70分SCI解密肿瘤免疫微环境套路！二十分钟教你彻底搞懂！今年国自然用的上！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇发表在《Nature Medicine》上的文章，题目是“Dectin 1 activation on macrophages by galectin 9 promotes pancreatic carcinoma and peritumoral immune tolerance”，这本Nature子刊影响因子近年来也呈上涨趋势，最新影响因子：53.44。本篇范文的科学假设是巨噬细胞中的Dectin-1连接驱动其在PDA中的免疫抑制细胞分化，从而控制TME中的耐受性T细胞程序，从而促进肿瘤的发生进展。那么，我们今天就来看看如何设计一篇完整的肿瘤微环境相关的研究吧~

期刊简介

知识背景

本篇范文研究的科学问题主要围绕胰腺导管腺癌(PDA)是肿瘤微环境(TME)内的特异性先天免疫亚群及适应性免疫效应细胞这一热门研究方向。很多研究都有报道在没有伴随炎症的情况下，单独的致癌突变不足以形成肿瘤。先天性免疫和适应性免疫协同促进肿瘤进展。特别是，使其成为肿瘤允许表型。本文研究的重点就放在了抗原提呈细胞(Antigen presenting cell, APC)群体，包括M2极化的肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)和髓系树突状细胞(myeloid dendritic cells, DC)，诱导产生免疫抑制Th2细胞，有利于保护肿瘤的Th1细胞。然而，单核细胞向免疫抑制表型分化的驱动因素仍不确定。

接下来，作者引出本文的主变量——Dectin-1。这是一个模式识别受体c型凝集素家族的成员，在巨噬细胞和其他髓系单核细胞的表面表达。Dectin-1是先天免疫系统识别来自真菌细胞壁的β -葡聚糖多糖能力的关键组成部分。可以与β-葡聚糖的连接可招募CARD9接合蛋白，使Syk磷酸化，从而启动抗真菌免疫反应。作者前期研究表明，慢性炎症损伤可上调肝脏中Dectin-1的表达。并且作者还发现在PDA中，TME与炎症和坏死细胞死亡相关的分子模式(DAMPs)普遍存在。然而，与通过DAMPs3连接而影响肿瘤发生进程的toll样受体不同，Dectin-1在非病原体介导的炎症或肿瘤发生中的作用尚未明确，而且无菌的Dectin-1配体也未被确定。

基于此，作者做出科学假设，巨噬细胞中的Dectin-1连接驱动其在PDA中的免疫抑制细胞分化，从而控制TME中的耐受性T细胞程序，从而促进肿瘤的发生进展。由此展开了一系列的相关实验，作者接下来系统的学习！

总体概览

作者从胰腺癌的免疫抑制炎症与致癌突变的协同作用引出临床问题。从主变量免疫受体Dectin-1其在无菌炎症和肿瘤发生中的作用出发，分析肿瘤内免疫耐受的驱动因素。作者前期发现，在胰管腺癌(PDA)中，巨噬细胞高度表达Dectin-1。Dectin-1的连接加速了PDA，而Dectin-1的缺失或阻断其下游信号则具有保护作用。PDA的肿瘤微环境中，Dectin-1连接凝集素Galectin-9则导致耐受原性巨噬细胞编程和适应性免疫抑制。当Dectin-1 - Galectin-9轴被打断后，CD4+和CD8+ T细胞——在宿主体内PDA进程中是必不可少的，具有完整的信号轴——被重新编程为必不可少的抗肿瘤免疫介质。总体的研究结果表明，靶向Dectin-1信号是PDA免疫治疗的一个有吸引力的策略。

数据精析

一、表达差异

Dectin-1在小鼠和人PDA中的高表达

图1

为了检测Dectin-1信号与胰管腺癌(PDA)的相关性，作者在两个PDA小鼠模型中检测了Dectin-1的表达。免疫组化分析显示，作者这里选择了KC小鼠的胰腺和转化上皮细胞的白细胞，发现Dectin-1均有表达升高(图1a)。流式细胞分选结果显示，KC TME中巨噬细胞(46%)、中性粒细胞和炎症单核细胞(80%)和DC(65%)中Dectin-1的表达比脾脏中的细胞(分别为18%、47%和40%)高约2倍(图1b)。同样，在原位植入的KPC肿瘤中，Dectin-1在白细胞和恶性上皮细胞上高表达(图1c)。与正常胰腺(9%)相比，在PDA的白细胞中Dectin-1的表达也更高(44%)(图1d)。作者还增补了免疫荧光检测，同样显示人PDA在转化的上皮细胞和肿瘤浸润的髓系细胞中也有较高的Dectin-1表达(图S1f-g)。人PDA浸润的CD14+和CD15+单核细胞、巨噬细胞和CD11c+ DC与外周血单个核细胞(PBMC)中的细胞相比，表达更高的Dectin-1(图1e)。

