是重复发现以前的基因、一次搞错了，其他每次筛选都找到基因，而且是新基因。
高桥实验室用老鼠筛选生物钟突变基因，也有运气。但事后看来，筛选超过几千只就应该能得到影响生物钟的基因。而几千只老鼠的经费，并非只有高桥实验室才有。对这一经验的总结并非徒劳，原在美国西南医学中心、现在日本筑波国际睡眠医学研究所的Masashi Yanagisawa及其团队，就用较大经费专门筛选小鼠睡眠的突变种，找到影响小鼠睡眠的基因（Funato et al., 2016）。
Konopka在研究过程中遇到了生物学史上空前绝后的运气，但个人际遇却相当不好。他毕业后到斯坦福大学做过短暂博士后，1974年回加州理工任助理教授，但评终身教授时未通过。他到Clarkson大学任教，再次未获终身教授，1990年回到加州辅导高中生，2015年因心脏病去世（Rosbash，2015）。
而高桥在第一次成功地筛选到Clock之后，获得很多经费支持进行大规模筛选，却未获进一步突破。居然在筛选小鼠生物钟的突变这一实验，出现经费投入量与工作成就的负相关。高桥在生物钟方面还有筛选之外的其他研究。
今天，有关生物钟的重要问题并未全部解决。
主钟细胞内的基因恐怕没有穷尽，而是还有。已发现的参与生物钟的基因，其机理并非完全清晰。主钟的细胞间如何相互作用?已知SCN的几万个细胞在一起的时候是同步的，而它们分开后继续有节律、但不同步。神经肽参与其同步，是否还有其他机理? 只是神经细胞参与生物钟，还是有神经胶质细胞参与（Brancaccio et al., 2017；Tso et al., 2017）? 环路如何构建? 中枢主钟如何调节外周钟。生物钟与代谢、代谢疾病的关系及其机理，也没有完全理解（Turek et al., 2005；Lamia et al., 2008; Marcheva et al., 2010；Robles, Humphrey and Mann，2017）。了解参与生物钟蛋白质，能否构建很好的数学模型，在定性的基础上迈进定量的时代? 非24小时的其他节律，它们的机理是什么?
现代社会对于调节时差有较大需求。各种值班导致欧美近六分之一的上班族需要调时差，而且人类跨时区旅行量每年数以亿计，老年人睡眠问题相当部分是生物钟异常所致，所以调节时差对于工作效率和生活质量都很重要。但生物钟研究迄今没拿出调节时差的药物。
理论上与生物钟相关的问题中最重要的，是睡眠。理解生物钟可以解释睡眠的相位（何时睡），但不能解释睡眠本身。睡眠的机理目前理解很少。教科书中睡眠的内容相当大部分是脑电图的描绘，是现象的描述不是机理的理解。睡眠研究任重道远。Orexin及其受体的研究曾被认为是突破，但带来的进展有限。而2016年柳沢正史（Masashi Yanagisawa）及其合作者发现的Sik3基因，是否是睡眠分子机理的关键突破，尚有待观察。
注1：巴甫洛夫因研究消化系统而获1904年诺贝尔生理或医学奖。Lorenz、von Frisch和 Tinbergen获1973年诺贝尔生理学或医学奖。Hartwell因为用遗传筛选调节细胞周期的基因获2001年诺贝尔生理学或医学奖。Max Delbrück因为研究噬菌体获1969年诺贝尔生理学或医学奖。
注2：John Watson的研究有争议，从一例先天智力障碍的患者得出结论能否推广，另有伦理问题（用小孩做干涉性实验如何消除对小孩的不良影响）。
注3：虽然只有动物有视觉，但动物和植物（以及有些细菌）都有感光系统，而动物植物分别用一些分子感光，但只有Cry蛋白质是动植物都用于感光的分子。这本来也是研究Cry是否参与昼夜节律的一个原因，但奇怪的是，后来的实验表明参与昼夜节律的Cry并不能感光，现在Cry的作用机理不明。
注4：Benzer逝世于2007年，Konopka逝世于2015年。杨迈克、霍尔和罗斯巴希获2017年诺贝尔生理学或医学奖。
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