近年来火热的CRISPR基因编辑系统打开了人类研究和操纵基因的“潘多拉魔盒”，让人类从此踏上了神奇的更高效率的基因编辑之旅，2020年，在这一领域做出卓越贡献的Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授摘得诺贝尔化学奖。那么CRISPR到底是什么呢？
图 1  2020年度诺贝尔化学奖得主
（图片来源：参考资料[1]）
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CRISPR的诞生
CRISPR基因编辑系统的飞速发展离不开众多先驱，其中来自西班牙阿利坎特大学的微生物学家Francisco Mojica在古细菌的基因组中，发现存在许多重复的且长度为30个碱基的奇怪的“回文”片段。
此外在两段重复之间，则是长约36个碱基的间隔。
Mojica最早将这种具有规律性的重复命名为规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered RegularlyInter-Spaced Palindromic Repeats），它的首字母缩略词便是大名鼎鼎的CRISPR。
此外CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated）的简称Cas，与CRISPR共同组成我们熟知的CRIPSR/Cas系统。
CRISPR/Cas系统是很多细菌与大部分古生细菌的一种天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而实现对自身的保护。
某些细菌在遭到病毒入侵后，能够把病毒基因的一小段存储到自身的 DNA里，被称之为CRISPR的存储空间。
当病毒二次入侵时，细菌能够凭借CRIPSR系统里存写的片段来识别病毒，将病毒的DNA切断，沉默外源基因的表达，从而抵抗病毒的干扰。
CRISPR/Cas这项技术自被发掘以来，其精确的靶向功能使之被开发成一种高效的基因编辑工具，成为了生物科学领域最炙手可热的研究工具。
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CRISPR/Cas系统的基本结构
图4 CRISPR/Cas系统基因组中的CRISPR位点
（图片来源：参考资料[3]）
CRISPR/Cas系统的基本结构由四部分组成，如图4所示：
（1）Cas基因
Cas基因编码Cas相关蛋白质，是一种双链DNA核酸酶，能在向导RNA（guide RNA, gRNA）引导下对靶位点进行切割，是一类较大的多态性家族，编码的蛋白具有核酸相关的功能域。
（2）CRISPR array
这个部分中包含了重复序列（Repeat）和间隔序列（Spacer）。不连续的重复序列与长度相似的间隔序列间隔排列而成的CRISPR簇（CRISPR array）。这个间隔序列是由Cas系统识别外来基因后存储下来的序列，当有着与系统里储存序列相同基因的病毒入侵时，免疫系统就会被启动；
（3）前导序列（Leader）
前导序列（Leader）作为启动子，启动CRISPR簇转录为非编码RNA（Pre-crRNA）；
（4）反式激活RNA (trans-activating crRNA, tracrRNA)
重复序列区转录为反式激活RNA，非编码RNA（Pre-crRNA）和反式激活RNA（tracrRNA）通过碱基配对作用结合，酶加工后与Cas蛋白形成复合物。
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CRISPR/Cas系统的进化分类
2011年和2015年，《自然评论微生物学》报道了CRISPR/Cas系统的分类方法，基于CRISPR/Cas系统的基因组成和位点结构，结合其与保守Cas蛋白(如Cas1)的序列相似性以及系统发育信息，将CRISPR/Cas系统主要划分为两类，这两类在涉及crRNA处理和干扰的效应模块的架构方面存在根本差异。
图 2 第Ⅰ类和第Ⅱ类CRISPR/Cas基因座的一般组织
（图片来源：参考资料[2]）
如图2所示，Ⅰ类CRISPR/Cas系统具有由多个Cas蛋白组成的效应模块，这些效应模块形成crRNA结合复合体(如I类系统中的级联复合体)，共同作用于靶蛋白的结合和加工。
Ⅱ类系统有一个单一的、多结构域的crRNA结合蛋白(如II类系统中的Cas9)，其功能类似于第Ⅰ类的整个效应复合体。
在第一类CRISPR/Cas系统中，根据类型和亚型的不同组合，效应子模块由多个Cas蛋白组成，即Cas3(有时与Cas2融合)、Cas5、Cas8、Cas10和Cas11。
相比之下，在第Ⅱ类系统中，效应器模块由单个大蛋白Cas9、Cas12或Cas13表示。