为了研究PDA中白细胞Dectin-1表达上调的刺激，作者还将骨髓源性巨噬细胞(BMDM)与来自KPC小鼠的胰腺肿瘤细胞共培养。这也是后期的补充实验。发现PDA细胞及PDA细胞上清上调了BMDM中Dectin-1的表达;然而，与PDA相关的细胞因子不影响Dectin-1的表达(图S1h)。总的来说，这些结果表明在PDA的肿瘤和肿瘤周围炎症室中Dectin-1表达上调。

Dectin-1及其配体的交互作用

图S2

为了研究Dectin-1信号在胰腺肿瘤发生中的相关性，作者检测了WT和KC胰腺中Dectin-1连接下游激活信号中间物的存在。作者发现，与年龄匹配的WT胰腺相比，KC胰腺表达了较高的p-Syk和p-PLCγ，以及较高的CARD9和JNK通路激活的证据(图S2a)。IHC证实KC胰腺中p-Syk高表达，而在Dectin-1缺失的背景下，PDA中Syk信号通路减少(图S2b)。与脾脏相比，在PDA中流式细胞分选的不同骨髓细胞亚群中p-Syk表达升高(图S2c)。为了研究胰腺TME中Dectin-1配体的存在，作者使用了一个人IgG fc偶联的Dectin-1融合蛋白。虽然WT胰腺中没有Dectin-1配体，但Western blotting(图S2a)和免疫荧光显微镜(图S2d)发现KC小鼠胰腺中存在高水平的Dectin-1配体。与脾脏白细胞无表达相比，在KC胰腺肿瘤浸润巨噬细胞和DC上表达了Dectin-1配体(图S2e)。Dectin-1配体的表达在apc浸润原位KPC肿瘤中也同样升高(图S2f)。此外，CD133+转化的KC上皮细胞(图S2g)和KPC肿瘤细胞(图S2h)在体内表达Dectin-1配体，KPC肿瘤细胞在培养液中也表达Dectin-1配体(图S2i)。由此说明在PDA的上皮和炎症室中，Dectin-1受体和Dectin-1配体的高表达，其相关信号传导中间体同时上调。

二、主变量介导表型

Dectin-1促胰腺肿瘤进展

由于Dectin-1及其同源配体在PDA中高度表达，作者推测Dectin-1信号通路可能促进免疫抑制性炎症的发生，从而加速肿瘤的发生。作者用Dectin-1特异性激动剂耗尽的Zymosan (d-Zymosan)或热死白色念珠菌(HKCA)作用于6周大的KC小鼠，显著加速了肿瘤的发生。Dectin-1激动剂能够Rescue这一现象，同时也进行了体内验证 (图1f-j)。

Dectin-1信号通路促肿瘤进展的Rescue机制验证

图2

为了确定Dectin-1信号通路是否需要胰腺肿瘤发生的正常进程，作者研究了Dectin-1缺失是否可以延缓KC小鼠恶性表型进展。与KC对照组相比，年龄匹配的KC组胰腺表现出胰腺发育不良和纤维化的延迟发展(图2a)和生存延长(图2b)。

此外，作者分析了组间细胞周期调节、致癌和肿瘤抑制基因 (图2c)。总体数据表明，在驱动Kras突变的背景下，Dectin-1有助于胰腺肿瘤的正常进展。

下游分子介导表型

由于Dectin-1通过Syk磷酸化来传递信号，作者假设Syk的封锁可能对胰腺的肿瘤发生具有保护作用。p-Syk抑制剂作用后，结果证实Piceatannol可以在PDA体内阻止Syk的激活。Syk的抑制回复的恶性表型 (图2e)。

