新思路！13分干湿结合套路，看老瓶如何装新酒！

领略高端套路，发表高分文章！

小伙伴们大家好，我是菠小萝。今天为大家带来的是一篇发表在《Genome Medicine》上的文章，题目是“Targeting CDC7 potentiates ATR-CHK1 signaling inhibition through induction of DNA replication stress in liver cancer”。范文通过TCGA数据库的生物信息学分析，联合CRISPR技术验证基因表达差异，确定了肝癌的潜在治疗靶点，是一篇“干湿结合”的生信文章。大家今天就一起来学习一下这个看似普通的生信思路是如何成为一篇出色的高分文章吧~感谢作者的团队为我们提供学习典范！

期刊简介

结构框架

文章使用Cancer Dependency Map和TCGA数据库进行整合生物信息学分析，确定ATR-CHK1信号通路作为肝癌的治疗靶点。对于抗ATR或CHK1抑制的肝癌细胞，使用CDC7抑制剂治疗可诱导DNA复制应激，因此这些药物与ATR或CHK1抑制剂表现出显著的协同作用。并推测ATR-CHK1抑制和CDC7抑制之间的协同作用可能源于有丝分裂异常引起的有丝分裂突变。

范文中作者采用3个临床队列进行临床分析，包括CHCC数据库数据信息，以及TCGA-LIHC和GSE14520数据集。研究结果确定了在无论是否联合CDC7抑制剂的情况下，靶向ATR-CHK1信号通路治疗肝癌的潜力。证实ATR和CHK1抑制剂可以增强基因毒性化疗的疗效，就如同阿霉素、伊立替康和吉西他滨这类DNA损伤诱导药物。文章还涉及到细胞分裂周期7 (CDC7)蛋白，在HCC肿瘤组织中该基因是表达上调的，提示其可作为肝癌潜在的治疗靶点。

数据精析

一、TCGA数据库的靶点分析

ATR和CHK1是肝癌潜在的治疗靶点

图1

作者首先通过GSEA基因集富集分析TCGA队列的肿瘤与配对非肿瘤组织相比，FANCONI通路和重组修复基因集在HCC组织中富集(图1a)。Venn图展示了人类DNA修复基因(n= 220)和肝癌DEGs的交集部分(图1b)。在这37个重叠基因中，发现4个靶向性基因和10个非靶向性基因，这些基因在HCC组织中相对于TCGA队列中的配对非肿瘤组织表达上调(图1c)。

ATR和CHEK1是DDR过程的两个主要调控因子，作者用慢病毒引导RNA (gRNA)文库进行了CRISPR-Cas9基因筛查，获取MHCC97H肝癌必需激酶(Fig.1d-f)在慢病毒感染MHCC97H细胞中，ATR和CHEK1被鉴定为高可信度的致死基因。基于TCGA数据库队列中的生存曲线显示，在TCGA数据库队列中，ATR和CHEK1的高表达与HCC患者预后不良相关(Fig.1g-h)。

ATR和CHK1抑制剂对肝癌细胞的影响

图2

接下来，我们测试了ATR抑制剂AZD6738和CHK1抑制剂MK-8776对肝癌细胞的作用，肝癌细胞株可分为对ATR或CHK1抑制剂敏感(Huh7、HepG2、MHCC97H和SNU398)或耐药(Huh6、PLC/PRF/5和SNU449)。发现AZD6738和MK-8776在肝癌细胞上的活性在功能上非常相似(图2a)。

凋亡实验表明，ATR或CHK1抑制可诱导敏感细胞(Huh7和MHCC97H)凋亡，但在耐药细胞系(SNU449和PLC/PRF/5)中则没有诱导凋亡(图2d)。为了进一步研究AZD6738或MK8776在敏感细胞系中的选择性效应，我们评估了AZD6738或MK-8776处理后DNA损伤标记——γ h2ax的表达水平变化。经AZD6738或MK-8776处理后，两种敏感肝癌细胞的γ h2ax水平明显高于耐药肝癌细胞(SNU449和PLC/PRF/5)(图2e-f)。