更精细地，CRISPR/Cas系统被分为6种类型(I型-VI型)，图3展示了六类CRISPR/Cas系统的遗传组织、结构组织和功能组织之间的典型关系。
其中II-A型(CRISPR/cas9)、V-A型(CRISPR/cas12a或Cpf1和CRISPR/cas12b或C2c1)是研究最广泛的类型。
图 3 CRISPR/Cas系统的功能模块
（图片来源：参考资料[2]）
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CRISPR/Cas系统的作用机制
图5 CRISPR/Cas系统作用的三个阶段
（图片来源：参考资料[4]）
CRISPR/Cas系统的作用分为三个阶段：适应（adaptation）、表达（expression）和干扰（interference），如图5所示。
（1）Adaptation：spacer的产生
当噬菌体或外源基因侵入到细菌体内后, CRISPR/Cas系统识别入侵的核酸和扫描外源DNA潜在的PAM(Protospacer adjacent motif)序列，其基因组中的protospacer会被CRISPR/Cas系统中的cas相关基因进行识别而剪切，并插入到leader序列和相邻的repeat的中间形成新的spacer，从而使细菌拥有“记忆”。
这样, 下次同样的外源基因入侵时, 就可以对其基因组进行剪切了。
（2）Expression：CRISPR序列的加工
在表达阶段，包含间隔序列的CRISPR Array会被转录为前体RNA序列(Pre-crRNA)，之后被Cas蛋白剪切成更小的crRNA，即成熟的crRNA，包含1个间隔序列和部分重复序列。
以II型系统为例，反式编码的小RNA ( tracrRNA)与crRNA的重复片段配对，形成一种双链的RNA结构，再与Cas9蛋白组成具有DNA内切酶活性的复合物。
（3）Interference：干扰入侵核酸
在干扰步骤中，入侵的核酸被裂解。
在I型系统中，crRNA引导级联复合物到达含有互补DNA的靶点，Cas3亚基可能负责切割入侵的DNA；
在II型系统中，首先RNA/Cas9复合体沿外源入侵DNA进行扫描，当识别到PAM序列且DNA序列可与crRNA互补配对形成一个R环时，Cas9蛋白将分别利用HNH和RuvC结构域对DNA的互补链与非互补链进行切割，从而形成DNA的双链断裂；
在III型系统中，一个染色体CRISPR位点和一个入侵的DNA片段通过与5个重复片段的碱基配对来区分，其中Cas6蛋白起重要作用。
随着基因编辑技术的快速发展和进步，CRISPR系统已成为各个领域中功能强大、效率高的基因编辑工具。
针不戳😏，一起看到这里啦！那你对CRISPR/Cas系统的初印象如何呢？有没有想和我们一起深挖细究的崽崽，那请继续关注我们吧😝！
附表1 中英文缩略词表
参考文献
[1] The Nobel Prize in Chemistry 2020, Retrieved October 7, 2020, from https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/.
[2] Makarova Kira S,Wolf Yuri I,Iranzo Jaime et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants.[J] .Nat Rev Microbiol, 2020, 18: 67-83.
[3] Chaudhuri Abira,Halder Koushik,Datta Asis,Classification of CRISPR/Cas system and its application in tomato breeding.[J] .Theor Appl Genet, 2022, 135: 367-387.
[4] Makarova Kira S,Haft Daniel H,Barrangou Rodolphe et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems.[J] .Nat Rev Microbiol, 2011, 9: 467-77.
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END
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撰文丨lucky
审核丨小Q老师
责编丨小张老师
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