作者推测，在基质中阻断Dectin-1信号可以通过增强抗肿瘤免疫来保护PDA。具体来说，作者假设Dectin-1缺失导致巨噬细胞的免疫原性重编程，从而逆转PDA浸润T细胞的免疫抑制表型。为了在体外测试这一点，作者使用CD3/CD28联合连接刺激naïve CD4+和CD8+ T细胞，并测量ICOS、CD44、IFN-γ和TNF-α的表达，它们在活化的T细胞上上调，CD62L和IL-10的表达在T细胞激活时下调。从kpc衍生肿瘤中获得的Dectin-1+/+或Dectin-1 - / - CD11b+细胞被添加到选择的孔中。而肿瘤浸润的WT髓系细胞则抑制了ICOS的上调。

三、表型嵌套分析

Dectin-1缺失诱导肿瘤浸润巨噬细胞的免疫原性重编程

图3

基于以上数据，作者推测在基质中阻断Dectin-1信号可以通过增强抗肿瘤免疫来保护PDA。于是，作者假设Dectin-1缺失导致巨噬细胞的免疫原性重编程，从而逆转PDA浸润T细胞的免疫抑制表型。为了在体外验证，作者使用CD3/CD28联合连接刺激naïve CD4+和CD8+ T细胞，并测量ICOS、CD44、IFN-γ和TNF-α的表达，它们在活化的T细胞上上调，CD62L和IL-10的表达在T细胞激活时下调。而肿瘤浸润的髓系细胞则抑制了ICOS的上调 (图3a-f)。

图4

并且，作者证实外源Dectin-1配体使用d-Zymosan能够激活PDA TME中的Syk信号通路(图4h)。相应地体内验证也做了全套 (图4i-j);但MHC II的表达没有明显改变(图4k-l)。

Dectin-1信号通路抑制PDA中的T细胞免疫原性

图5

为了进一步验证巨噬细胞表型和过继转移实验以及体外共培养数据，作者假设PDA中Dectin-1缺失导致的TAMs重编程导致肿瘤携带T细胞的免疫原性增强。作者研究了KC vs KC、Dectin-1−/−小鼠胰腺引流淋巴结的T细胞表型，以及WT vs Dectin-1−/−宿主原位KPC肿瘤的T细胞表型。发现KC小鼠中Dectin-1缺失导致致肿瘤CD4+和CD8+ T细胞免疫原性重编程，CD44、OX40和PD-1表达上调，表明细胞激活(图5a- d)。同样，在原位KPC肿瘤中，Dectin-1缺失增加了肿瘤浸润T细胞的CD8:CD4比值(图5e)。

此外，在Dectin-1−/−宿主的KPC肿瘤中，CD8+ T细胞表现出被激活的表型，高表达PD-1、T-bet、TNF-α、CD107a等，表明与野生型宿主中的KPC肿瘤相比，细胞毒性潜能增强(图5f)。浸润的CD4 + T细胞在Dectin-1−−/宿主表达CD44, CD107a,和ICOS, Th1极化增强，T-bet和TNF-α表达上调(图5g)。总体数据表明T细胞免疫原性增强。

并且相一致的是，Dectin-1缺失+ PD-1阻断联合倾向于提供协同保护并进一步增强肿瘤内Th1极化，而在没有Dectin-1缺失的情况下PD-1阻断没有效果(图5h-i)。

四、下游机制分析

Galectin-9在PDA中连接Dectin-1

由于非病原体来源的Dectin-1配体尚未被很好地表征。作者使用IgG fc偶联的Dectin-1融合蛋白与蛋白G珠偶联，进行亲和纯化-质谱分析。作者检测了小鼠PDA TME中Galectin-9的存在，并通过流式细胞术发现Galectin-9在多种PDA浸润的髓系细胞和癌细胞中强劲表达(图6a-b)。作者还发现，在人PDA的白细胞和肿瘤细胞中，Galectin-9均有适度表达，而在PBMC的白细胞中，Galectin-9表达量最低(图6c)。通过共聚焦显微镜，作者进一步证实Galectin-9在pd浸润的白细胞(13%)和癌细胞(7%)中的表达(图6d, e)。