此外，作者基于atr / chek1表达与AZD6738药物反应的相关性分析两者的表达与AZD6738对ATR抑制的敏感性有关。由此说明使用单个靶基因来预测相应抑制剂的药物反应可能不是最合适的选择。总之，这些发现表明ATR和CHK1可能是肝癌潜在的治疗靶点。

二、机制炎症

抑制CDC7可诱导肝癌细胞的复制应激

图3

然而，耐药细胞仍然需要有效的药物反应生物标志物和强大的药物联合策略。为了发现ATR和CHK1抑制剂反应的潜在生物标志物，我们利用GDSC和PRISM数据库中的基因表达和药物反应数据进行了综合生物信息学分析。基于37个复制应激相关基因的ssGSEA方法评估了复制应激信号的丰度与ATR抑制剂AZD6738的敏感性显著相关(图3a)。

Western blot分析表明，与耐ATR或CHK1抑制剂的3个细胞株相比，4个敏感肝癌细胞株的γ h2ax基础水平明显更高(图3b)。XL413处理后的PLC/PRF/5细胞的rna测序数据显示，与DNA复制应激相关的一组基因富集(GSE183751，图3c)。为了评估CDC7抑制剂对起源激活和复制叉速度的影响，我们进行了DNA纤维测定。与对照组相比，CDC7抑制剂——XL413治疗增加了DNA复制叉的进展，可能是作为起源激活减少的一种补偿(图3d-f)。并且，Western blot分析显示在浓度为5μM到1 0μM时XL413下游靶点p-MCM2受到强烈抑制(图3g)。且ATR和CHK1发生磷酸化，表明CDC7抑制时ATR-CHK1信号通路被激活(图3h)，进一步表明CDC7抑制剂治疗后ATR-CHK1信号通路对细胞生存的潜在依赖性。

随后，作者在培养基中加入caspase抑制剂Z-VAD-FMK，以排除与凋亡相关的γH2AX。观察到DNA的协同诱导γ h2ax的免疫印迹显示CDC7和ATR-CHK1抑制对两种细胞系的损伤(图3i)。这些结果表明，DNA复制应激信号可作为ATR和CHK1抑制剂治疗肝癌药物反应的有效生物标志物，也可用于协同诱导DNA损伤。

CDC7抑制与ATR和CHK1抑制剂在肝癌细胞中具有协同作用

图4

ATR或CHK1抑制剂对于耐药肝癌细胞株的ATR或CHK1抑制作用提示了药物联合治疗对细胞杀伤的合成致死效应 (图4a-c)。凋亡实验也验证了两者具有较强的协同诱导凋亡作用(图4d-e)。

CDC7和ATR-CHK1联合抑制介导HCC细胞周期缺陷

图5

接下来，我们使用活细胞显微镜观察单个细胞的命运，以了解肝癌细胞对药物治疗的细胞周期反应(图5a-b)。与单独使用CDC7抑制剂或ATR-CHK1抑制剂相比，CDC7和ATR-CHK1抑制剂联合处理的PLC/PRF/5和SNU449细胞的有丝分裂时间显著延长(图5c)。此外，联合处理后的细胞在有丝分裂期和间期死亡也明显增加(图5d)。A以上结果提示TR-CHK1抑制和CDC7抑制之间的协同作用可能源于有丝分裂过程中出现的问题(有丝分裂长度增加和染色体分离异常)导致有丝分裂突变。