为了进一步研究Dectin-1是否连接Galectin-9，用重组Galectin-9孵育珠igg Fc复合物，以荧光标记的αGalectin-9单抗标记分析。发现fc偶联的Dectin-1融合蛋白与Galectin-9紧密结合，而对照组则未能诱导出阳性信号，Galectin-9作用于Dectin-1可能被Dectin-1配体竞争性抑制(图6f)。ELISA证据表明Galectin-9也以剂量依赖的方式结合Dectin-1(图6g-h)。相比之下，小鼠Dectin-1不与Galectin-3或Galectin-4结合(图6i)。通过在KC小鼠胰腺组织提取物中沉淀Dectin-1配体，然后探测Galectin-9，作者进一步证实Galectin-9与Dectin-1原位结合。结果表明Dectin-1-Galectin-9能够形成复合物 (图6j)。作者进一步评估了半乳糖凝集素-9是否通过聚糖/半乳糖凝集素-9相互作用与Dectin-1连接。作者这里使用了PNGaseF(一种切割n-链聚糖的酶)预处理Dectin-1，验证交互互作用。但结果表明两者的结合是不依赖于甘聚糖的(图6k)。

为了进一步确定Galectin-9是否是一种功能性Dectin-1配体，作者用重组Galectin-9处理WT和Dectin-1 - / -巨噬细胞，检验Syk的磷酸化水平。发现Galectin-9以依赖Dectin-1的方式激活Syk(图6l)。并且Galectin-9呈剂量依赖性的诱导NF-κB信号通路 (图6m)。

全文总结

最后总结一下研究思路，作者前期发现Dectin-1信号转导通过抑制TLR4介导肝癌的发展，而TLR4导致肝纤维化并增加肝癌发生的相关风险。结合其他研究者报道肿瘤细胞对Dectin-1的识别介导IRF5转录因子的激活在NK细胞杀伤肿瘤活性是必需的。并且前期发现Dectin-1在PDA中对巨噬细胞的表型具有重要的调节作用，这决定了肿瘤周围T细胞的免疫原性或耐受性。于是建立科学假说：靶向Dectin-1可能是PDA免疫治疗的一种有吸引力的策略。并且作者的数据表明除了肿瘤周围巨噬细胞和髓系细胞上表达Dectin-1外，PDA细胞也表达Dectin-1。

通过巨噬细胞过继转移实验，除了阐明Dectin-1信号在巨噬细胞中调节转化胰腺中的T细胞可塑性的关键作用外，本研究中最重要的观察结果之一是发现Galectin-9是Dectin-1的功能配体。且Galectin-9发挥了特异性于Dectin-1信号通路的主要免疫抑制作用。作者的数据也表明，类似于Dectin-1, Galectin-9将是PDA免疫治疗的一个有吸引力的目标。

临床意义在本片范文也有涉及，免疫治疗后的复发也与肿瘤耗竭配体表达上调有关。随后生存实验表明Dectin-1或Galectin-9靶向免疫治疗需要额外的治疗才能实现治愈。且靶向Dectin-1或Galectin-9 + PD-1的联合免疫治疗方案可能具有协同疗效。Dectin-1/ Galectin-9封锁增强T细胞激活，PD-1封锁通过检查点受体连接防止衰竭。因此，靶向Dectin-1信号的治疗方法的发展将可能使人类PDA的免疫治疗选择成为可能。

好了，这篇30分+的高分文献就解读到这里了，后台回复“0128”获取范文一起学习吧，下期再见了，拜拜！

参考文献

[1] Daley D, Mani VR, Mohan N, Akkad N, Ochi A, Heindel DW, Lee KB, Zambirinis CP, Pandian GSB, Savadkar S, Torres-Hernandez A, Nayak S, Wang D, Hundeyin M, Diskin B, Aykut B, Werba G, Barilla RM, Rodriguez R, Chang S, Gardner L, Mahal LK, Ueberheide B, Miller G. Dectin 1 activation on macrophages by galectin 9 promotes pancreatic carcinoma and peritumoral immune tolerance. Nat Med. 2017 May;23(5):556-567. doi: 10.1038/nm.4314. Epub 2017 Apr 10. Erratum in: Nat Med. 2021 Dec;27(12):2247-2248. PMID: 28394331; PMCID: PMC5419876.

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