三、体内实验验证

体内CDC7抑制可使肝癌细胞对AZD6738治疗增敏

图6

接下来是体内验证，对Huh7、MHCC97H和PLC/ PRF/5异种移植。发现AZD6738治疗显著抑制Huh7和MHCC97H异种移植瘤的生长(图6a)。与对照相比，azd6738处理的肿瘤细胞γ h2ax阳性细胞增加，表明ATR抑制可诱导Huh7和MHCC97H异种移植瘤的DNA损伤(图6b)，与体外结果相一致。与单药治疗相比，XL413联合AZD6738治疗显著降低了肿瘤负担(图6c)。通过γ h2ax染色，观察到ATR或CDC7抑制导致肿瘤细胞DNA损伤增加。提示联合治疗可协同诱导肿瘤组织中更强的DNA损伤(图6d)。

四、临床数据验证

HCC患者的潜在分类和治疗策略

临床样本的差异验证也是必要的，作者利用2010年至2014年在中山医院(CHCC队列)行根治性切除的159例原发性HCC患者的成对肿瘤和非肿瘤组织。基于37个复制应激反应相关基因进行K-means聚类，从而将159个肿瘤分为两个具有不同水平复制应激相关基因表达的亚组(图6e)。发现复制应激反应特征富集分数在这两个亚组间也有显著差异，进一步支持了临床样本间复制应激差异的存在(图6e)。

生存分析

生存分析提示复制应激信号基因转录水平较高的患者的肿瘤预后较差 (图6e)，同时通过外部队列GSE14520进行了验证。

接下来是亚组分析复制应激特征与临床特征之间的关系。作者使用CHCC队列数据分析了高复制应激信号与肿瘤血栓、高AFP水平、晚期BCLC和晚期TNM密切相关。根据上述报告的结果，可以设想一种潜在的肝癌治疗策略。具有高复制应激基因特征的患者可以从ATR或CHK1抑制剂的单一治疗中获益，而对于复制应激水平较低的肿瘤患者，可能需要包括CDC7抑制的联合治疗策略。

全文总结

本研究通过整合全基因组CRISPR筛选和临床队列分析的数据，确定了ATR和CHK1为治疗HCC的潜在治疗靶点。ATR-CHK1信号通路是DNA损伤反应(DDR)的关键调控因子。基于此，探索在肝癌的治疗中使用ATR或CHK1抑制剂的意义。结果表明，复制应激水平决定了肝癌细胞对ATR或CHK1抑制剂的敏感性。与这一观点一致的是，发现在CDC7抑制剂存在的情况下，这种复制应激信号也在HCC细胞中丰富，并且CDC7抑制剂对ATR和CHK1抑制敏感。

从机制上讲，作者发现CDC7和ATR或CDC7和CHK1的双重抑制导致有丝分裂和有丝分裂突变时间的增加。复制应激会导致复制叉停止，随后单链DNA积累，进而激活ATR信号通路，导致CHK1激酶磷酸化。作者使用XL413处理并不能完全抑制烧叉。作为补偿，增加的叉前进速度支持少量的活动叉。基于肿瘤组织DNA复制应激水平的潜在分类和治疗策略，ATR和CHK1被确定为潜在的癌症治疗靶点。

从本片范文的学习中，不知道小伙伴有木有体会到科研的奥妙。只要你数据维度广，实验层面做全套，文章的水平自然会提升~所以想要发表高分生信文章，不仅要有实验验证机制，还需要不同维度的数据层次。好了，这篇高分生信文献就解读到这里了，后台回复“0204”获取范文一起学习吧，下期再见了，拜拜！

参考文献

[1] Guo Y, Wang J, Benedict B, Yang C, van Gemert F, Ma X, Gao D, Wang H, Zhang S, Lieftink C, Beijersbergen RL, Te Riele H, Qiao X, Gao Q, Sun C, Qin W, Bernards R, Wang C. Targeting CDC7 potentiates ATR-CHK1 signaling inhibition through induction of DNA replication stress in liver cancer. Genome Med. 2021 Oct 18;13(1):166. doi: 10.1186/s13073-021-00981-0. PMID: 34663432; PMCID: PMC8524847.

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